专利名称：官能化发色聚合物点及其生物共轭体的制作方法
官能化发色聚合物点及其生物共轭体相关申请的交叉引用本申请要求2009年11月9日提交的美国临时申请第61/259，611号的权益，为所有目的明确通过参考完整地结合于此。关于联邦资助下研究或开发所得发明的权利的声明本发明是在美国政府支持下完成的，资助号为R21AG029574、R21CA147831和R01NS062725,由NIH授予。美国政府拥有本发明的一些权利。关于在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序清单附件的说明无发明背景 荧光探针在现代生物学和医学诊断中具有重要作用。小有机染料分子通常用于基于荧光的技术，如荧光显微法、流式细胞测量以及通用荧光分析和探测器。从历史上看，普通荧光团是荧光素、若丹明、香豆素和花青素等的衍生物。新生代荧光团如Alexa Fluor —般对光更稳定。但是，对于许多成像任务和超敏分析，它们的亮度和光稳定性无法提供足够的信号，以克服与细胞内的各种自发荧光和散射过程相关的背景。其他因素如闪烁和饱和发射速率也会给高速、高通量荧光分析带来困难。在理解生物系统方面的进步有赖于荧光显微法、流式细胞测量、通用细胞分析和生物探测器的应用(Pepperkok, R. ;Ellenberg, J. Nat. Rev. Mol. CellBiol. 2006, 7, 690-696; Giepmansj B. N. G. ; Adams, S. R. ; El I i sman，Μ· Η· ; Tsienj R.Y. Science 2006，312，217-224)。这些实验方法大量使用有机染料分子作为探针。但是，常规染料的固有局限，如低吸收性和不佳的光稳定性，给进一步开发高灵敏成像技术和高通量分析带来困难(Resch-Genger, U. ;Grabolle, Μ. ; Cavaliere-Jaricot, S. ;Nitschke, R.
;Nann, T. Nat. Methods 2008, 5, 763-775 ; Fernandez-Suarez, M. ; Ting, A. Y. Nat. Rev. Mol.Cell Biol. 2008，9，929-943)。因此，人们对开发亮度更高、光稳定性更好的荧光探针相当感兴趣。例如，无机半导体量子点(Q点)正处于活跃开发中，现在已能从生命技术公司(Life Technologies)[原英骏公司(InvitiOgen)]购得。Q点是多重靶标检测的理想探针，因为它们具有宽激发带以及可调的窄发射峰。与常规有机染料相比，它们具有改进的亮度和光稳定性(Bruchez，Μ.;Moronne, Μ. ;Gin, P. ;ffeiss, S. ;Alivisatos, A. P. Science 1998, 281, 2013-2016 ; Chan, ff.C. ff. ;Nie, S. M. Science 1998，281，2016-2018 ; Wu, X. Y. ;Liu, H. J. ;Liu, J. Q. ;Haley, K.N. ; Treadway, J. A. ; Larson, J. P. ; Ge, N. F. ; Peale, F. ; Bruchez, M. P. Nat. Biotechnol. 200
3,21, 452-452 ;Michalet, X. ;Pinaud, F. F. ;Bentolila, L. A. ; Tsay, J. M. ; Doose, S. ; Li, J.J. ; Sundaresan, G. ;ffu, A. M. ; Gambhir, S. S. ; Weiss, S. Science 2005，307，538-544)。但是，对于许多欠缺光子(photon-starved)的应用来说，Q点不够亮，因为它们的发射速率低，闪烁，非突光点的比例大(Yao, J. ; Larson, D. R. ; Vishwasrao, H. D. ; Zipfel, ff. R. ;ffebb, ff.ff. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005，102，14284-14289)。最近出现了开发无闪烁 Q 点的工作(Wang, X. Y. ; Ren, X. F. ; Kahen, K. ; Hahn, M. A. ; Rajeswaran, Μ. ;Maccagnano-Zacher, S. ; Silcox, J. ; Cragg, G. E. ; Efros, A. L. ;Krauss, T. D. Nature 2009，459，686-689),但对于体内应用来说，重金属离子的析出给它们造成的毒性依然是严重的问题。量子点是同一材料的无机半导体纳米晶体(例如CdSe/ZnS点),具有几纳米范围内的不同尺寸。由于量子约束效应，它们显示出范围可调的发光颜色。与常规染料相比，估计量子点的亮度高20倍，稳定性高100倍。但是，这些纳米粒子通常需要厚厚的包覆层，以达到所需水平的水溶性和生物相容性，因而对于粒度仅为3-6nm的活性荧光团粒子，纳米粒子的粒径约达15-30nm。包覆量子点的较大尺寸会显著改变生物分子的生物学功能和运输。量子点具有宽带吸收，且主吸收部分位于紫外区，这不适合多数基于激光的应用。量子点探针的另一个重要问题是它们因重金属Cd2+离子析出而具有毒性。紫外辐射能接近于CdSe纳米晶体的共价化学键能。因此，粒子会在公知的光解过程中溶解，将有毒的镉离子释放到细胞或亚细胞环境中。在为人的治疗目的而许可用于肿瘤或血管造影之前，必须对毒性问题严加审查。此外，低发射速率、闪烁和显著比例的非荧光点也带来潜在的问题，特别是对于单分子/粒子成像应用。另一种荧光纳米粒子是掺染料的乳胶球，与单一荧光分子相比，它具有改进的亮度和光稳定性，因为每个粒子具有多个染料分子，并且具有保护性乳胶基 体。(Wang, L. ; Wang, K. Μ. ; Santra, S. ; Zhao, X. J. ;Hilliard, L. R. ; Smith, J. E. ;ffu, J.R. ; Tan, ff. H. Anal. Chem. 2006, 78，646-654)但是，负载染料的珠粒也有很多局限，如自猝灭导致染料负载浓度有限(几个百分点)，较大的粒度(>30nm)会将利用能量转移报告分析物浓度的探测方案排除在外。从20年前被发现起，发光聚合物引起了广泛的兴趣。这些材料将聚合物的易加工性、突出的机械性能与半导体易调节的电学和光学性质结合起来，因而在发光二极管、场效应晶体管、光伏电池及其他光电子器件中具有广泛应用。在单光子和双光子激发之下，荧光聚合物点具有格外高的突光亮度(Wu, C. ; Szymanski, C. ;Cain，Z. ;McNeill, J. J. Am. Chem.Soc. 2007，129，12904-12905. C. ffu, B. Bull, C. Szymanski, K. Christensen, J. McNeill, ACSNano 2008，2，2415-2423)。