专利名称：从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取方法，尤其是一种从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法。
背景技术：
蓝莓为杜鹃花科(Bricaeae)越橘属{Vacciniimi L.)植物，又名蓝浆果、蓝靛果、越橘，为多年生落叶/常绿木质灌木，原产地为加拿大东部和美国东北部。蓝莓叶富含花色苷、绿原酸、异槲皮素、槲皮素等生理活性物质和很强的抗氧化能力。花青素是一种类黄酮化合物，主要为C6-C3-C6结构，包括天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、锦葵花色素、矮牵牛色素等，主要分布在植物的花、果皮、叶、根、茎中。花青素结合糖苷后构成花色苷。花青素提取物具有较高的抗氧化能力，可以用于食品 天然色素，保健品、化妆品等。花青素的研究主要包括花青素的定性定量、提取分离、纯化利用等方面。常见的提取方法主要包括溶剂提取、超声波辅助提取、微波辅助提取、高压超高压辅助提取、超临界辅助提取等。花青素的纯化方式包括纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相分离、膜分离、固相萃取、结晶法等。我国拥有丰富的花青素资源。如何充分有效的加以利用，显得极其重要。与蓝莓果实相比较，花青素作为蓝莓红叶中的特征性物质成分，受到的关注较少。冯松元等(中国专利授权号100574625)提出了蓝莓叶茶饮料的制备方法，该方法仅对处理后的蓝莓叶浸提、过滤后的汁液进行灭菌、灌装。此发明没有对蓝莓叶中的花青素进行提取、纯化和物质鉴定。此外一些文献报道了蓝莓叶黄酮类物质的提取分离方法等，尚未单独研究蓝莓红叶中的特征性物质成分花青素的提取纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，它成本低廉，易于产业化，提取效率高，以克服现有技术的不足。本发明是这样实现的从蓝莓叶中提取纯化花青素的方法，选取新鲜的蓝莓红叶，并去除病虫烂叶，用清水清洗后，经过真空干燥、粉碎过筛、提取、树脂纯化分离、减压浓缩、冷冻干燥、饱和溶解、低温养晶及重结晶工艺后，获得花青素结晶。所述的真空干燥是，将蓝莓红叶在O. 05 O. 2个大气压、60°C的条件下干燥12 24小时。所述的粉碎过筛是，将干燥的蓝莓红叶粉碎后过60目筛，获得蓝莓红叶粗粉，并将获得的蓝莓红叶粗粉进行密封干燥储藏，备用。所述的提取是，向蓝莓红叶粗粉中加入质量百分比浓度为50 90%的乙醇水溶液，乙醇水溶液与蓝莓红叶粗粉的液料比1:20 1:50，并在室温下采用150 400W超声波功率进行2 5次辅助提取，每次提取时间10 lOOmin。所述的树脂纯化分离是，选择AB-8型号大孔树脂，进行色素纯化，在树脂纯化时先用纯水洗脱糖、蛋白质等杂质，再用质量百分比浓度为50 80%乙醇水溶液洗脱下花青素，获得花青素洗脱液。所述的减压浓缩是，将花青素洗脱液，在O. 05 O. 2个大气压、30 40°C的条件下减压浓缩至不含乙醇，再将浓缩物溶解于50 100倍的纯水中，获得蓝莓红叶花青素水溶液；再将浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品。(为什么经过减压浓缩后，有两种不同的步骤？ 一种是加纯水获得蓝莓红叶花青素水溶液，另一种是浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品)
所述的饱和溶解及低温养晶是，将获得的花青素粗品在20 30°C的条件下用质量百分比浓度为45 65%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2 4°C的冰箱冷藏12 24小
时，静置养晶。与现有技术相比，本发明采用超声波辅助提取法，选取乙醇作为有机溶剂提取，并通过大孔树脂分离纯化、结晶和重结晶处理来实现从蓝莓红叶中提取花青素，经过重结晶 后可使花青素的纯度能达到95%以上。本发明不仅工艺简单，而且分离纯化效率高，易于工业化生产，并且得到的花青素纯度高，生产成本低。通过液相质谱辅助定性等技术得知，所获得的花青素种类较蓝莓果实中提取得到的色素种类简单。本发明方法简单，容易实施，使用效果好。
图I为蓝莓叶花青素成分的HPLC-MS/MS正离子流 图2为蓝莓叶花青素成分的HPLC 图3为矢车菊素-3-0-半乳糖苷的质谱 图4为矢车菊素-3-0-阿拉伯糖苷的质谱 图5为矢车菊素-3-0-葡萄糖苷质谱 图6为飞燕草素-3-0-半乳糖苷质谱 图7为飞燕草素-3-0-阿拉伯糖苷质谱图。
