专利名称：装置和制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用电场处理液体的方法和装置，特别是(但并非排它性地)涉及采用电场雾化(comminuting)相对高导电性的液体制剂如含水制剂的方法和装置。
采用电场处理液体的方法描述于，例如，GB-A-1569707中。在该方法中，它称为电场流体动力学(electrohydrodynamic)方法(本文有时也称之为“EHD”)，从出口流出的液体受到电场的作用使液体在进入自由空间或空气时，该液体中的净电荷可抵消液体的表面张力，而同类电荷所产生的排斥力引起锥形射流(cone and jet)。然后，根据不同液体制剂，该液体射流可如GB-A-1569707中所述被分散成小液滴，或者可以如申请人的WO98/03267(其全部内容通过引用结合于本文中)所述被分散形成固体或胶体样颗粒或可以形成连续纤维，所述可以碎裂成较短的长度(“纤丝”)。为简便起见，本文将电场流体动力学方法获得的产物统称为“电溶胶”。
电场流体动力学方法特别有利于控制所生成的产物的大小并提供了一条将药物或药剂传递到呼吸系统，例如肺系统，以及其它上皮或局部表面例如伤口表面的极为有效的途径，如在WO98/03267中所述。此外，如WO98/03267中所述，电场流体动力学方法可以用于喷雾复合胶体剂，如果该胶体剂起初实际上是液态的话。
与一些常规生产气溶胶的方法不同，电场流体动力学方法能够产生雾状或云状液滴(“气溶胶”)，其中液滴为单分散性的，即它们具有非常均匀的大小并且不需要抛射气体。这使得如申请人的US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377以及WO99/07478中所述的采用电场流体动力学方法的吸入器(它能够传递至少部分释放电荷的液滴)与WO00/35524中所述的采用电场流体动力学方法的吸入器(它能够传递带电的液滴)具有特殊优势，因为没有气体抛射剂使得吸入器易于使用，当吸入时无须从吸入器中定时喷出气体，而且气溶胶的单分散性质与电场流体动力学方法所提供的控制液滴大小的能力相结合，使得药物或其它药剂能够靶向于呼吸系统的特定部位，例如肺的特定区域。US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377、WO99/07478和WO00/35524的全部内容均通过参考结合到本说明书中。
随着对生物种类手术(biological species operate)、兽医和医学治疗途径的认识的增加，越来越多的生物分子或材料如DNA、RNA、蛋白质、肽、激素、脂质、细胞因子等被结合到治疗、处理和预防药物如疫苗中。在本文中所用的术语“生物材料”包括生物学分子，生物学分子片段如DNA片段以及重组生物学分子，包括蛋白质如酶及其它类似大小的生物材料。这些生物材料随其复杂性而变化但是某些，尤其是蛋白质和DNA，对其邻近的环境极为敏感并且容易裂解或变性，这可以降低它们的活性并且甚至将其完全消除。生物材料的传递有时还需要采用等渗或缓冲的液体载体，并且由于这些物质通常生产成本昂贵，释药系统必须尽可能地有效。
喷雾这类液体的常规方法，如喷气或超声雾化法，对载体液体并因此也对其中的生物材料施加较大的剪切力。已知这种数量级的剪切力使敏感的生物材料如DNA或蛋白质变性并且因此没有易于获得的适合即刻采用这些生物材料治疗的释药方法。
上述生物材料的载体液体通常是含水的并且导电性相对较高。遗憾的是，已知EHD难以对导电性液体进行喷雾。大量专利和发表的论文指出所喷雾液体的电阻率必须高于10000Ohm.m。低于此值的液体可以喷雾，但在约100Ohm.m时可能会截止，低于此值的以水作基质的制剂都不会被喷入空气中。这是部分由于水的表面张力较高，约72mN/m(毫牛顿/每米)及部分是由于水的极性特性所致，这使得任何杂质如水溶性药物显著促进液体的导电性。这表明非水溶剂如乙醇适于用于EHD。
此外，EHD雾化法(comminution)采用高压(1KV和更高)直接抵消液体的表面张力而分散液体制剂。采用这样高的电压引起了几个潜在的实际问题，即1)电场可能直接影响、灭活或裂解液体中的敏感物质，如生物材料；2)将大体积液体分散成小液滴时可能会通过超强剪切力而使这些敏感生物材料产生物理变性；3)在喷嘴周围分散的气体可能产生臭氧，它能够与制剂中的任何水分反应生成其自身为强氧化剂的过氧化氢，而它的存在可能导致分子变性。
这些问题已经表明，迄今为止EHD实际上只能应用于较小的、稳定的分子，例如沙丁胺醇和布地缩松，它们在类似乙醇的选择性溶剂中具有良好的溶解性。然而，对于生物材料而言，乙醇不是良好溶剂，因为它会导致沉淀(例如它对于DNA会如此)和变性(例如它对于敏感蛋白会如此)。
在一个方面，本发明提供一种能够使所用的EHD具有高导电性的，通常是含水的液体的方法。
在一个方面，本发明提供一种能够使EHD用于分配(dispense)生物材料如DNA、RNA、蛋白质、肽、激素、脂质、细胞因子及重组生物分子的方法。
在一个方面，本发明提供一种采用EHD处理液体的控制方法，其中液体中挥发性组分在液体经受电场的邻近区域内的蒸气分压受到控制。
在一个方面，本发明提供一种控制电场流体动力学雾化含水液体制剂以产生液滴的方法，其中在液体所流入区域内的空气被干燥或去湿以引起蒸发而减小液滴的大小。这将使所产生的液滴易于供给婴儿甚至很小的哺乳动物，例如小鼠的呼吸系统。
在一个方面，本发明提供一种能够将生物材料及其它敏感分子或化合物如药物传递给人或动物例如小鼠的EHD吸入装置。
在一个方面，本发明提供能够产生含敏感的、以水为基质的分子的可吸入液滴的装置和方法，所述方法优于目前可利用的任何其它方法。
在一个方面，本发明提供电场流体动力学雾化装置，该物质不导致生物材料或敏感分子变性，并因此受益于在控制粒径和电荷下产生雾化。
在一个方面，本发明提供一种喷雾敏感分子或生物材料而不使之变性的方法。
在一个方面，本发明提供一种改进的EHD处理的气溶胶产物的方法，该方法能够保持产物的一致性(不论产物是固体、凝胶或液体)并且通过影响液体的局部蒸发特性而改变液滴的大小。
在一个方面，本发明提供一种在溶液中加入乙醇而不使DNA沉淀的制备DNA的制剂。
在一个方面，本发明提供一种通过EHD喷雾DNA的方法，其中加入一种酸(例如，乙酸)以制备可以在更高浓度下喷雾的含DNA溶液。
在一个方面，本发明提供一种通过EHD喷雾DNA的方法，其中EDTA或过氧化氢酶被加入到待喷雾的液体中以防止DNA降解。
在一个方面，本发明提供一种通过EHD喷雾DNA的方法，其中含水或高表面张力的制剂通过加入增加量的表面活性物质，浓度一般显著高于临界胶团浓度(Critical Micelle Concentration)，可以获得喷雾。
在一个方面，本发明提供一种通过向待喷雾的液体中加入至少一种长链聚合物(例如，PVP、PVA、乙基纤维素)而使含水或导电性高的制剂能够通过EHD喷雾的方法。
在一个方面，本发明提供一种通过向待喷雾的液体中加入聚合物(或者为单一聚合物或组合的聚合物)而使通常形成不稳定喷雾的制剂能够通过EHD喷雾的方法。
在一个方面，本发明提供一种通过向待喷雾的液体制剂中加入表面活性物质和聚合物而提高EHD制剂的可喷雾性(sprayability)的方法。
在一个方面，本发明提供一种通过EHD喷雾生物材料的方法，其中聚合物被加入到待喷雾的含生物材料的液体制剂中。这保护并稳定了液体制剂中敏感的生物材料。