在迄今为止的所有纳米粒子中，荧光聚合物点差不多具有最高的荧光亮度/体积比，因为半导体聚合物分子具有许多有利的特性，包括高吸收截面、高辐射率、高有效发色团密度和最低水平的聚集诱导荧光猝灭。用荧光聚合物点作为荧光探针还带来其他有用的优点，如没有可析入溶液的重金属离子。但是，要将这些探针用于生物成像或探测应用，还有一个重要问题需要解决，即表面官能化和生物共轭。因此，仍然需要开发荧光聚合物点，使其表面上具有官能团，以便能够将探针用于生物系统。表面官能化应保持或提高疏水性聚合物点的荧光亮度或光稳定性，不改变聚合物点在水性环境中的尺寸和长期单分散性，使聚合物点能够进一步共轭连接到各种类型的分子上，防止或最大程度抑制聚合物点与其他生物分子的非特异性结合，使聚合物点能够在商业规模上低成本、高效地生产。通过提供稳定的官能化发色聚合物点(P点)和它们的生物共轭体及其他方面，本发明满足了上述及其他要求。发明概述本发明一方面涉及官能化发色聚合物点。上述官能化发色聚合物点具有发色聚合物核和带有一个或多个官能团的官能化试剂帽(cap)。一方面，本发明提供了具有疏水性核和亲水性帽的官能化发色聚合物点。在一个实施方式中，官能化P点包含发色聚合物和两亲性分子，疏水性部分和亲水性部分连接到活性官能团上，其中发色聚合物嵌在P点的疏水性核内；一部分两亲性分子嵌在P点的核内，而活性官能团位于亲水性帽中。在一个优选的实施方式中，发色聚合物是半导体聚合物。另一方面揭示了聚合物点的生物共轭体。所述生物共轭体通过将生物分子连接到发色聚合物点的一个或多个官能团上形成。所述连接可以是直接的，也可以是间接的。又一方面揭示了制备官能化发色聚合物点的方法。所述方法包括将质子溶剂加入包含发色聚合物和官能化试剂(带有一个或多个官能团)的混合物的疏质子溶剂中。一方面，本发明提供了制备官能化发色聚合物点的方法，所述方法包括以下步骤(a)制备发色聚合物与连接到活性官能团上的两亲性分子在非质子溶剂中的混合物；(b)将全部或部分混合物注射到包含质子溶剂的溶液中，从而使发色聚合物和两亲性分子坍缩成纳米粒子；以及(C)从步骤(b)形成的混合物中除去非质子溶剂，从而形成官能化发色聚合物点的悬浮液，其中一部分两亲性分子嵌在纳米粒子核中，而活性官能团位于纳米粒子表面上。 另一方面，本发明提供了将生物分子共轭连接到官能化发色聚合物点上的方法，所述方法包括在适合将生物分子共轭连接到官能化发色聚合物点上的条件下，在包含聚乙二醇的溶液中对官能化发色聚合物点和生物分子进行温育，其中溶液中聚乙二醇的存在减少了生物分子在聚合物点表面上的非特异性吸附。又一方面，本发明提供了在生物样品中标记靶分子的方法，所述方法包括使生物样品接触发色聚合物点，所述发色聚合物点共轭连接到与靶分子特异性结合的靶向部分上。在另一个实施方式中，本发明提供了对细胞靶标进行生物正交标记的方法，所述方法包括使细胞祀标接触发色聚合物点，所述细胞祀标具有能参与生物正交化学反应的第一表面外露官能团。在一个特定的实施方式中，生物正交反应是用P点进行的点击化学反应(click chemistry reaction),所述P点带有能参与这种反应的活性官能团。在又一个实施方式中，本发明提供了具有红移发射峰(red-shifted emissionpeak)的发色聚合物点。在一个实施方式中，红移P点在远红区具有峰值发射。在其他实施方式中，红移P点在近红外区具有峰值发射。在一个实施方式中，红移P点包含PFTBT聚合物。在某些实施方式中，聚合物点包含两种或更多种不同发色聚合物的掺混物。例如，在一个实施方式中，P点包含PFBT和PFTBT聚合物的掺混物。
图I显示了制备本发明的官能化发色聚合物点及其生物分子共轭体的示意图。该示意图中画出了普通发色聚合物PFBT和两亲性官能化聚合物PS-PEG-C00H的化学结构。图2(A)显示了根据本发明方法制备的官能化发色PFBT点的原子力显微图(AFM)。(B)显示了从AFM图像得到的粒子高度柱状图。图3显示了根据本发明方法制备的官能化发色PFBT点的吸收和发射光谱。图4 (A)显示了先用一级抗-EpCAM温育，然后用与二级抗小鼠IgG抗体共轭连接的发色PFBT点温育的SK-BR-3癌细胞的荧光共焦图像。(B)显示了用与二级抗小鼠IgG抗体共轭连接的发色PFBT点温育的SK-BR-3癌细胞的荧光共焦图像。在对照(B)中没有使用一级抗体。图5 (A)显示了先用抗微管蛋白生物素一级抗体温育，然后用与链霉亲和素共轭连接的发色PFBT点温育的MCF-7癌细胞的荧光共焦图像。(B)显示了先用生物素抗微管蛋白一级抗体温育，然后用裸PFBT点温育的MCF-7癌细胞的荧光共焦图像。用没有共轭连接链霉亲和素的PFBT点作为对照。图6 (A)显示了本发明的一般化CP点，其中核可以是半导体聚合物、含发色团的非半导体聚合物(如染料、金属络合物等)、含光学惰性聚合物或无机功能材料的半导体聚合物或者它们的组合；帽可以是带有官能团的小分子、带有官能团的表面活性剂、带有官能团的脂质或者带有官能团的聚合物。帽和核可通过化学键合或物理缔合的方式保持在一 起。(B)显示了本发明的优选CP点，其中核可以是半导体聚合物、含发色团的非半导体聚合物(如染料、金属络合物等)、含光学惰性聚合物或无机功能材料的半导体聚合物或者它们的组合；帽包含具有疏水性部分和亲水性部分的两亲性聚合物。疏水性部分通过物理缔合或化学键合的方式嵌在核中，而拥有用于生物共轭连接的官能团的亲水性部分伸出来，以便进行生物共轭连接。 图7 (A)官能化PFBT点的典型AFM图像。(B)从官能化PFBT点的AFM图像上得到的粒子高度的柱状图。(C)用生物素二氧化硅珠粒所做的试验，用来验证通过EDC催化共价偶联实现的生物共轭连接。(D) IXPBS缓冲液中的PFBT点-链霉亲和素生物共轭体在存放6个月之后的吸收和荧光谱图，内插图显示了 P点-生物共轭体溶液在室光照射(左图)和紫外照射(右图)下的照片。图8 (A)PFBT点、(B) IgG-Alexa 488和(C) Q点565在相同激发条件下得到的单粒子荧光图。注意，IgG-Alexa和Q点565的色条必须设定为较低的值(8000个计数单位而不是60000个计数单位)，因为它们明显比PFBT点暗。比例尺代表5μπι。(D)在ImW的相同激发功率下观察，单P点跟单IgG-Alexa 488和单Q点的信号及背景对比。(E)在4mW的激发功率下，三种探针的单粒子荧光强度分布。P点约比IgG-Alexa 488或Q点亮约30倍。(F)单粒子光漂白轨迹。PFBT点(蓝色)未观察到闪烁，而Q点(红色)观察到频闪。图9用P点生物共轭体标记的人乳癌细胞中细胞表面标记物(EpCAM)的荧光图像。
(A)依次用抗EpCAM—级抗体和P点-IgG共轭体温育的活MCF-7细胞的图像。下方图片显示了单独用P点-IgG (无一级抗体)对细胞进行温育的对照样品。共焦荧光图像右侧显示了诺马斯基(Nomarski) (DIC)图像。比例尺代表20 μ m。(B)依次用抗EpCAM —级抗体、生物素化山羊抗小鼠IgG 二级抗体和P点-链霉亲和素共轭体温育的活MCF-7细胞的图像。下方图片显示了用抗EpCAM抗体和P点-链霉亲和素(无二级抗体)对细胞进行温育的对照样品。共焦荧光图像右侧显示了诺马斯基(DIC)图像。比例尺代表20μπι。图10荧光标记癌细胞的流式检测。(A)使P点-链霉亲和素标记的MCF-7细胞流过微流控流式细胞仪得到的荧光强度分布；激光激发从O. ImW变化到O. 5mW，再变化到lmW。
(B)Q点565-链霉亲和素标记的MCF-7细胞在与(A)所用的相同实验条件下得到的荧光强度分布。(C)利用微流控流式细胞仪得到的用P点-链霉亲和素和Q点-链霉亲和素标记的细胞的平均荧光亮度对比。(D)利用P点-IgG和Alexa 488-IgG进行如(A-C)所述的相同实验和对比。图11 (A)通过使P点-IgG标记的MCF-7细胞流过微流控流式细胞仪得到的荧光强度分布；激光激发从O. Imff变化到O. 5mff,再变化到lmW。(B) Alexa 488-IgG标记的MCF-7细胞在与(A)所用的相同实验条件下得到的荧光强度分布。图12 (A) Q点565-链霉亲和素标记的MCF-7细胞在低数值孔径宽场显微镜上得到的荧光图像。(B) P点-链霉亲和素标记的MCF-7细胞在与(A)所用的相同条件下得到的荧光图像。(C) P点标记的细胞与Q点标记的细胞的荧光强度分布对比。图13通过TCSPC装置测量的PFBT点的荧光衰减寿命(O. 6ns)。蓝线代表实验数据，绿线代表利用迭代反卷积法得到的拟合曲线。曲线下方显示了残差(红线)。图14用于生物正交标记的荧光半导体聚合物通过点击化学法进行的官能化和共轭过程。共聚物PSMA与荧光半导体聚合物如PFBT (如绿线所示)共缩合，从而形成具有表面羧基的P点。羧基使表面能进一步共轭连接功能性分子，用于铜(I)催化的点击反应。官能化P点有选择地成为哺乳动物细胞中新合成的蛋白质或糖蛋白(蓝线)的靶标，所述哺乳动物细胞用生物正交化学报告子进行代谢标记。 图15羧基官能化PFBT点的吸收和荧光谱图。图16PFBT P点在pH为4_9的HEPES缓冲液中的荧光强度。未观察到明显的变化。图17官能化P点的表征。(a)在铜(I)存在下，P点和Q点在紫外光照射下的荧光照片。(b)具有不同表面官能团的P点的迁移带(migration band)。(c)通过动态光散射测量的羧基官能化P点的流体力学直径；内插图显示了官能化P点的典型TEM图像。(d)利用炔-Alexa 594染料进行的荧光分析，证实P点成功地被叠氮基官能化。(e)通过点击反应偶联到叠氮基-P点上的炔-二氧化硅纳米粒子的单粒子荧光图像。比例尺代表50 μ m。图18在经AHA处理并用P点-炔探针标识的MCF-7细胞中新合成的蛋白质的荧光图像。(a-d)在铜(I)存在下的正P点标记。(e-h)在与(a-d)相同的条件下进行对照样品中的P点标记，但不存在使铜(II)生成铜(I)的还原剂(抗坏血酸钠)。上排显示了荧光图像；绿色荧光来自P点，蓝色荧光来自核染色剂Hoechst 34580。下排显示了诺马斯基(DIC)图像以及DIC和荧光合并图像。比例尺代表20 μ m。图19在与图18a_18d相同的条件下进行铜(I)催化的P点-炔标识，但在未接触AHA的细胞中进行。在此对照例中，未观察到细胞标记。上排显示了荧光图像；蓝色荧光来自核染色剂Hoechst 34580;未观察到来自P点的荧光(右上图)。下排显示了诺马斯基(DIC)图像(左下图)以及DIC和荧光合并图像(右下图)。比例尺代表20 μ m。图20在用P点-叠氮化物标识的MCF-7细胞中新合成的蛋白质的荧光图。(a_d )在经HPG处理的细胞中进行的铜(I)催化的阳性P点标记。(e-h)在与(a-d)相同的条件下进行对照样品中的P点标记，但在未接触HPG的细胞中进行。上排显示了荧光图像；绿色荧光来自P点，蓝色荧光来自核染色剂Hoechst 34580。下排显示了诺马斯基(DIC)图像以及DIC和荧光合并图像。比例尺代表20 μ m。图21在经GalNAz处理并用P点-炔探针标识的MCF-7细胞中的糖蛋白的荧光图像。(a-d)在铜(I)存在下进行的阳性P点标记。(e-h)在与(a-d)相同的条件下进行对照样品中的P点标记，但不存在铜(I)。上排显示了荧光图像；绿色荧光来自P点，蓝色荧光来自核染色剂Hoechst 34580。下排显示了诺马斯基(DIC)图像以及DIC和荧光组合图像。比例尺代表20 μ m。图22通过点击化学法进行生物共轭的三种方案。
图23基于聚芴聚合物的多色半导体聚合物点。虽然发射颜色可调至深红区，但主吸收在紫外区，以维持高荧光量子产率。主紫外吸收缘于芴单元占多数。左侧显示了这些聚合物的化学结构。图24捕光聚合物PFBT、发红光聚合物PF-0. ITBT和官能共聚物PSMA共缩合，形成具有表面羧基的强荧光PB点。羧基使表面能进一步共轭连接肿瘤特异性肽配体CTX。
图25 (A)PFBT和PF_0. ITBT聚合物的化学结构。(B)包含捕光PFBT给体聚合物和发红光PF-0. ITBT受体聚合物的PB点依赖于浓度的吸收光谱(左图)和发射光谱(右图)。在掺混比为O. 6 (PF-0. ITBT与PFBT之比)时，PB点在可见光区显示出宽吸收，并显示来自PFTBT的高效深红发射。上面显示了 PFBT和PF-0. ITBT的化学结构。(C)量子产量(QY)标准DCM染料和PB点的吸收光谱(左图)和荧光发射光谱(右图)。将水中的PB点和甲醇中DCM的吸收均调节至O. I。荧光光谱在相同的光谱仪条件下获得。图26 (a) PB点的吸收和发射光谱。内插图显示了水性PB点溶液在室光照射(左图)和紫外光照射(右图)下的照片。(b) Q点655纳米晶体的单粒子荧光图像。比例尺=4μ m。(c)PB点的单粒子荧光图像。图像在与Q点655相同的激发条件下获得，但90%的发射光用中性密度滤光片(OD=I)挡住，以免检测器饱和。比例尺=4μπι。(d)单粒子荧光强度分布。PB点约比Q点655探针亮约15倍。(e)羧基官能化PB点的TEM图像。比例尺=100nm。(f)官能化且生物共轭的PB点的凝胶电泳。与不同生物分子共轭连接的PB点在琼脂糖凝胶中显示出发生位移的迁移带，表明成功地实现了官能化和生物分子共轭。 图27分别包含捕光PFPV给体聚合物和两种发红光聚合物PF_0. IDHTBT、PF-0. ITBT的PB点的吸收光谱(左侧)和发射光谱(右侧)。左边显示了聚合物的化学结构。图28通过时间相关单光子计数仪(TCSPC)测量的PB点的荧光衰减寿命(3. 5ns)。黑线代表实验数据，红线是拟合曲线。图29通过动态光散射法[马尔文(Malvern) Zetasizer NanoZS粒度仪]测得的PFBT/PFTBT共混PB点的粒度分布。图30PFBT/PFTBT共混PB点在pH为4_9的HEPES缓冲液中的荧光强度。