在一个方面，本发明提供一种通过向制剂中加入聚合物而制备任选在极性条件下通过EHD的可喷雾制剂的方法。这使得能够利用US-A-6105877和US-A-5915377中所述的双喷嘴或双出口装置喷雾液体制剂。
在一种实施方案中，所提供的装置和方法能够使含药物和/或生物材料的含水液体被电场流体动力学雾化而产生理想的用于吸入的喷雾体或分散体并传递到体内上皮，包括肺、支气管、喉、口和鼻道，并且还能够有利地用于所有的局部用药。
在此通过实施例，并参照附图，描述本发明的实施方案，其中
图1表示第一实施例的分配(dispensing)装置部分剖面图(part-cross-sectional view)；图2表示第二实施例的分配装置部分剖面图；图3和4分别表示用作口腔和鼻腔吸入器的分配装置实例；图5表示采用具体实施本发明方法获得的液滴频谱图；图6表示DNA凝胶电泳的印迹(trace)图的照片，以比较采用本发明具体方法产生的雾化或碎裂的含DNA液滴喷雾中获得的降解量和采用其它方法产生的雾化或气雾化的含DNA液滴喷雾中获得的降解量。
图7表示DNA凝胶电泳的印迹图的照片，图示说明了当采用本发明具体方法产生雾化或气雾化的含DNA质粒的液滴喷雾时，各种DNA质粒没有降解。
图8和9显示分别说明加入EDTA和过氧化氢酶对过氧化氢降解的影响的图10表示采用本发明具体方法所产生的雾化物实例照片；图11表示采用本发明具体方法所产生的雾化物的另一个实例的照片；图12至14表示传递适于吸入的电溶胶的不同吸入装置的示意流程图；图15表示用于图12所示吸入装置的EHD雾化室和吸气室透视图；图16和17表示适用于吸入装置的空气处理器(air adaptation unit)的不同实例的断面图；图18表示说明在有和无空气处理器下图12所示吸入装置的吸气室内随时间的湿度变化的曲线图；图19和20图解说明了在吸入装置中可用作空气处理器的两种类型的冷阱图；图21表示图1所示的分配装置的一种改进型式的部分剖面示意图；图22表示图2所示的分配装置的一种改进型式的部分剖面示意图；和图23表示的图形表示用不同溶剂孵育后Eagan 4A LPS与rSP-D结合的曲线图。
现在参看图1，这是表示适用于后文详述的本发明具体实施方法中的分配装置1。该装置1具有通常由电绝缘性材料构成的外罩2。外罩2具有出口3并被分隔成第一室和第二室4和5。第二室5有空气入口2a。第一室内含电源6例如电池、用于从电池电压产生高压(千伏级)的高压发生器7和用于贮存要经电场流体动力学处理的液体的贮库8。在此实例中，所述贮库连接着通常绝缘的输液管9，该输液管延伸到第二室5中并在第二室5中有出口10。在重力作用下或通过如US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377、WO99/07478和WO00/35524中任何一个所描述的泵将液体从贮库8输送到输液管9中。提供了一种用户可操作的开关SW以便使用户能将电源6与高压发生器7连接。
在此实例中，通过固定于管9内的第一导电电极11和安装于管9外表面的第二电极12之间所建立的高压提供雾化部位。第一和第二电极分别与高压发生器7的高压导线13及地线14连接。
当用户操作开关SW以连接电源6和高压发生器7时，在第一和第二电极之间产生高压(通常为千伏级)，由此在邻近出口10的雾化区域20内产生要建立的电场。从出口流出的液体由此受到这种电场的作用，使得当液体出现于自由空间或空气中时，其液体中的净电荷抵消了液体表面张力，而由同类电荷所产生的排斥力引起锥形射流，然后基于不同液体制剂，所述锥形射流可以被分散成液体雾滴。
分配装置1产生一种电击雾化法(electrically chargedcomminution)。这种装置的进一步细节和改进可以见于WO00/35524。
US-A-4962885、US-A-6105877、US-A-6105571、US-A-5813614、US-A-5915377、WO99/07478和WO00/35524中任何一个所描述的任何一种雾化位置排列都可以用于替代上述雾化位置。此外，可以改进图1所示装置以使之能够实现US-A-4962885、US-A-6105571、US-A-5813614、和GB-A-1569707中所述任何一种方式的至少部分放电的电击雾化法。
图2表示基于WO99/07478所述的分配装置1a，其中第二电极12被游离于管9的放电电极12a代替，并且其中安装了另一个电极，即偏转电极13。在这种情况下，安置高压发生器7以保持另一个电极13的电压处于供给第一放电电极11和12a的电压之间。如WO99/07478所述，后置电极13用于使雾化作用偏离放电电极12a直到雾化步骤产生足够的空间电荷。可以改进装置1a以使之与WO99/07478中所述任何一种实施方案或WO99/07478中所述的任何一种改进的实施方案具有相同的构造。
图1和2所示的分配装置1和1a可以用于将雾化物分散于室中或表面(特别是其中雾化物带有电荷时)。在这些情况下，图1所示第二电极12可以省去而地线可以位于喷雾所正对的表面或由该表面提供。此外，如图3所示，出口3可以连接管嘴30以保证使用人能够由口腔吸入雾化物或者如图4所示可以变化以紧贴着使用者的鼻孔或稍稍小于鼻孔，以便能够由鼻腔吸入。
现在将描述能够用电场流体动力学处理(本文另称为喷雾)液体的本发明的具体实施方法。
方法1现在描述一种能够用电场流体动力学雾化含有生物材料如DNA的水溶液的方法。
EHD制剂通常掺入乙醇，因为乙醇具有较低的导电性和较低的表面张力。它可以加入到大多数的制剂中，但对于DNA，其加入通常导致沉淀。事实上，加入乙醇实际是作为一种从溶液中沉淀DNA的方法被传授的(例见“分子克隆-实验室手册-第3卷，第二版(Molecular Cloning-Laboratory Manual)”Sambrook，Fritsch，Maniatis著；E10-15页；Coldspring Harbour Press；1989)。然而我们开发了一种能够将乙醇加入到DNA溶液中以使之适用于EHD的方法。
DNA通常贮存于含有多种化学物的盐类的各种缓冲溶液中。在这种方法中，这些盐的绝大多数被透析除去以产生相对纯的DNA溶液。除去这些盐后，加入乙醇以制备乙醇体积占80％的制剂。令人吃惊的是，这不会使DNA沉淀出来。然后用该制剂装满如图1或2所示的分配装置中的贮库并激发分配装置。在本实施例中，该液体以1μl/s(微升每秒)的流速从单一毛细管式喷嘴的输液管喷出。当DNA的浓度较低(最高可至约200微克每毫升)时，发现该制剂的喷雾令人满意，但在高浓度DNA下不能令人满意地喷雾。
进一步以70％浓度的醇和最高可达90％的不同浓度的乙醇进行实验。发现低浓度DNA全部能够令人满意地喷雾。
方法2重复方法1但有改进，即向制剂中加入少量(约1mM)乙酸并以0.5ml/hr(毫升每小时)的流速喷雾。发现该制剂的喷雾令人满意，即使DNA浓度显著增加并且达到了以6mg/ml浓度DNA进行的令人满意的喷雾。用0.2mM至高达1mM(微摩尔)浓度的乙酸获得类似结果。
当达到实际应用的DNA雾化速率时，具有这种浓度的DNA的常规制剂不产生任何沉淀。此外，如图5所示，所得EHD雾化液滴具有直径范围极窄的非常理想的液滴频谱。
我们发现乙酸完全地适用于该目的，但也可使用其它酸例如硝酸和盐酸。这种制剂使得DNA能够喷雾，而且也可以用于那些在乙醇存在下不变性的任何蛋白。