未观察到明显变化。图31(a)依次用抗EpCAM—级抗体、生物素化山羊抗小鼠IgG二级抗体和PB点-链霉亲和素共轭体温育的活MCF-7细胞的共焦图像。(b)在不用生物素化二级抗体的情况下，用于PB点细胞标记的阴性对照。a和b均显不了相衬图像(左图)和组合突光图像(右图)。红色荧光来自PB点，蓝色荧光来自核染色剂Hoechst 34580。比例尺=40 μ m。(c)从连续激光扫描20分钟得到的共焦荧光图像提取的光漂白曲线。(d)PB点对MilliQ水中生物相关离子和ROS的荧光稳定性。所示的Q点655纳米晶体用作参照。每种金属离子的浓度是500 μ M0对于ROS稳定性试验，H2O2和氯的浓度分别为1Χ10_ Ρ4Χ10-5。为防止凝聚，溶液含PEG。图32利用PS-COOH官能化的PFBT P点检测Cu2+和Fe2+的示意图。首先用作为鳌合基团的PS-COOH对PFBT P点进行官能化(A)。加入Cu2+和/或Fe2+，使P点发生凝聚和猝灭(B)。通过在溶液中加入EDTA，可使Cu2+诱导的凝聚发生逆转，但因结合Fe2+而凝聚的P点无法重新分散(C)。中间的内插图显示了各溶液在365nm灯下的照片。图33PS-C00H/PFBT共混P点在加入Cu2+之前(A)和之后(B)的TEM图像，显示了羧基官能化P点的Cu2+诱导凝聚。比例尺是200nm。(C)P点在加入Cu2+之前和之后以及加入EDTA之后的动态光散射测量结果。通过DLS测得的PFBT/PS-COOH共混P点在水中()和在含Cu2+的溶液中(圖)以及向含Cu2+的溶液中加入EDTA之后(圓)的流体力学直径。图34不同离子(20 μΜ)对含PS-C00H/PFBT共混P点和PFBT/PFTBT共混P点的溶液的荧光强度的影响。上面的图片显示了 365nm灯下的每个样品。图35 (A)各种浓度的Cu2+离子对含PS-C00H/PFBT共混P点和PFBT/PFTBT共混P点的溶液的荧光的影响。Cu2+的浓度范围是0-30 μ M :黑线0，红线100ηΜ，粉红线500ηΜ，金色线1μΜ，深紫线5μΜ，绿线10 μ Μ，橘色线20μΜ，蓝线30μΜ。(B) 540nm峰(来自PS-C00H/PFBT共混P点)与623nm峰(PFBT/PFTBT共混P点)之比与Cu2+浓度之间的关系曲线。红线是对数据的线性拟合(R2=0. 992)。(C)被Cu2+离子(30 μ Μ)猝灭之后的P点荧光强度可通过加入30 μ M EDTA来恢复。图36 (A)各种浓度的Fe2+对PS-C00H/PFBT共混P点在540nm的荧光的影响；溶 液同样包含PFBT/PFTBT共混P点(发射中心在623nm)作为内标。Fe2+的浓度是0_40 μ M 黑线:0，红线:10μΜ，绿线:15 μ Μ，粉红线:20μΜ，橘色线:25μΜ，蓝线:40μΜ。(B) 540nm峰(来自PS-C00H/PFBT共混P点)与623nm峰(PFBT/PFTBT共混P点)之比与Fe2+浓度之间的关系曲线。红线是对数据的线性拟合(R2=0. 996)。图37近红外(NIR)染料掺杂和官能化的CP点(可互换称作P点)的制备。发色聚合物PFBT、两亲性聚合物PS-PEG-C00H和NIR染料在THF中混合在一起，在声波作用下于水中共沉淀，形成NIR染料掺杂的P点。P点基体能吸收蓝光，并将能量转移给掺杂的NIR染料(绿色箭头所示)，然后掺杂的NIR染料产生强NIR荧光(红色箭头所示)。图38NIR染料掺杂和官能化的CP点(可互换称作P点)的表征。(A)NIR染料掺杂的P点的TEM图像。CP点的直径是18nm。比例尺50nm。(B)通过DLS测得的NIR染料掺杂的CP点的数均直径。(C)琼脂糖凝胶电泳。将裸PFBT点、羧基PFBT点和NIR染料掺杂的CP点装入含O. 7%琼脂糖和O. 2%PEG的琼脂糖凝胶中，在20mM HEPES中以lOV/cm的力移动15分钟。由于缺少羧基表面，裸PFBT点移动更慢。羧基PFBT点和NIR掺杂的CP点均在表面上包含羧基，移动更快。图39PFBT点、NIR染料和NIR染料掺杂的CP点(可互换称作P点)的激发和发射光谱。上图显示了 PFBT点(带阴影的黑色虚线)和NIR染料(带阴影的深黄色虚线)的激发光谱，以及PFBT点(蓝色实线)和NIR染料(红色实线)的发射光谱。下图显示了 NIR染料掺杂的CP点的激发(带阴影的黑色虚线)和发射(红色实线)。图40NIR染料掺杂的CP点(可互换称作P点)的荧光性质。(A)经历不同的NIR染料掺杂的NIR染料掺杂CP点的荧光光谱。(B) PFBT点(给体)的归一化发射光谱与NIR染料(受体)的归一化吸收光谱的重叠；给体与受体对之间的计算福斯特(Forster)半径(Rtl)是3. 7nm。(C)CP点的荧光寿命测量。裸CP点的寿命是2. 4ns(实验数据绿点，拟合蓝色实线)，掺杂NIR染料后缩短至I. 2ns (实验数据红点，拟合红色实线)。黑色实线代表内参比(IRF)。(D)P点基体中NIR染料的外加猝灭影响。未经染料掺杂的初始CP点(F。)与NIR染料掺杂的CP点(F)的荧光强度比与掺杂剂的浓度成正比(带误差线的空心点)。数据用斯特恩-沃尔墨(Stern-Volmer)方程拟合(实线)。(E)通过控制掺杂剂浓度来操纵NIR染料掺杂CP点的NIR发射。染料浓度的增加导致NIR发射减弱(红色柱)。带星号的黑色柱表示未经染料掺杂的CP点在546nm处的发射。图41CP点基体(可互换称作P点)内NIR染料的荧光促进。(A)游离NIR染料和掺杂NIR染料在450nm (蓝色柱)和763nm (黑色图案柱)激发的归一化荧光峰强度。游离NIR染料的荧光在THF中测量，其余的在20mM HEPES缓冲液(pH 7. 4)中测量。(B)荧光纳米材料在相同粒子浓度下的荧光发射。(C)通过粒子浓度归一化的荧光纳米材料的峰强度。图42NIR染料掺杂CP点的泄漏试验。利用778nm (受体)和546nm (给体)处的荧光发射峰值比的变化，可以监视NIR染料的泄露情况。(A)在室温下，在20mM HEPES缓冲液(pH 7. 4)中检测的染料泄露结果。NIR发射在72小时内保持不变(蓝色空心三角形)，72小时后受体-给体比稍降(红色空心方块)。(B)在37°C人血浆中检测的染料泄露结果。血浆中测得的数据(蓝色空心三角形)与20mM HEPES缓冲液中测得的数据(红色空心方块)相当。
图43制备CP点温度探测器的示意图。图44CP点温度探测器的TEM (A)和动态光散射(B)。图45CP点温度探测器的吸收和发射光谱。图46CP点PFBT-RhB (A)和PFPV-RhB (B)探测器在不同温度下的发射光谱。图47CP点温度探测器的强度-温度曲线及其线性拟合。图48CP点温度探测器的强度比-温度曲线及线性拟合。图49制备基于PPE P点的pH探测器的三条路径的示意图。(A)先在水中制备PS-SH/PPE共混P点，然后使之与FITC分子上的异硫氰酸酯部分反应。(B)先通过胺-异硫氰酸酯反应将FITC共轭连接到PS-NH2聚合物上，然后将所得的经荧光标记的PS聚合物与PPE聚合物掺混，形成PS-NH2-FITC/PPE共混P点。(C)先按与(A)相同的方式制备PS-SH/PPE共混P点，但随后偶联到荧光-5-马来酰亚胺上。PPE ■ 聚(2，5- 二(3’，V -二甲基辛基)亚苯基-1，4-亚乙炔基；PS :聚苯乙烯聚合物；FITC :荧光素异硫氰酸酯。图50 (A) PPE P点(深紫色虚线)和FITC (黑色虚线)在水中的紫外-可见光谱；PS-SH/PPE共聚物(红色实线)、PS-SH-FITC/PPE共聚物(蓝色实线)和PS_NH2_FITC/PPE共混P点在pH=7的HEPES缓冲液中的发射光谱。右上角的内插图显示了 PS-SH/PPE共混P点(左)和PS-SH-FITC/PPE共混P点溶液(右)在365nm紫外灯下的照片。(B) CP点pH探测器的透射电子显微图。(C) CP点寿命对比。图51 (A) P点(A)、(B) P点(B)和(C) P点(C)在5-8之间的不同pH下的荧光谱图(黑线pH=8,红线pH=7. 5,蓝线pH=7,绿线pH=6. 5,金色线pH=6,棕色线pH=5. 5,粉红线pH=5)。激发波长为390nm。图52三种荧光共轭P点的pH敏感性和可逆性。(A) P点(A) (·)、Ρ点(B) (■)和P点(C) (A)的发射比(I513mZI44tlnm)与pH的比例pH校正曲线。蓝线、黑线和红线分别是对 P 点(A) (R2=0.995)、P 点(B) (R2=O. 991)和 P 点(C) (R2=O. 994)的数据的线性拟合。P点CA),P点(B)和P点(C)的斜率分别是O. 37,0. 18和O. 29。(B)当pH在5. O与8. O之间反复来回变化时P点(C)的强度比(I513mZI44tlnm),说明PH检测的可逆性和重现性。图53给体(即PPE)发射与受体(即FITC)吸收之间光谱重叠的图示；以及它们的计算福斯特距离Ro。(A) PS-SH-FITC/PPE共混P点的发射光谱(浅绿色虚线)和pH从5到8时FITC的激发光谱。为了更容易观察光谱的重叠，曲线下方的区域填充了颜色。(B)根据(A)所示的重叠积分，绘制了 PPE-FITC在不同pH下的相应福斯特距离。图54 用 PPE P 点(A-C)和 PS-SH-FITC/PPE 共混 P 点(E-G)标记的海拉(HeLa)细胞的共焦扫描显微图像；及其分别示于(D)和(H)中的相应明视场图像。图(A)和(E)所示的蓝色荧光通过对P点在433-444nm之间的光谱区积分得到，而图(B)和(F)所示的绿色荧光通过在507-518nm之间积分得到。图(C)和(G)是蓝色荧光与绿色荧光的重叠。图55用P点(B) (A-C)和P点(C) (E-G)标记的海拉细胞在λ激发=405nm时的共焦显微图像；它们相应的明视场图像分别示于(D)和(H)。图(A)和(E)中所示的蓝色通道通过对433-444nm之间的光谱区积分得到，而图(B)和(F)中的绿色通道在507_518nm之间得到。(C)和(G)中的图像是蓝色和绿色通道的重叠。内插图显示了单个海拉细胞的放大图。比例尺是20 μ m。
具体实施例方式导言 由于包括发光二极管、场效应晶体管和光伏器件在内的各种光电子应用，半导体聚合物成为引人瞩目的材料(参见例如Friend, R. H. ; Gymer, R. ff. ; Holmes, A.
B.; Burroughes, J. Η. ; Marks, R. N. ; Tal iani, C. ; Bradley, D. D. C. ; Dos Santos, D.
A.; Bredas, J. L. ; Loglund, M. ; Salaneck, ff. R. Nature 1999, 397, 121; Gunes, S. ; Neugebauer, H. ; Sariciftci, N. S. Chem. Rev. 2007, 107, 1324-1338,其内容为所有目的通过参考完整地结合于此。)它们的吸引力在于将半导体易调节的电学和光学性质与聚合物的易加工性结合起来。人们还证实，水溶性半导体聚合物是高度灵敏的生物探测器和化学探测器(参见例如 Chen, L. ;McBranch, D. ff. ;ffang, H. L. ; Helgeson, R.;ffudl, F. ; Whitten, D. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999，96，12287-12292 ; Fan, C.H. ; Wang, S. ; Hong, J. ff. ; Bazan, G. C. ; Plaxco, K. ff. ; Heeger, A. J. Proc. Natl. Acad.Sci. USA USA 2003，100，6297-6301; Thomas, S. ff. ; Joly, G. D. ; Swager, T. M. Chem.Rev. 2007, 107, 1339-1386，其内容为所有目的通过参考完整地结合于此)。由于半导体聚合物纳米粒子早就得到证实(Szymanski, C. ;ffu, C. ;Hooper, J.;Salazar, M. A. ;Perdomo, A. ;Dukes, A. ;McNeill, J. D. J. Phys. Chem. B 2005, 109, 8543-8546;ffu, C. ; Szymanski, C. ;McNeill, J. Langmuir2006, 22, 2956-2960,其内容为所有目的通过参考完整地结合于此)，此领域进展迅速，包括其复杂光物理性质的表征(参见例如 Palacios, R. E. ; Fan, F. R. F. ; Grey, J. Κ. ; Suk, J. ; Bard, A. J. ; Barbara, P. F. Nat. Mater. 2007, 6, 680-685;ffu, C. ; Zheng, Y. ; Szymanski, C. ;McNeill, J. J. Phys. Chem. C 2008,112,1772-1781;ffu, C. ;McNei11，J. Langmuir 2008,24,5855-5861;Collini, E. ;Scholes, G. D. Science 20 09 , 323 , 369-3 7 3，其内容为所有目的通过参考完整地结合于此)及其在生物成像和高分辨率单粒子示踪方面的发展[参见例如Wu，C.等，J. J. Am. Chem.Soc. 2007，129，12904-12905 ;ffu, C.等，· J. ACS Nano 2008，2，2415-2423; Wu, C.;等，Chem.Int. Ed. 2009，48，2741-2745; Moon, J. H.等，Chem. Int. Ed. 2007，46，8223-8225; Baier, Μ.