图6表示通过不同雾化器喷雾后的多种DNA样品的凝胶电泳图。外侧两条泳道表示有助于结果定量的千碱基标记(kb)。pCIKβGal标记的泳道表示未被喷雾的DNA印迹。标记为“Jet”和“Ultra”的带对应于“Sidestream”喷气式雾化器(Medic Aid生产，Bognor Regis，英国)及“Euroneb”超声雾化器(Medikare生产，德国)喷雾后收集的DNA。Jet和Ultra泳道中低于原位(由pCIKβGal泳道指示)的DNA的成片电泳条带表明雾化过程导致对DNA的显著损伤。作为对照，标记“EHD”的条带显示采用上述方法2分配的DNA实际上与原始的的DNA相同，说明雾化过程很少或没有对其造成损伤。这还表明在EHD雾化过程中所采用的高压对DNA没有影响。
图7表示类似于图6的对多种不同的DNA质粒采用方法2所获得结果的图谱。所述结果按对分组，其中每对的左侧结果代表喷雾前的DNA而右侧图谱表示采用上述方法2的EHD雾化后的DNA。所示三种质粒为4.6千碱基的pCIKCAT、9.2千碱基的pCIKCFTR.10、及14.2千碱基的pREP8βGal。由此可见采用上述方法2来分配DNA似乎对这些质粒中的任何一种没有影响。
方法1和2可以用于通过EHD喷雾DNA、DNA片段以及不被醇类变性的其它生物材料。
方法3在方法1和2中，当EHD雾化处理期间产生的离子与制剂中的水反应时便生成过氧化氢生。尽管所产生的过氧化氢的量极少，但是过氧化物所致的DNA降解可以清楚地见到。这种降解反应由极少量天然存在且极难清除的存在于制剂中的金属离子催化。降解量有但很少，并且在0.025mg/ml的DNA浓度以上，我们发现降解百分比几乎难以觉察。因此，对于治疗制剂，它们所具有的浓度可能比这高40倍或甚至更高，过氧化物降解可以被忽略。然而，当所喷雾的DNA浓度较低时，例如约0.0025mg/ml，对DNA的影响是显著的。
在这种方法中，通过加入50mM乙二胺四乙酸(EDTA)或40nM过氧化氢酶而改进方法1和2的制剂。
图8和9分别表示采用掺入作为添加剂的50mM乙二胺四乙酸(EDTA)或40nM过氧化氢酶的制剂在喷雾后收集的含DNA雾化物中的超螺旋DNA百分率(用电泳图谱测定)。在喷雾前和后取值，而且对于各制剂只有极少的直接损害，即超螺旋DNA的变化量极小。然而，在喷雾后约一小时时，其结果开始出现偏离。此时尽管所收集的采用方法3产生的雾化物中的超螺旋DNA的量(用实心方块表示)基本保持不变，但是所收集的没有掺入添加剂的雾化物中的保存的超螺旋DNA的量(用空心方块或外框方块表示)开始减少。由此清楚表明没有采用添加剂喷雾的DNA逐渐变质。
如上所述，尽管在高浓度DNA下方法3并非必需，因为在高浓度DNA其降解量少得可以忽略，然而当仅需要低浓度的DNA时，其结果表明通过加入螯合剂如EDTA或酶如过氧化氢酶则可以完全避免DNA降解。
另一项涉及蛋白质喷雾的实验也已进行并且被证明在EHD雾化过程中这些分子也不变性。例如，胰蛋白酶、过氧化物酶和重组肺表面活性物质-蛋白D全部被喷雾而没有变性。其它醇而非乙醇，例如聚乙二醇200也被采用。
方法1至3可以用于在乙醇或其它醇如聚乙二醇200中不变性的任何蛋白质或其它生物材料。
方法4引入乙醇或其它共溶剂如聚乙二醇200在某些条件下可能会导致变性并因此可能是不能接受的。
本方法提供能够用EHD雾化可含有生物材料的含水制剂的另一种方法。迄今为止实际上不可能采用EHD雾化含水制剂。这是由于这些制剂的高表面张力和高导电性易于导致雾化点或雾化区附近的空气分解，引起大的、分散的、局部电流，这通常导致EHD锥形射流的彻底失败。
这时可以将适当的表面活性物质加入到含水制剂中，以降低表面张力。所有表面活性物质都具有称作临界胶束浓度(CMC)的内在特性，这是在液体中形成胶束的浓度，并且这通常与最小浓度相对应，在此浓度下表面活性物质的表面活性被最大化。然而，实验表明对于EHD雾化而言，该浓度的表面活性物质太低，相反，我们发现，除表面活性剂的CMC外，表面活性物质浓度还必须增加到能够使之单层分布于雾化物的高度特异性表面。
采用分子表面积大约为682的溴化二月桂基二甲基铵作为表面活性物质来进行实验。采用图1或2所示的分配装置时临界胶束浓度(以质量计约0.061％)不足以产生满意的雾化作用。然而将表面活性物质浓度增加到足以形成单层包膜水平时就能够获得满意的雾化作用。因此对于直径为1.5μm的典型液滴而言，至少需要约0.4％的溴化二月桂基二甲基铵并且0.5％左右的浓度可有效产生满意的EHD雾化作用或喷雾含水制剂。
我们还发现添加0.1％的苯扎氯铵水溶液能够使所测电阻率仅为～60Ohm.m的液体以0.12μl/s喷雾。类似地，添加0.8％的吐温20(一种聚氧乙烯脱水山梨糖醇衍生物)能够使大约625Ohm.m的较高电阻率的液体以同样的流速喷雾。
其它表面活性物质也被使用过，例如吐温80、Emulphogen(现在称为Rhodosurf BC720(聚氧乙烯10十六烷基醚))玻雷吉(Briji)30(聚氧乙烯4十二烷基醚)。
方法5可惜，尽管有此结果，但与采用表面活性物质相关的一些问题仍然存在。这些问题包括表面活性物质对敏感上皮产生的毒性和刺激作用；相对较低的最大流速导致治疗时间延长的实际情况；这些喷雾的相对不稳定性使得锥形射流容易被机械震动所破坏；以及在实际应用中，表面活性物质通常仅仅能够进行正极性的EHD喷雾-在负极性处的气体更容易分解并且表面张力的降低通常不足以保证通过EHD喷雾的实际情况。
在本方法中含生物材料的传导率的制剂可以在不需要表面活性物质的条件下达到较高的流速。在本方法中将可溶于待喷雾液体的长链聚合物加入到制剂中。当液体为水时，合适的聚合物包括聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚透明质酸盐，蔗聚糖(polysucrose)，以及其它多糖，例如淀粉，纤维素、壳多糖及它们的化学衍生物，聚合氨基酸，改性胶原及其衍生物。可以使用可溶于、或可以使之溶于液体制剂(当制剂为含水制剂时可溶于水)的其它聚合物，只要它们具有合适的长度以影响液体的动力学松弛常数。还可以使用不同聚合物或不同分子量的同类聚合物的组合。例如PVP40000可以与PVP360000联合用于喷雾含水制剂。
作为实验，一种电阻率为约5Ohm.m的高传导率的含水制剂被选作待喷雾的液体。该液体的表面张力为约70mN/m并且对于未改进的制剂，这种液体不能采用EHD雾化法在空气中喷雾。在这项实验中，发现该含水制剂在仅添加2％的分子量为360000的PVP时能够满意地以约1.5ml/hr的流速喷雾。
选择的聚合物分子量很重要，因为象这样的聚合物仅当其分子量适当的大时才能够提供明显实效。我们发现不同聚合物需要不同的分子量并且随所选分子量增加其有效作用逐渐改变。作为一般规律，给定的聚合物的分子量越高，则改进喷雾制剂所需的最佳浓度越低。随着该聚合物浓度升高，雾化产物形式由液滴转变为纤维。发生这种转变的浓度所表现出的作用差异实际上可以从不同的聚合物类型预见到。作为采用不同分子量的同类聚合物的实例，含增加浓度的PVP360000的乙醇制剂被喷雾并与含PVP40000的乙醇制剂进行了比较。含PVP360000的制剂在35mg/ml浓度时开始产生纤维，而含PVP40000的溶液则在260mg/ml时开始产生纤维。因此其结果是，稳定一种特定制剂时，PVP360000的需要量应比PVP40000少。作为采用不同聚合物的实例，含70％乙醇和30％盐水(水中含0.5MNaCl)的制剂分别用PVP360000和PVA125000喷雾。对于PVP360000，聚合物的转变浓度为55mg/ml。对于PVP125000，从液滴向纤维的转变出现在30mg/ml的浓度下。类似地，已表明不同分子量的聚合物的组合遵从该模式。例如，将同时含PVP40000和PVP360000(比例为50∶50)的含70％乙醇和30％盐水(水中含0.5M NaCl)的制剂喷雾，在这种情况下，组合的聚合物的转变浓度为70mg/ml。
在另一项实验中，采用的制剂由70％的乙醇和30％的水组成。水中还含有一些0.5M的盐(NaCl)以模拟添加活性分子、生物材料或药物的影响，使电阻率降低到4.7Ohm.m。将0.2g/10ml分子量为360000的PVP加入该制剂中，采用如图1或2所示装置喷雾该制剂。图10显示从收集了所产生的雾化物质的显微镜载玻片上拍摄的特写照片。所形成的液滴具有可呼吸的大小，测得约为5μm或更小。照片实际大小为75μm。
在另一项实验中将10mg/ml的分子量125000的PVA加入到含70％体积乙醇和30％体积水的制剂中，其中水中含0.5M的盐(NaCl)而且制剂的电阻率为5.5Ohm.m。与图10类似，图11显示从收集了所产生的雾化物质的显微镜载玻片上拍摄的照片。照片的实际大小也是75μm而且所产生的液滴是可呼吸的。
类似的结果得自含0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7克每10毫升浓度的分子量125000的PVA的液体制剂和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2克每10毫升浓度的分子量360000的PVP的液体制剂。所述液体制剂由70％乙醇和模拟生物材料形式中的活性成分存在的30％的0.5摩尔水-NaCl溶液组成。类似的结果还得自加入浓度范围为0.5g/10ml至0.8g/10ml的50％的分子量40000的PVP和50％的分子量360000的PVP的聚合物组合的制剂。高于一定水平的上述聚合物浓度可导致纤维形成而不是形成液滴，其实际水平取决于聚合物和制剂。通常该水平对于PVP360000约为0.5g/10ml，对于50∶50的分子量为40000和360000的PVP混合物约为0.6g/10ml而对于分子量为125000的PVA约为0.25g/10ml。
掺入长链聚合物使得制剂的松弛常数动态地降低从而获得传导率的液体的更高流速。此外，并且更重要的是，掺入聚合物的液体可以以任一极性喷雾。
方法6在该方法中，联合应用聚合物和表面活性物质以优化EHD喷雾和电溶胶产物。
采用电溶解于水中的0.5M的盐(NaCl)溶液组成的制剂作为实例。不能采用EHD雾化使之喷雾。然而，加入1.7％(17mg/ml)的分子量为125000的PVA和1％(10mg/ml)的吐温20之后，该制剂(其性质是电阻率＝4.3Wm；表面张力＝32mN/m；且粘度＝13cP)能够以0.2至0.6ml/hr的流速喷雾。
类似地结果可以用上述任何聚合物获得。
实施例7我们的实验表明通过加入聚合物可以稳定敏感分子如蛋白质。
在这种方法中，多种蛋白质可以在喷雾前与聚乙二醇(PEG)结合。已发现这样可以增加它们稳定性，在机械张力下保护蛋白质并使它们在其液体载体或溶媒中能够耐受更多的变化。具有类似于PEG的特性的其它聚合物产生类似的结果。
此将描述进行喷雾胰蛋白酶、过氧化物酶和胰岛素的实验实施例。
临床上可获得的蛋白质例如胰岛素和生长激素目前是通过注射释药，而不能通过口服途径给药，因为它们在胃肠道中被消化和灭活并且大部分在肝脏中被代谢。因此开发能够将这些范围广泛的蛋白质传递到肺部的肺传递系统是非常重要的。胰岛素被用于检测以EHD技术喷雾蛋白质的效果。
酶在细胞中是必需的，并属于大量不同类型的蛋白质。它们作为生物催化剂几乎在生物系统中的所有生化反应中发挥作用。胰蛋白酶是发现于哺乳动物胰液的蛋白质水解消化酶。过氧化物酶是存在于植物和动物体内，特别是哺乳动物脾和肺中的另一种类型的酶，其作用于过氧化氢和有机过氧化物。因此，作为模型系统，采用这两种酶检测用EHD技术喷雾蛋白的效果。
方法8在此将描述采用PEG200的制剂实例。
胰蛋白酶首先将胰蛋白酶溶解于磷酸钠(NaPO4)缓冲液中，然后用PEG200配制最终制剂20％磷酸钠和80％PEG200中的胰蛋白酶。在+12.1kV下，以1.5μl/秒的流速，将100μl的这种制剂喷雾到含2ml NaPO4缓冲液的35mm的聚苯乙烯组织培养皿中。将浸末在磷酸钠的铂环用作地线。喷雾后通过移液管从培养皿中转移胰蛋白酶/NaPO4溶液用于喷雾后的即刻，和1、2、3、4及5天后的酶检测。全部实验重复4次而且结果表明喷雾后99.53％的胰蛋白酶活性被保留。因此可以得出结论，当PEG200掺入胰蛋白酶制剂时，EHD喷雾技术(此实例中无放电(discharging))不导致酶活性的丧失。
过氧化物酶在20％的过氧化物酶稀释液(含磷酸钾缓冲液、小牛血清白蛋白和triton X-100)及80％的PEG200中配制过氧化物酶。与胰蛋白酶一样，在+11.9kV下，以1μl/秒的流速，将100μl的这种制剂喷雾到含2ml过氧化物酶稀释液的组织培养皿中。另外，将浸没于过氧化物酶稀释中铂环用作地线。在单次实验基础上，在用EHD技术喷雾(无放电)后4天保留＞90％的过氧化物酶活性。
因此PEG(聚乙二醇)可以用于稳定蛋白质以易化EHD。
方法9在此将叙述一种能够使EHD喷雾含醇和生物材料的制剂的方法。
如上文所述表明的，添加PEG200可增加蛋白质的稳定性；然而，从毒性上讲，对于吸入来说制剂中80％的PEG200是高浓度的，因此考虑了替代溶剂。为此目的，用丙二醇(通常与水或甘油结合使用)配制胰蛋白酶和过氧化物酶。此外，为确定乙醇是否可能是酶喷雾的有效溶剂，还试验了含有乙醇的制剂。
胰蛋白酶被配制在a)20％NaPO4缓冲液，80％丙二醇中[能够在+(8.1-8.6)kV电压下以0.6-2.4μl/秒的流速喷雾]，b)20％NaPO4缓冲液，40％丙二醇，40％乙醇中[能够在+8.32kV下以0.6-1μl/秒的流速喷雾]，c)20％NaPO4缓冲液，60％丙二醇，20％乙醇中[能够在+(7.42-7.62)kV电压下以0.6-1μl/秒的流速喷雾]，溶液(b)和(c)在其配置后立刻变成乳状的。
过氧化物酶被配制在d)20％过氧化物酶稀释液，80％丙二醇中[能够在+9.5kV下以0.6μl/秒的流速喷雾]，e)20％过氧化物酶稀释液，40％丙二醇，40％乙醇中，f)20％过氧化物酶稀释液，60％丙二醇，20％乙醇中，溶液(e)和(f)仅能够以0.01-0.02μl/秒的流速喷雾；当流速较高时便产生电晕(corona)。这些溶液在其配置后立刻变成乳状的。
蛋白质通常溶解于含有各种化学物盐类的缓冲液中。当它们用醇配制时溶液变成乳状，提示可能是醇使盐发生沉淀。初步的实验结果表明，当加入醇时磷酸缓冲液确实变成乳状的。此外，进行胰蛋白酶检测(见附录)以测定与醇混合后酶是否稳定。在配制后0、1.5、3、4.5和6小时时测定酶活性。结果表明，与仅含磷酸钠缓冲液的制剂相比，在各时间点上，含有20％磷酸钠缓冲液和80％PEG2000，以及20％磷酸钠缓冲液和80％乙醇的制剂中所测得的酶活性类似。这些结果表明在含醇的制剂中其活性能够保持。
方法10在此将叙述通过EHD喷雾胰岛素的方法。
用三种不同的配方配制猪胰岛素7. 0.5％的Emulphogen，5％的磷酸钠(NaPO4)缓冲液，30％的甘油和64.5％的水8.0.2％的0.01M HCl，19.8％磷酸钠缓冲液和80％的PEG 2009.20％的0.01M HCl和80％的PEG 200将100μl的各制剂喷入含2ml NaPO4缓冲液的35-mm的聚苯乙烯组织培养皿中。将浸没于NaPO4缓冲液的铂丝环用作地线。喷雾后，用移液管将胰岛素/NaPO4溶液转移出培养皿而用ELISA方法检测胰岛素。