C.^ , Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14267-14273;Abbel,R.;等，J. Chem.Commun. 2009，1697-1699 ; Pu, Κ. Y.等，Chem. Mater. 2009，21，3816-3822 ; Yu, J.等,J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 18410-18414;Howes, P.等,J. Am. Chem.Soc. 2010，132，3989-3996; and Kim, S.等，Chem. Commun. 46，1617-1619 (2010)，其内容为所
有目的通过参考完整地结合于此]。本发明的各个方面涉及一类称作官能化发色聚合物点(官能化CP点或P点)的新型官能化荧光探针及其生物分子共轭体，用于各种应用，包括但不限于流式细胞测量、荧光激活分选、免疫荧光、免疫组织化学、荧光多路技术、单分子成像、单粒子示踪、蛋白质折叠、蛋白质转动力学、DNA和基因分析、蛋白质分析、代谢物分析、脂质分析、基于FRET的探测器、高通量筛选、细胞成像、体内成像、基于荧光的生物分析如免疫分析和基于酶的分析，以及生物分析和测量中的各种荧光技术。官能化发色聚合物点的独特性质的基础在于但不限于个体粒子的高荧光亮度、大吸收截面、高荧光量子产率、快发射速率、高偏振荧光、优异的光稳定性和易储存性。与合适的生物分子共轭连接后，探针可用于许多领域，包括但不限于流式细胞测量、荧光激活分选、免疫荧光、免疫组织化学、荧光多路技术、单分子成像、单粒子示踪、蛋白质折叠、蛋白质转动力学、DNA和基因分析、蛋白质分析、代谢物分析、脂质分析、基于FRET的探测器、高通 量筛选、细胞成像、体内成像、基于荧光的生物分析如免疫分析和基于酶的分析，以及生物分析和测量中的各种荧光技术。本发明的其他优点和特征将在以下描述中指出，其中一部分通过该描述不难理解，或者可通过实施本发明而了解。我们做实验验证了本发明，下面将在描述和实施例中结合附图进行阐述。P点在单光子和双光子激发下均表现出格外高的荧光亮度。它们的亮度来自半导体聚合物分子的许多有利特性，包括其大吸收截面、快发射速率和高荧光量子产率。最近的研究也表明，作为荧光探针的P点是光稳定的，并且在不同细胞分析中没有细胞毒性(参见例如 Wu, C. ;Bull, B. ; Szymanski, C. ; Christensen, K.;McNeill, J. ACS Nano 2008, 2, 2415-2423 ; Pu, Κ. Y. ;Li, K. ;Shi, J. B. ;Liu, B. Chem.Mater. 2009, 21, 3816-3822; Rahim, N. A. A. ; McDaniel, ff. ; Bardon, K. ; Srinivasan, S. ; Vickerman, V. ; So, P. T. C. ;Moon, J. H. Adv. Mater. 2009，21，3492-3496，其内容为所有目的通过参考完整地结合于此)。但是，对于广泛的生物应用而言，P点尚有一个重要的问题没有解决，即如何控制其表面化学性质和共轭连接生物分子。虽然人们在努力研究二氧化硅或磷脂包封时已经得到具有表面官能团的复合粒子(参见例如Wu, C. ; Szymanski, C. ;McNeill, J.Langmuir 2006, 22, 2956-2960 和 Howes, P. ; Green, Μ. ; Levitt, J. ; Suhling, K. ; Hughes,M. J. Am. Chem. Soc. 2010，132，3989-3996)，但迄今为止，在用P点标记细胞方面报告的所有结果大概都基于内曬作用(参见例如Wu, C. ;Bull, B. ; Szymanski, C. ; Christensen, K.;McNeill, J. ACS Nano 2008, 2, 2415-2423 ;Pu, Κ. Y. ;Li, K. ;Shi, J. B. ;Liu, B. Chem. Mater.2009, 21, 3816-3822 ; Howes, P. ; Green, M. ; Levitt, J. ; Suhling, K. ; Hughes, M. J. Am. Chem.Soc. 2010, 132, 3989-3996;和 Rahim, N. A. A. ; McDaniel, ff. ; Bardon, K. ; Srinivasan, S. ; Vickerman, V. ; So, P. T. C. ;Moon, J. H. Adv. Mater. 2009，21，3492-3496)，与为有机荧光团和 Q点建立的标记方法相比，这是效果和特异性差很多的方法。现在仍不清楚能否使P点探针具有足够的特异性，以识别细胞靶标，用于有效标记。目前，这个问题严重阻碍了 P点在生物应用领域的广泛使用。
有利的是，本发明为P点的生物共轭连接和特异性细胞寻靶的相关问题提供了解决方案。一方面，本发明提供了通过共价键将P点连接到生物分子上的新型共轭连接方法，用来通过特异性抗原-抗体或生物素-链霉亲和素相互作用标记细胞靶标。这种官能化和生物共轭策略可容易地应用于任何疏水性荧光半导体聚合物。如本文提供的实施例所示，通过本文提供的方法共轭连接的P点生物共轭体可用于单粒子成像、细胞成像和流式细胞测量实验，并且阐述了它们相对于常规有机荧光团和Q点探针的优点。因此，此项工作为在生物应用领域采用各种高荧光、光稳定和无毒性P点生物共轭体开辟了一条新的实用路径。一方面，本发明基于对P点进行官能化的新策略，包括在纳米粒子形成过程中疏水相互作用的驱动下，将多相聚合物链捕集到单点中。少量带官能团的两亲性聚合物与半导体聚合物共缩合，对纳米粒子表面进行修饰和官能化，用于后面与生物分子如链霉亲和素和免疫球蛋白G (IgG)的共价键共轭连接。P点生物共轭体可通过特异性的方式有效标记细胞靶标，如人乳癌细胞中的细胞表面标记物，而不发生任何可检测到的非特异性结合。单粒子成像、细胞成像和流式细胞测量实验表明，P点的荧光亮度比Alexa染料和量子点探 针的荧光亮度高得多。这些超亮纳米粒子的成功生物共轭连接为将通用半导体聚合物应用于现代生物和生物医药中的各种荧光测量提供了新机遇。一方面，提供了带有官能团的高荧光半导体聚合物点，所述官能团可通过共价键共轭连接生物分子。使这些P点官能化的策略基于在纳米粒子形成过程中疏水相互作用的驱动下，将多相聚合物链捕集到单点中。本文显示，少量带官能团的两亲性聚合物可与半导体聚合物共缩合，从而对纳米粒子表面进行修饰和官能化。接下来，利用标准碳二亚胺偶联化学技术，进行对生物分子如链霉亲和素和抗体的共价共轭连接。这些P点生物共轭体通过特异性方式有效标记活细胞和固定细胞中的细胞表面受体和亚细胞结构，而不发生任何可检测到的非特异性结合。进行单粒子成像、细胞成像和流式细胞测量，通过实验评价P点的性能，证明它们相比于Alexa-IgG和Q点探针的高细胞标记亮度。这些结果带来一类新的高荧光纳米粒子生物共轭体，可广泛用于以荧光为基础的生物检测。定义本文所用的术语“发色纳米粒子”或“发色聚合物点”是指包含一种或多种发色聚合物、已经坍缩成稳定的亚微米尺寸的粒子的结构。本发明提供的发色纳米粒子可通过本领域已知的使聚合物坍缩的任何方法形成，包括但不限于依赖于沉淀的方法，依赖于形成乳液(例如细乳液或微乳液)的方法，以及依赖于缩合的方法。在一个优选的实施方式中，发色纳米粒子通过纳米沉淀形成。本文所用的“聚合物”是由至少两个重复结构单元构成的分子，这些单元一般通过共价化学键连接。聚合物一般具有伸长的分子结构，包含任选含有侧基的主链。它包括线形聚合物和支化聚合物，如星形聚合物、梳形聚合物、刷形聚合物、梯形聚合物和树枝形聚合物。本文所用的术语“发色聚合物”是至少有一部分包含发色单元的聚合物。术语“发色团”具有它在本领域的普通含义。发色团吸收从紫外到近红外区的某个波长的光，可发射光，也可不发射光。本发明中的“发色单元”包括但不限于具有离域π电子的结构单元，小有机染料分子单元，以及金属络合物单元。相应地，发色聚合物的例子包括含有带离域H电子的结构单元的聚合物，如半导体聚合物，含有小有机染料分子单元的聚合物，含有金属络合物单元的聚合物，以及含有它们的组合单元的聚合物。本文所用的术语“官能团”是指能例如通过任何稳定的物理或化学缔合方式连接到发色聚合物上，从而使发色聚合物点的表面可用于共轭连接的任何化学单元。官能团的非限制性例子包括羧酸、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、炔、张力炔(strainedalkyne)、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔、膦基、它们的取代衍生物及其组合。本文所用的术语“官能化试剂”是指能例如通过任何稳定的物理或化学缔合方式连接到发色聚合物点的核上，在聚合物点表面上提供官能团的任何分子。本文所用的术语“亲水性官能团”是指具有亲水性的官能团，或者与亲水性侧链或亲水性部分连接的疏水性官能团，所述亲水性侧链或亲水性部分使疏水性官能团更具亲水 性，有利于疏水性官能团排布在发色聚合物点粒子表面上，而不是被包埋在发色聚合物点的疏水性核内部。可通过连接亲水性侧链或部分而更具亲水性的疏水性官能团的例子包括但不限于炔、应变炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基，(对于点击化学)它们连接到亲水性侧链如PEG (聚乙二醇)上，或者连接到其他任何亲水性侧链上。本文所用的术语“生物正交反应”是指能在生物系统内通过与外来探针发生高选择性反应而得到修饰的非天然、无扰动化学把柄(non-native, non-perturbing chemicalhandle)之间的共轭。最广为人知的生物正交反应方案称作点击化学。对于生物正交反应方案的综述，参见例如，Best MD, Biochemistry. 2009 年 7 月 21 日；48 (28) : 6571-84，其内容为所有目的通过参考完整地结合于此。