结果
由此发现胰岛素可以配制在三种不同的可喷雾的制剂中。喷雾后的胰岛素活性用ELISA法测定。
因此，胰蛋白酶、过氧化物酶和胰岛素可以在多种制剂中采用EHD释药。
其它方法用EHD喷雾表面活性蛋白质的实验也已进行。肺表面活性物质在降低肺泡上皮内表面的表面张力，防止气体交换过程中的肺泡塌陷中起着重要作用。这些蛋白的失活或缺乏与呼吸道疾病如呼吸窘迫综合征(RDS)有关。RDS仍然是新生儿死亡率的最常见病因。将外源性表面活性物质给予患RDS的新生儿成为明确的治疗手段。
花粉粒/尘螨引发的过敏反应，以及由呼吸道合胞体病毒(RSV)导致的肺感染是世界性的严重问题。迄今为止，还无法获得用于预防或治疗这些疾病的安全和有效的药物。有可靠证据表明肺表面活性物质(SPs)，如SP-A和SP-D，与先天性免疫力有关，其中它们结合并清除过敏原如花粉、隐藏尘螨的液滴以及病原体如病毒和真菌。
目前可获得两种主要类型的外源性表面活性蛋白—天然的和合成的。天然表面活性物质通过肺泡灌洗方法从动物或人获得或者从羊水中获得。它们的优点是具有调节表面张力的所有必须的功效成分；然而，它们的收集不定时而且花费昂贵。此外，它们有被感染性的病毒性因子污染的危险。在临床上，天然表面活性物质比合成的具有更高的效力，可能是由于天然表面活性物质的蛋白含量所致。因此，开发了重组肺表面活性蛋白并且可以将这些敏感分子传递至肺部以预防和治疗呼吸道疾病，例如支气管哮喘，气管炎和肺炎，并在肺移植中增强免疫防御力。
目前用于将蛋白质传递到，例如小鼠的肺部的方法是一种侵入技术-气管内滴注。在这种方法中，将皮下注射针头插入小鼠气管内，通过该针头将蛋白质传递到肺部。将皮下注射针头插入气管容易造成周围组织损伤，这可能引起小鼠不必要的免疫反应。此外，通过气管内滴注传递的蛋白质溶液并非是以液滴，而可能是以聚集的形式给药的。因此，蛋白质不大可能到达下呼吸道。
另一种传递蛋白质的途径是通过液体滴管，通过它将蛋白质经鼻腔内传递给动物如小鼠。与气管内滴注类似，这种给药方法的显著缺陷是不能精确地传递蛋白质并由此导致蛋白质的无效传递。
与气管内滴注相反，EHD能够将物质温和地传递到小鼠和人的肺部，而不损伤沿着呼吸道的组织。EHD还能够精确传递物质，因为可以准确控制电溶胶的大小并且能够根据液滴的质量和大小调整肺部的最佳沉降区。例如EHD可以用于，如图5所示，产生单分散性液滴喷雾，其中所有液滴具有基本相同的直径，其液滴直径对于人是在1.0-10微米范围内而对于小动物则成比例缩小。EHD除了能够使所得液滴带电外，如上述至少部分专利和公开的申请书所述的放电或部分放电以及保持少量电荷可能是有利的，特别是对于沉降于气管末端和肺泡而言。
EHD喷雾表面活性蛋白质的实施例采用WO 99/07478公开的装置用EHD喷雾的重组SP-D(rSP-D)蛋白用三种配方(a)，(i)和(j)配制。另一个电极为接地电位。配方细节和所获最大流速为
检测这三种制剂(a)、(i)和(j)对未喷雾的SP-D分子的影响。将重组SP-D加入到每个样品中并分析各制剂的试验活性，与对照样品，Eagan 4A比较。表示各混合物活性的曲线图如图23所示。制剂(a)、(i)和(j)中的rSP-D的活性仅有轻微减少。然而，制剂(i)中的SP-D不产生正信号(positive signal)。尚未证实实际是甘油使rSP-D变性还是仅仅是分析机理的干扰。
rSP-D含水制剂在上述含水PVA和表面活性物质制剂的成功的基础上，以3％PVA(100k分子量)、0.1％吐温20和96.9％的PBS配制0.1mg/ml的rSP-D。该制剂以1ml/hr的流速喷雾。以简单的点对面(simple point-to-plane)(喷嘴到收集面)实验进行喷雾，采用类似于图1所示装置，但没有第二电极并采用输液管或无中心叶片的Delrin尖头喷嘴。采用接地铂丝环将喷雾液收集于培养皿中。这种点到面间的距离为20mm。采用1ml注射器和IV管，在各制剂重复进行两次后，在使无效空间(Dead space)最小的条件下保存样品。进行生物测定以确定蛋白质是否保持全部活性，或在EHD处理的剪切力下变性。结果表明未见由EHD喷雾引起的对rSP-D的不良影响。
在体外，EHD喷雾SP-A和SP-D也已经达到接近单分散性喷雾或形成云雾状并且没有变性。通过采用如WO94/12285(其全文通过参考结合于本说明书中)所述的双喷嘴EHD装置还已经实现对液滴电荷的控制。
上述实验已经表明敏感材料如生物材料，例如DNA、蛋白质和酶，可以被电场流体动力学粉碎而不导致电场引起的变性，因为待喷雾制剂的液体载体或溶媒比常规EHD制剂的传导率高(即具有小于10000Ohm.m或更优选1000Ohm.m的电阻率)。这种特别高的导电性有助于排斥外加电场并因此保护其免受电场所致的变性。此外，在EHD处理期间发生的剪切力也极度减小。目前的知识是，为大体积液体和雾化电溶胶之间的电场诱导转变区域的EHD锥体是电场建立起来的以环状旋涡流动的高速湍流(Hayati I，伦敦皇家学院1985年博士论文(1985-Ph.D，Thesis，Imperial College London))。然而，湍流的量与导电性及液体粘度以及雾化区或点的物理尺寸有关。本文所述的导电性制剂使得所存在的对液体的剪切力显著降低，而这可以进一步减少不断增高的粘度或缩小的EHD锥体的基础直径。总体上，我们计算出EHD处理期间实验所用液体的剪切力，其值与气体喷嘴及超声雾化器喷出相同大小的液滴相比降低约1000倍。
如上文所述，上述方法可以用EHD分配装置实施例如图1或2所示的装置实施。这些EHD装置可以，此将在后文叙述，结合到吸入装置中而使之能够控制周围的环境条件。
图12图解说明了适合使小的实验动物如小鼠易于吸入液滴的吸入装置的一个实例。
泵101驱动空气以恒定速率通过吸入装置。空气从泵流过空气调节器102进入EHD雾化装置或单元103。然后空气和雾化物流入吸气室104，室内放置小动物，通常为小鼠，以呼吸雾状液滴。废气通过过滤器105排入大气。
在此实施例中，设计空气调节器102以清除所进入空气中的蒸气。
图16表示一种可行的空气调节器102的剖面图，它包括用干燥硅胶111填充的U形管110。气流通过U形管入气口120被强制通过U形管中填充的硅胶111并通过排气口113排出。通过橡胶或其它合适材料制成的弹性塞子114的方法使得入气口和排气口都被加固并具有气密性。在空气进入EHD雾化器103之前通过这种方法将所进入的空气中的湿气清除。这样增强液滴的蒸发，使之能够产生更小的液滴。对于本领域内技术人员而言显然可以将其它材料放入U形管以清除气体和蒸气以帮助减小液滴大小。
图19和20表示两种可供选择的适合用作气体调节器102以清除气体中蒸气的冷阱。在图19中金属杆311插入吸气箱104的内外室之间。将这根杆浸入盛于烧杯331中的液氮321或其它极冷液体或固体中，由此使这根杆变得非常冷。这根杆伸入吸气箱中的部分将凝结出任何蒸气，并通过简单的蒸气扩散而显著降低整个吸气箱中的蒸气浓度。图20表示另一种以类似家用冰箱的方式运行的冷阱。在此用压缩机411将合适的制冷剂如氟利昂12(二氯二氟甲烷)泵入金属管401周围。使氟利昂12在通过阀431后能够膨胀而显著降低其温度并冷却金属管。这种吸入装置如果与合适的监控装置(未表示)接合则可以在实验过程中自动调节以保持特定的蒸气浓度。其它合适的冷阱对于本领域内技术人员来说是显而易见的。
图15表示用于图12所示吸入装置的适合于小鼠的吸气室104的实例。组成该室的箱体200由有机玻璃制成，它具有对称安装于密封外室202(隔离与过滤器105连通的废气)的具孔眼的内室201。EHD雾化器或装置103安装于盒盖中央以将雾化物导入具有孔眼的内室201。该吸气室104可以具有环境调节器以调节和控制EHD雾化器103所产生的液滴的蒸发和吸收进而促进液滴蒸发而使液滴大小容易被减小。此环境调节装置可以通过在内外室201和202之间的间隙中放置吸收材料，如硅胶或活性炭来提供，以便从吸气室中吸收任何不需要的蒸气，由此促进EHD雾化器产生的液滴的表面蒸发而降低它们的大小。
图18表示在吸气室中加入150g硅胶如何能够在长时间里基本改变吸气室104的湿度。在此情况下将20％体积的水、80％体积的乙醇混合物按2.4μl/s的速度喷入箱内。曲线图清楚表明硅胶的存在确保了箱内相对湿度在整个实验期间不会升高到比40％高很多。当然，应当指出，该实验是在箱内没有动物的条件下进行的。它们的呼吸产生大量的水蒸气，并因为如此可以将如图19和20所示的冷阱引入内外室之间以清除水蒸气以及来源于吸气室104内气体的其它蒸气。
对这种吸入装置来说，典型气体流速可以从0变化至60L/min及更高，但优选尽可能低，同时保持吸气室内合适的氧气水平。在一项实验中，将10只小鼠放入吸气室104中，泵被设置成提供流速41/min(升/分钟)的气体而EHD雾化器103被设置成以流速2.4μl/s喷雾DNA浓度为1mg/ml的上文方法2的所述制剂。在2小时中用EHD雾化器103使17.3mg DNA雾化，约6μg保留在小鼠肺中。
这种吸入装置提供了一种控制液滴直径和电荷使之准确降低到适合小鼠的大小(例如1-3μm及以下)的方法。因此这种吸入装置能够产生小鼠和类似的小实验动物可以呼吸的气溶胶，否则这些小实验动物(作为所有人体呼吸疗法的必需预先进行的步骤)由于其解剖构造小以及非顺从性呼吸将很难使对动物例如小鼠(由于其解剖结构上的基本差异使其对于吸入的要求与人有极大差异)的活体毒性和治疗活性的检测顺利进行。
将吸气室用于气溶胶的强制性呼吸是熟知的。然而，从动物实际吸入的产物量与释放量的比较来看，常规吸入装置是无效率的。例如，气体喷射雾化器产生1μm的液滴，该直径适合于小鼠吸入，其气体流通量必须达约6-8L/min(升/分钟)。结果，难以在空气中形成很高浓度的气溶胶，因为它被在产生气雾的第一地点的气体不断稀释。相反，在上述吸入装置中，EHD雾化器103产生液滴并且仅需相对少量的空气流(＜1L/min)，以维持吸气室104中的氧气浓度。这意味着电溶胶浓缩了一个数量级，因此该吸入装置的效率比常规气体喷雾器高出一个数量级。使用超声雾化器同样不需要气流。然而，它们还是使敏感生物材料变性；它们不能用于粘性液体(例如DNA浓缩液)；并且当形成约1μm的液滴时它们易于阻塞。
图13表示设计用于大动物和人的吸入装置的示意图。在这种吸入装置中，吸气室104被代之以中间室106以及如图所示的面罩107，它能够装到大动物例如人的口和鼻上(例如如图3所示)或者是管嘴(mouthpiece)或气管内插管。面罩可以是任何标准吸气面罩例如可以从Medic Aid，Bognor Regis，UK获得的，产品标准为1100 Syetem22的面罩。中间室106可以以图15所示的吸气室104为基础并可以装备调节器以在传递至管嘴或面罩107之前调节和控制EHD雾化器103所产生的液滴的蒸发和吸收。
图14表示设计用于人的吸入装置实例图。在此情况下下，EHD雾化器、中间室和面罩被单一的EHD吸入装置108所代替，如WO99/07478中所述。应当指出这种吸入装置能够在没有泵101或空气调节器102下理想地工作，尽管如上文所述采用空气调节器可能具有能够使液滴大小减小的优点。
如上文所述设置空气调节器102也可能是吸气或中间室104或106以清除室内空气中的蒸气而促使液滴表面蒸发以减小液滴大小。然而，有时在进行EHD处理的环境中或其附近的环境中可能需要增加气体中的溶剂或挥发性成分的蒸气压。例如可以升高溶剂蒸气压而阻止蒸发，例如，减慢或阻止流出EHD雾化器103出口的液体凝固。这对于含有聚合物的液体制剂特别有用，因为它能够防止凝固并因此能够使更高浓度的聚合物比在相反情况下更有可能形成液滴。
图17表示气泡室剖面图，它可以结合到空气调节器102(和/或吸气室或中间室)中并且可以用于升高液体制剂所用的任何溶剂的蒸气分压，例如使进入EHD雾化器103的空气饱和。参照图17，空气通过入口115被泵入并且通过装在容器117中的液体116形成气泡。然后通过出口118排出气体。进出口均固定在橡胶或其它合适材料制成的气密性塞子119上。实验表明采用这种含温水作为液体116的气泡室可以防止含有聚合物的含水制剂干燥并形成固体产物。
如图15所示，当EHD雾化器103插入吸气或中间室时，则可以在该室内安装控制气体湿度的空气调节器102而不是在EHD雾化器103内安装或在该雾化器内再安装空气调节器，因而不需要独立的调节器。
如上文所述可以通过控制液滴形成处的环境(如上文所述通过采用空气调节器和/或控制吸气或过渡室104或106的环境)而控制EHD雾化器103所形成的液滴直径。因此通过减小环境中的水(或挥发性组分)的蒸气分压而促进液滴中的水(或挥发性组分如制剂中的溶剂，如乙醇)的蒸发可以减小液滴大小。因此如上文所述使环境气体干燥以降低其湿度将增加液滴的水分蒸发并由此降低其大小。相反，升高湿度(例如采用如图17所示的气泡室)或升高制剂的挥发性组分的蒸气分压将阻碍蒸发并因此妨碍液滴大小的降低。此外，当液体制剂含有吸湿性物质时，液滴也可以在飘飞期间吸收水分并增大直径。
图21和22分别表示图1和2所示的EHD装置中的调节方式。这些装置1b和1c与图1和2所示的那些不同，其中装配的第二液体贮库50通过管51与环绕于液体输出管9的管套(shroud)或环管(collar)52连结。液体贮库50装有补给溶剂，该溶剂以基本等同于容器52中溶剂的蒸发速度通过通向所述管套的管51来补充。在这个实例中容器52含有吸附性材料例如毛毡(felt)。应当理解，尽管输液管9为固定容器52提供了便利处所，但容器52可以固定于第二室内5的任何便利之处。这种改进的EHD装置可以单独使用或作为上述任何吸入装置中的EHD装置103以增加第二室中的溶剂蒸气压并且可以代替入图17所示的气泡室，使空气调节器可以省去。通常所述溶剂就是喷雾的液体制剂中使用的溶剂，例如乙醇。
也可能在需要清除蒸气时采用管套或环管(无液体贮库50)，它贮有合适的干燥剂(例如硅胶)以干燥第二室的气体而促使液滴的溶剂蒸发进而减小它们的大小，也使之能够在需要干燥环境空气时省去空气调节器。
在上述实例中EHD处理产生液滴。当液体制剂中含有聚合物时则聚合物可能是这样的量，它使雾化不能发生，但却形成可以断裂成纤丝的连续纤维。通常这样的制剂不能用于吸入目的(除非纤维断裂成小纤丝)，但可以用于局部给药到例如伤口表面或口腔内。在此情况下，图21和22所示改进装置可以用于控制从输液管流出的液体的固化速度，以控制纤维形成过程而不是完全防止固化。
当液体制剂中含有聚合物，尤其是当它含有相对大量的聚合物时，通常不会产生典型的Taylor锥形，而是所流出的液体更有可能.在输液管出口形成半球形或气泡样的形状。本文所用术语锥形是指同时包括典型的Taylor锥形和这些形状。
具体实施本发明的方法、设计和吸入装置可以用于将生物材料、水溶性药品或药剂、疫苗及其它敏感分子传递到身体内或外表面包括肺、气管、喉、口、鼻道、眼、皮肤及伤口表面。