本文所用的术语“点击化学”是本领域所广为人知的，它描述一系列异常可靠的自导向有机反应，如最广为人知的铜催化叠氮化物-炔[3+2]环加成。点击化学反应的非限制性例子可参见例如 H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int.Ed. 2001, 40, 2004 和 E. M. Sletten, C. R. Bertozzi, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974,其内容为所有目的通过参考完整地结合于此。本文所用的术语“交联剂”用来描述能在相似或不同分子上的分子基团之间形成化学键，从而使分子共价结合的化合物。常见交联剂的例子是本领域所熟知的。参见例如《生物共轭技术》(Bioconjugate Techniques)[美国纽约学术出版社(Academic Press),1996年及以后版本]，其内容为所有目的通过参考完整地结合于此。通过使用“连接剂”分子，例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、生物素或类似分子，可使生物分子直接连接到单价发色聚合物点上。本文所用的“抗体”是指一种多肽，它包含来自免疫球蛋白基因或其片段的构架区，所述免疫球蛋白基因或其片段与抗原发生特异性结合并识别抗原。广为人知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链归为K或λ。重链归为Y、μ、α、δ或ε ,它们反过来将免疫球蛋白种类分别限定为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性及亲和性方面是最关键的。抗体可以是多克隆或单克隆的，来自血清、杂交瘤，或者重组克隆，也可以是嵌合抗体、灵长源抗体或人源化抗体。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端限定约有100-110个或更多个氨基酸的可变区，这些氨基酸主要负责识别抗原。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。抗体以例如完整的免疫球蛋白存在，或者以利用各种蛋白酶消化产生的许多明确的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体，产生Fab的二聚体F(ab) ’2,Fab本身是通过二硫键与Vh-ChI连接的轻链。F(ab) ’2可在温和条件下还原，断开铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’2 二聚体转化为F(ab)’单体。F(ab)’单体实质上是带部分铰链区的Fab[参见《基础免疫学》(Fundamental Immunology) (Paul主编，第3版，1993年)]。虽然各种抗体片段是通过完整抗体的消化来定义的，但技术人员不难认识到，这 种片段可通过化学方法或者利用重组DNA技术从头合成。因此，本文所用的术语抗体也包括通过修饰完整抗体所产生的抗体片段，或者利用重组DNA技术从头合成的抗体片段(例如单链Fv),或者利用曬菌体展示库(phage display libraries)识别的抗体片段[参见例如 McCafferty 等，Nature, 348:552-554(1990)]。官能化发色聚合物点一方面，本发明提供了官能化发色聚合物点，所述官能化发色聚合物点包含核和帽。“核”包含至少一种发色聚合物。“帽”包含官能化试剂。官能化试剂通过物理结合或化学键合的方式连接到发色聚合物核上，并在发色聚合物点上提供用于生物共轭连接的表面官能团。在另一个实施方式中，官能化发色聚合物点仅包含与促进生物共轭连接的官能团共价连接的核。一方面，本发明提供了包含核和帽的官能化发色聚合物点(P点)，所述帽包含带有一个或多个官能团的官能化试剂，前提是所述帽不全是有机硅酸盐/酯。在一个具体实施方式
中，帽不含有机硅酸盐/酯。在一个实施方式中，本发明提供了一种官能化发色聚合物点，所述官能化发色聚合物点包含大小约为I-IOOOnm的发色聚合物核和两亲性官能化层，其中疏水性部分通过疏水性相互作用永久地锚定在聚合物点核上，而亲水性官能团如羧酸在溶液里延伸，供进一步进行生物共轭连接。在一个具体实施方式
中，本发明提供了具有疏水性核和亲水性帽的官能化发色聚合物点(P点)，所述P点包含(a)发色聚合物；以及(b)具有疏水性部分和连接到活性官能团上的亲水性部分的两亲性分子，其中发色聚合物嵌在P点的疏水性核内；一部分两亲性分子嵌在P点的核内，而活性官能团位于亲水性帽中。在一个优选的实施方式中，发色聚合物是半导体聚合物。在本发明提供的发色聚合物点的一个实施方式中，活性官能团选自羧基、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯及其衍生物。在一个具体实施方式
中，活性官能团是包含炔的部分、包含叠氮基的部分或者其他能通过点击化学反应共轭连接到分子上的部分。在一个实施方式中，发色聚合物是半导体均聚物。许多半导体均聚物是本领域已知的，包括但不限于芴聚合物、亚苯基亚乙烯基聚合物、亚苯基聚合物、亚苯基亚乙炔基聚合物、苯并噻唑聚合物、噻吩聚合物、咔唑芴聚合物、硼-二吡咯亚甲基聚合物及其衍生物。表I给出了常见半导体聚合物及其衍生物的列表。表I.半导体聚合物的非限制性例子
权利要求
1.一种官能化发色聚合物点(P点)，它包含 核和帽，其中所述核包含发色聚合物，所述帽包含带有一个或多个官能团的官能化试齐 ，前提是所述帽不全是有机硅酸盐/酯。
2.如权利要求I所述的官能化发色聚合物点(P点)，具有疏水性核和亲水性帽，所述P点包含 (a)发色聚合物；以及 (b)两亲性分子，具有疏水性部分和连接到活性官能团上的亲水性部分， 其中所述发色聚合物嵌在P点的疏水性核内；并且 所述两亲性分子的一部分嵌在P点的核内，所述活性官能团位于亲水性帽中。
3.如权利要求I或2所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点包含发色聚合物的掺混物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述发色聚合物是半导体聚合物。
5.如权利要求4所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述纳米粒子包含半导体聚合物的掺混物。
6.如权利要求5所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述半导体聚合物的掺混物包括PF-TBT半导体聚合物。
7.如权利要求6所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述PF-TBT半导体聚合物是PF-O. ITBT。
8.如权利要求1-7中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性分子与发色聚合物的重量比约为1%-50%。
9.如权利要求8所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性分子与发色聚合物的重量比约为5%-25%。
10.如权利要求2-8中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性分子的亲水性部分包含聚亚烷基二醇。
11.如权利要求10所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
12.如权利要求1-11中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性分子是两亲性聚合物。
13.如权利要求12所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性聚合物是两亲性梳形聚合物。
14.如权利要求12或13所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性聚合物是聚乙二醇接枝的聚苯乙烯。
15.如权利要求14所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性聚合物的聚乙二醇部分连接到一个或多个羧基上。
16.如权利要求12或13所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性聚合物是苯乙烯-马来酸酐共聚物。
17.如权利要求12或13所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性聚合物是半导体聚合物。
18.如权利要求12或13所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性聚合物是非半导体聚合物。
19.如权利要求2-18中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述两亲性聚合物的亲水性部分连接到超过一个活性官能团上。
20.如权利要求1-18中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述活性官能团选自下组羧基、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、四嗪、张力烯、环辛炔、膦基及其衍生物。
21.如权利要求20所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述活性官能团是炔、叠氮基、张力炔、二烯、烯烃、四嗪、张力烯、环辛炔、膦或其他能通过生物正交反应共轭连接到分子上的部分。
22.如权利要求21所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述生物正交反应是点击化学反应。