附录(A)胰蛋白酶检测1 原理胰蛋白酶BAEE+H2O →Na-苯甲酰基-L-精氨酸+乙醇(BAEE＝Na-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯)2条件温度＝25℃，pH＝7.6，波长＝253nm3试剂3.1标准胰蛋白酶检测(1)67mM磷酸钠缓冲液，25℃下pH7.6(2)试剂(1)中的0.25mM Na-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)(3)1mM盐酸(4)临用前，以冷的试剂(3)制备含500BAEE单位/ml的胰蛋白酶溶液。
3.2喷雾前和后的胰蛋白酶检测(1)空白溶液(a)将1ml 67mM的磷酸钠与4ml PEG200混合(b)将100μl的(5a)转移到2ml 67mM的磷酸钠中(c)将900μl的(5b)转移到100l 10mM的盐酸中(1)喷雾前溶液(等于1070 BAEE单位/ml胰蛋白酶)；(a)将1ml胰蛋白酶(12480单位/ml)的67mM的磷酸钠溶液与4ml PEG200混合(b)将100μl的(6a)转移到2ml 67mM的磷酸钠中(c)将900μl的(6b)转移到100l 10mM的盐酸中
(1)后喷雾溶液(a)通过12kV喷嘴将100μl的(6a)以1.5μl/秒的流速喷雾到2ml 67mM的磷酸钠中(b)将900μl的(7a)转移到100μl 10mM的盐酸中4操作4.1标准胰蛋白酶检测空白1.5ml试剂(2)+100μL试剂(3)试验1.5ml试剂(2)+100μL试剂(4)4.2喷雾前和后的胰蛋白酶检测空白1.5ml试剂(2)+100μL试剂(5c)喷雾前1.5ml试剂(2)+100μL试剂(6b)喷雾后1.5ml试剂(2)+100μL试剂(7b)由于可以利用微量比色杯，所述反应混合物的终体积可以减少到1.6ml。反应混合物的终浓度保持不变的有0.2344mM BAEE缓冲液，62.8125mM磷酸钠缓冲液和0.0625mM HCl。
5单位定义以BAEE为底物，在25℃下pH7.6的3.2ml反应体积中，一个BAEE单位每分钟能够产生0.001的ΔA253nm。
6计算BAEE单位/ml胰蛋白酶＝ΔA253nm/(0.001)(0.2)0.001＝在25℃下的pH7.6的3.2ml反应混合物中一个单位胰蛋白酶的变化/分钟值。
0.2＝所用的胰蛋白酶体积(ml)(B)过氧化物酶测定1 原理过氧化物酶ABTS+H2O2 氧化的ABTS+2H2O
(线绿)(深绿)(ABTS＝2，2’-连氮基-双(3-乙基苯并三唑啉-6磺酸))2条件温度＝25℃，pH＝5.0，波长＝405nm3试剂3.1标准过氧化物酶测定(1)100mM磷酸钾缓冲液，25℃下pH5.0[试剂(1)](2)试剂(1)中的9.1mM ABTS底物溶液，新鲜配制(3)过氧化物酶稀释液(含0.25％(W/V)牛血清白蛋白和0.5％(v/v)Triton X-100的40mM磷酸钾缓冲液，25℃下pH6.8)(4)过氧化物酶溶液。
(临用前即刻配制，以冷的试剂(3)配制含0.5单位/ml的过氧化物酶溶液)(5)0.3％(w/w)过氧化氢溶液。
3.2喷雾前和后的过氧化物酶测定(6)空白溶液(a)将100μl的20％过氧化物酶稀释液80％PEG200加入到2ml过氧化物酶稀释液中(7)喷雾前溶液(a)将1ml过氧化物酶(12单位/ml)加入到20％过氧化物酶稀释液80％PEG200中(b)将100μl的7(a)加入到20％过氧化物酶稀释液80％PEG200(0.57单位/ml)中。
(8)后喷雾溶液(a)通过11.9kV喷嘴将100μl的(7a)以1μl/秒的流速喷雾到2ml过氧化物酶稀释液中
4操作4.1标准过氧化物酶测定空白2.9ml试剂2(ABTS)+50μl试剂3(过氧化物酶稀释液)+100μl试剂5(H2O2)检测2.9ml试剂2(ABTS)+50μl试剂4(过氧化物酶溶液)+100μl试剂5(H2O2)通过倒置立即混合并记录100秒内A450nm的增加。
4.2喷雾前和后的胰蛋白酶测定空白 2.9ml试剂(2)+50μl试剂(6a)+100μl试剂5(H2O2)喷雾前2.9ml试剂(2)+50μl试剂(7b)+100μl试剂5(H2O2)喷雾后2.9ml试剂(2)+50μl试剂(8a)+100μl试剂5(H2O2)通过倒置立即混合并记录100秒内A450nm的增加。
5单位定义在25℃ pH5.0下，一个单位每分钟氧化1.0μmole的ABTS6最终测定浓度在3.05ml的反应混合物中，最终浓度为96mM磷酸钾8.7mM ABTS0.01％(w/w)过氧化氢0.004％(w/v)牛血清白蛋白0.008％(v/v)Triton X-1007计算单位/ml过氧化氢酶＝(ΔA405nm)(3.05)/(36.8)(0.05)3.05＝测定液总体积(ml)36.8＝405nm处氧化的ABTS的微摩尔消光系数0.05＝所用过氧化氢酶的体积(ml)
权利要求
1.一种传递生物材料的方法，该方法包括提供一种含生物材料的液体制剂，将该液体制剂输送到一个出口并使从该出口流出的液体进入电场，由此导致该液体的电场流体动力学处理而不使该生物材料变性。
2.一种传递生物材料的方法，该方法包括提供一种含生物材料的液体制剂，将该液体制剂输送到一个出口并使从该出口流出的液体进入足以导致液体雾化而产生含生物材料的液滴的电场而不使该生物材料变性。
3.一种根据权利要求1或2的方法，它包括通过从含有在醇中不变性的生物材料的制剂中去除盐类来提供液体制剂，然后在该液体制剂被输送到出口之前将一种醇加入到该制剂中。
4.一种根据权利要求3的方法，它进一步包括在将所述液体制剂输送到出口之前向该液体制剂中加入一种酸。
5.一种根据权利要求4的方法，其中的酸是乙酸。
6.一种根据权利要求3、4或5的方法，其中的醇是乙醇或聚乙二醇。
7.一种根据权利要求1或2的方法，它包括在液体制剂被输送到出口之前，通过向含生物材料的制剂中加入表面活性物质来提供液体制剂。
8.一种根据权利要求1或2的方法，它包括在液体制剂被输送到出口之前，通过向含生物材料的制剂中加入聚合物来提供液体制剂。
9.一种根据权利要求1或2的方法，它包括通过向含生物材料的制剂中加入表面活性物质和聚合物来提供液体制剂，然后将所述液体制剂输送到出口。
10.一种通过处理相对高的传导率液体例如含有生物材料的含水制剂来传递生物材料的方法，该方法包括在所述液体中加入聚合物，然后将含聚合物的液体输送到出口，并使含聚合物的液体从出口流向足以形成锥形射流的电场。
11.一种根据权利要求8、9或10的方法，其中的聚合物具有至少40000的分子量。
12.一种根据权利要求8至11中任何一项的方法，其中的聚合物选自PVA、PVP、聚透明质酸盐、蔗聚糖和其它多糖如淀粉、纤维素和壳聚糖及其化学衍生物、Palaemon acid、改性胶原及其衍生物。
13.一种根据权利要求8至11中任何一项的方法，它包括加入0.2g/10ml的分子量为360000的PVP作为聚合物。
14.一种根据权利要求8、9或10的方法，其中所加入的聚合物是浓度范围为0.1-0.6g/10ml的分子量为360000的PVP。
15.一种根据权利要求8、9或10的方法，其中所加入的聚合物是制剂浓度范围为0.1-0.7g/10ml的分子量为125000的PVA。
16.一种根据权利要求8、9或10的方法，其中所加入的聚合物是浓度为10mg/ml的分子量为125000的PVA。
17.一种根据权利要求10至16中任何一项的方法，它还包括向制剂中加入表面活性物质。
18.一种根据权利要求7、9或17的方法，它包括加入选自溴化二月桂基二甲基铵、苯扎氯铵、吐温20、吐温80和Brij 30的物质作为表面活性物质。
19.一种根据权利要求1和3至18中任何一项的方法，其中所述电场引起液体的雾化作用。
20.一种根据权利要求8至18中任何一项的方法，其中所加入的聚合物的量是使从出口流向电场的含聚合物的液体能够导致纤维或纤丝的形成。
21.一种根据权利要求1至20中任何一项的方法，其中所述液体含有选自DNA、DNA片段、质粒、RNA、蛋白质、肽、激素、脂、酶和细胞因子的生物材料。
22.一种能够用电场流体动力学处理含有生物材料的含水制剂的方法，该方法包括从含水制剂中去除盐类，然后将醇和酸加入所述制剂中，再使液体从出口流向足以导致锥形射流形成的电场。
23.一种根据权利要求22的方法，它包括加入至少乙醇和聚乙二醇一种作为醇。
24.一种根据权利要求22或23的方法，它包括加入乙酸作为酸。
25.一种根据权利要求21、22或23的方法，其中加入醇的步骤包括加入醇以提供醇体积占70％、80％或最多可至90％的制剂。
26.一种根据权利要求21至25中任何一项的方法，它包括在加酸步骤中加入0.2至1mM的酸。
27.一种根据权利要求22至26中任何一项的方法，其中所述生物材料由DNA、DNA片段、质粒、RNA、蛋白质、肽、激素、脂、酶和细胞素因子中的至少一种组成。
28.一种能够用电场流体动力学处理含有至少一种DNA、DNA片段和质粒的含水制剂的方法，该方法包括从含水制剂中去除盐类，然后将乙醇和乙酸加入所述制剂中，再使液体从出口流向足以导致锥形射流形成的电场。
29.一种根据权利要求28的方法，它包括加入乙醇以便提供乙醇体积最高可达90％的制剂。
30.一种根据权利要求28的方法，它包括加入乙醇以便提供乙醇体积约占70％或80％的制剂。
31.一种根据权利要求28、29或30的方法，它包括加入0.2至1mM的乙酸。
32.一种能够用电场流体动力学处理相对高的传导率的液体如含水制剂的方法，该方法包括将表面活性物质加入该液体中，以使所述液体的表面活性物质浓度显著大于临界胶束浓度，然后使液体从出口流向足以导致锥形射流形成的电场。
33.一种处理相对高的传导率的液体如含水制剂的方法，该方法包括将表面活性物质加入该液体中以使表面活性物质浓度显著大于临界胶束浓度，然后将这种含表面活性物质的液体输送到出口并使含表面活性物质的液体从出口流向足以导致锥形射流形成的电场。
34.一种根据权利要求32或33的方法，它包括加入选自溴化二癸基二甲基铵、苯扎氯铵、吐温20、吐温80和Brij 30的物质作为表面活性物质。
35.一种根据权利要求32或33的方法，它包括加入约0.5％质量的溴化二月桂基二甲基铵作为表面活性物质。
36.一种根据权利要求32或33的方法，它包括加入0.1％质量的苯扎氯铵水溶液作为表面活性物质。
37.一种根据权利要求32或33的方法，它包括加入0.8％质量的吐温20水溶液作为表面活性物质。
38.一种根据权利要求32至37中任何一项的方法，其中所述液体含有生物材料例如至少一种DNA、DNA片段、质粒、RNA、蛋白质、肽、激素、脂、酶和细胞因子。
39.一种根据权利要求22至38中任何一项的方法，该方法包括向所述制剂中加入螯合剂或过氧化氢酶。
40.一种根据权利要求22至39中任何一项的方法，其中所述电场引起液体的雾化作用。
41.一种通过电场流体动力学处理含生物材料的液体制剂的传递生物材料的方法，它包括在电场流体动力学处理之前使所述生物材料与PEG结合。
42.一种根据权利要求22至41中任何一项的方法，其中所述液体含有选自至少一种DNA、DNA片段、质粒、RNA、蛋白质、肽、激素、脂、酶和细胞因子的生物材料。
43.根据上述权利要求中任何一项的方法，该方法包括控制液体从出口所流入的环境中的液体制剂中的溶剂的蒸气压。
44.一种处理液体的方法，它包括将液体输送至出口，使液体从出口流向电场以形成至少一种纤维、纤丝或液滴并控制液体流入的环境中的液体组分的蒸气分压。
45.一种处理含水液体制剂的方法，它包括将液体输送至出口，使液体从出口流向电场，以引起液体雾化而产生雾化物，并控制至少出口附近的湿度以控制雾化物的大小。
46.一种处理含水液体制剂的方法，它包括将液体输送至出口，以使液体流入空气中，使液体从出口流向电场以引起液体雾化而产生液滴，并干燥液体所流入的环境中或至少是出口附近的空气以导致液体蒸发而减小液滴的大小。
47.一种处理包括至少一种聚合物和至少一种挥发性组分的液体的方法，它包括将液体输送至出口，使液体从出口流向电场以引起至少一种聚合物纤维和纤丝的形成，并控制所述液体或所述液体中的至少一种挥发性组分在液体所流入的环境中或至少在出口附近的蒸气分压以控制纤维或纤丝的形成。
48.一种根据权利要求43或47的方法，它包括将至少一种挥发性组分输送到液体所流入的环境中或至少出口附近，以控制至少一种挥发性组分的蒸气分压。
49.一种根据权利要求48的方法，它包括提供一个用于供应挥发性组分的环绕出口的管套或环管。
50.一种根据权利要求49的方法，它包括将其它挥发性组分输送到管套或环管中。
51.一种根据权利要求49或50的方法，其中所述管套或环管包含吸收材料。
52.一种含有生物材料的相对高的传导率液体例如含水制剂的电场流体动力学处理方法，该方法包括将聚合物加入该液体中，然后使液体从出口流向足以引起锥形射流形成的电场。
53.一种处理含有生物材料的相对高的传导率液体例如含水制剂的方法，该方法包括将聚合物加入该液体中，然后将含聚合物的液体输送至出口并使含聚合物的液体从出口流向足以导致锥形射流形成的电场。
54.一种根据权利要求44至53中任何一项的方法，其中所述液体含有选自至少一种DNA、DNA片段、质粒、RNA、蛋白质、肽、激素、脂、酶和细胞因子的生物材料。
55.一种根据权利要求8、9或10至16中任何一项的方法，它包括使所述液体制剂流向负极性电场。
56.一种根据权利要求8、9或10至16中任何一项的方法，它包括将所述液体输送到两个液体出口并使液体从两个不同的出口流向相反极性的电场。
57.一种根据权利要求1或2的方法，它包括使所述生物材料与聚乙二醇(PEG)结合。
58.一种实施权利要求1至57中任何一项的方法的分配装置，该装置具有液体制剂贮库；与所述贮库连接并具有液体出口的输液管；以及使液体从液体出口流向电场以使从出口流出的液体形成锥形射流的电压供给装置。
59.一种分配装置，该装置具有一个外罩，其内含有液体制剂贮库；与所述贮库连接并具有液体出口的输液管；使液体从液体出口流向电场以使从出口流出的液体形成锥形射流的电压供给装置；以及用于向外罩内部输送溶剂或挥发性成分以增加它们的蒸气分压的输送装置。
60.一种根据权利要求59的装置，其中所述输送装置包括环绕输液管的环管或管套。
全文摘要
描述传递生物材料的方法，该方法包括提供含生物材料的液体配制步骤，将液体制剂输送到出口并使液体从出口流向电场，以在生物材料不变性条件下引起对该液体的电场流体动力学处理。在一个实施例中，提供一种通过去除含有在醇中不变性的生物材料的液体制剂中的盐的液体制剂，然后在该液体被传递到出口之前加入醇。可以在液体制剂被传递到出口之前将酸加入到液体制剂中。
文档编号B05B5/00GK1431919SQ01810590
公开日2003年7月23日 申请日期2001年4月3日 优先权日2000年4月3日
发明者L·A·达维斯, D·N·达维斯, M·万, R·A·科菲 申请人:巴特勒记忆研究所