23.如权利要求1-22中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点还包含嵌在纳米粒子核内的选自下组的组分荧光染料、无机发光材料、磁性材料和金属。
24.如权利要求1-23中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述生物分子共轭连接到聚合物点表面的活性官能团上。
25.如权利要求24所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述生物分子包含选自下组的分子合成或天然蛋白质、糖蛋白、多肽、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂质、脂肪酸及其组合。
26.如权利要求25所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述生物分子是多肽或核酸。
27.如权利要求25所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述生物分子是抗体。
28.如权利要求25所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述生物分子是适配体。
29.如权利要求1-28中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点进一步共轭连接到一个或多个非活性化学基团上。
30.如权利要求29所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述非活性化学基团是水溶性聚合物。
31.如权利要求30所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述水溶性聚合物是聚乙二醇。
32.如权利要求1-31中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点在约700-1500nm之间具有峰值发射。
33.如权利要求1-31中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点在约600-700nm之间具有峰值发射。
34.如权利要求1-33中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点共轭连接到温敏染料上。
35.如权利要求1-33中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点共轭连接到PH敏感染料上。
36.如权利要求1-33中任一项所述的官能化发色聚合物点，其特征在于，所述聚合物点共轭连接到钙敏感染料上。
37.一种制备官能化发色聚合物点的方法，所述方法包括以下步骤将发色聚合物和连接到活性官能团上的两亲性分子在非质子溶剂中溶剂化的混合物加入包含质子溶剂的溶液中。
38.如权利要求37所述的方法，所述方法还包括以下步骤 (a)在非质子溶剂中制备发色聚合物和连接到活性官能团上的两亲性分子的混合物； (b)将全部或部分混合物注射到包含质子溶剂的溶液中，从而使发色聚合物和两亲性分子坍缩成纳米粒子；以及 (c)从步骤(b)形成的混合物中除去疏质子溶剂，从而形成官能化发色聚合物点的悬浮液， 其中两亲性分子的一部分嵌在聚合物点的核内，活性官能团位于聚合物点表面上。
39.如权利要求38所述的方法，它还包括以下步骤 (d)过滤悬浮液，分离特定尺寸的聚合物点群。
40.如权利要求38或39所述的方法，其特征在于，所述疏质子溶剂的沸点低于所述质子溶剂的沸点，所述疏质子溶剂通过氮气汽提从步骤(b)形成的混合物里除去。
41.如权利要求37-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述质子溶剂是水。
42.如权利要求37-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述发色聚合物是半导体聚合物。
43.如权利要求37-42中任一项所述的方法，其特征在于，在将所述混合物加入所述包含质子溶剂的溶液之前，所述两亲性聚合物进一步通过活性官能团共轭连接到效应分子上。
44.一种将生物分子共轭连接到官能化发色聚合物点上的方法，所述方法包括在适合将 >所述生物分子共轭连接到所述官能化发色聚合物点上的条件下，在包含屏蔽剂的溶液里用所述生物分子温育所述官能化发色聚合物点， 其中溶液中屏蔽剂的存在减少了生物分子在聚合物点表面上的非特异性吸附。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述屏蔽剂是聚亚烷基二醇。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述屏蔽剂是洗涤剂。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂是曲通X-100。
49.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述屏蔽剂是碳水化合物。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物是葡聚糖。
51.如权利要求44-50中任一项所述的方法，其特征在于，所述官能化发色聚合物点包含 (a)发色聚合物；以及 (b)连接到活性官能团上的两亲性分子， 其中所述两亲性分子的一部分嵌在聚合物点的核内，所述活性官能团位于聚合物点表面上。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述发色聚合物是半导体聚合物。如权利要求51或52所述的方法，其特征在于，所述两亲性聚合物连接到超过一个活性官能团上。
53.如权利要求44-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述官能团是羧基。
54.—种在生物样品中标记靶分子的方法，所述方法包括使生物样品接触生物共轭发色聚合物点， 其中所述生物共轭发色聚合物点包含 (a)发色聚合物；以及 (b)通过活性官能团连接到靶向部分上的两亲性分子， 其中所述两亲性分子的一部分嵌在聚合物点的核内，所述靶向部分位于聚合物点表面上。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述发色聚合物是半导体聚合物。
56.如权利要求54或55所述的方法，其特征在于，所述两亲性聚合物连接到超过一个活性官能团上。
57.如权利要求54或55所述的方法，其特征在于，所述靶分子是存在于细胞表面上的受体。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述细胞是癌细胞。
59.如权利要求54-58中任一项所述的方法,其特征在于,所述祀向部分是多肽或核酸。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述靶向部分是抗体。
61.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述靶向部分是适配体。
62.一种对细胞靶标进行生物正交标记的方法，所述方法包括使细胞靶标接触官能化发色聚合物点，所述细胞靶标具有能参与生物正交反应的第一表面外露官能团， 其中所述官能化发色聚合物点包含 (a)半导体聚合物；以及 (b)连接到第二官能团上的两亲性分子，所述第二官能团能够在生物正交反应中与所述第一官能团反应， 其中所述两亲性分子的一部分嵌在聚合物点的核内，所述第二官能团位于聚合物点表面上。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述两亲性分子连接到超过一个活性官能团上。
64.如权利要求62或63所述的方法，其特征在于，所述生物正交反应是点击化学反应。
65.如权利要求62-64中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞靶标是包含非天然氨基酸的多肽，所述非天然氨基酸的侧链含有炔基。
66.如权利要求62或64所述的方法，其特征在于所述细胞靶标是包含非天然氨基酸的多肽，所述非天然氨基酸的侧链含有叠氮基。
67.如权利要求62-66中任一项所述的方法,其特征在于,所述第二官能团选自下组炔、叠氮化物、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、四嗪、张力烯、环辛炔和膦基。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述第二官能团是炔基。
69.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述第二官能团是叠氮基。
70.一种包含半导体聚合物的掺混物的发色聚合物点，其中所述半导体聚合物之一是PFTBT共聚物。
71.如权利要求70所述的发色聚合物点，其特征在于，所述半导体聚合物的掺混物包含 PFBT 和 PF-0. ITBTT。
72.如权利要求71所述的发色聚合物点，其特征在于，PFBT与PF-0.ITBT之比最多为19:1。
73.如权利要求72所述的发色聚合物点，其特征在于，PFBT与PF_0.ITBT之比最多为9:1。
74.如权利要求70-73中任一项所述的发色聚合物点，其特征在于，所述发色聚合物点还包含连接到活性官能团上的两亲性分子，其中所述两亲性分子的一部分嵌在聚合物点的核内，所述活性官能团位于聚合物点表面上。
全文摘要
除其他方面外，本发明提供了包含疏水性核和亲水性帽的官能化发色聚合物点及其生物共轭体。本发明还提供了制备官能化发色聚合物点的改进方法。本文还揭示了用于体内成像和分子标记的方法。
文档编号C09K11/02GK102791827SQ201080060982
公开日2012年11月21日 申请日期2010年11月9日 优先权日2009年11月9日
发明者D·T·邱, J·麦克内尔, 于江波, 吴长锋 申请人:克莱姆森大学, 华盛顿大学商业化中心