具体实施例方式本发明的实施例I :从杰兔蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，(I)选取新鲜的杰兔蓝莓红叶，并去除病虫烂叶，用清水清洗后，在O. I个大气压下60°C干燥16小时，将干燥后的蓝莓红叶粉碎至过60目筛，获得蓝莓红叶粗粉，并将获得的蓝莓红叶粗粉进行密封干燥储藏，备用；向蓝莓红叶粗粉中加入质量百分比浓度为80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液与蓝莓红叶粗粉的液料比1:20，并在室温下采用300W超声波功率进行2次辅助提取，每次提取时间40min，将获得的提取溶液经过滤除渣后，在O. I个大气压下35°C条件下减压浓缩至不含乙醇,再溶解于60倍的纯水中，获得蓝莓红叶花青素水溶液；将蓝莓红叶花青素水溶液采用大孔吸附树脂进行吸附分离，选择AB-8型号大孔树脂，吸附饱和后，先以纯水洗脱糖、蛋白质等杂质，再用70%乙醇水溶液洗脱下花青素；花青素洗脱液在O. I个大气压下35°C的条件下条件下减压浓缩至不含乙醇，再将浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品；将蓝莓红叶花青素粗品在25°C的条件下用质量百分比浓度为55%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏14小时，静置养晶，析出的结晶体即为花青素结晶；将析出的结晶通过重结晶(在25°C的条件下用质量百分比浓度为50%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏12小时，静置养晶)，析出的花青素结晶体经过液相检测后纯度可达96. 2%ο本发明的实施例2 :从园蓝蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，选取新鲜的园蓝蓝莓红叶，并去除病虫烂叶，用清水清洗后，在O. I个大气压下60°C干燥24小时，将干燥后的蓝莓红叶粉碎至过60目筛，获得蓝莓红叶粗粉；向蓝莓红叶粗粉中加入质量百分比浓度为75%的乙醇水溶液，乙醇水溶液与蓝莓红叶粗粉的液料比1:20，并在室温下采用250W超声波功率进行3次辅助提取，每次提取时间70min，将获得的提取溶液经过滤除渣后，在O. I个大气压下38°C条件下减压浓缩至不含乙醇，再溶解于60倍的纯水中，获得蓝莓红叶花青素水溶液；将蓝莓红叶花青素水溶液采用大孔吸附树脂进行吸附分离，选择AB-8型号大孔树脂，吸附饱和后，先以纯水洗脱糖、蛋白质等杂质，再用75%乙醇水溶液洗脱下花青素；花青素洗脱液在O. I个大气压下38°C的条件下条件下减压浓缩至不含乙醇，再将浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品；将蓝莓红叶花青素粗品在22°C的条件下用质量百分比浓度为58%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏20小时，静置养晶，析出的结晶体即为花青素结晶；将析出的结晶通过重结晶(在25°C的条件下用质量百分比浓度为52%的 乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏14小时，静置养晶)，析出的花青素结晶体经过液相检测后纯度可达95. 5%。本发明的实施例3 :从巴尔德温蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，选取新鲜的巴尔德温蓝莓红叶，并去除病虫烂叶，用清水清洗后，在O. 08个大气压下60°C干燥20小时，将干燥后的蓝莓红叶粉碎至过60目筛，获得蓝莓红叶粗粉；向蓝莓红叶粗粉中加入质量百分比浓度为80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液与蓝莓红叶粗粉的液料比1:30，并在室温下采用250W超声波功率进行3次辅助提取，每次提取时间40min，将获得的提取溶液经过滤除渣后，在O. 08个大气压下40°C条件下减压浓缩至不含乙醇，再溶解于80倍的纯水中，获得蓝莓红叶花青素水溶液；将蓝莓红叶花青素水溶液采用大孔吸附树脂进行吸附分离，选择AB-8型号大孔树脂，吸附饱和后，先以纯水洗脱糖、蛋白质等杂质，再用80%乙醇水溶液洗脱下花青素；花青素洗脱液在O. 08个大气压下40°C的条件下条件下减压浓缩至不含乙醇，再将浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品；将蓝莓红叶花青素粗品在25°C的条件下用质量百分比浓度为60%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏20小时，静置养晶，析出的结晶体即为花青素结晶；将析出的结晶通过重结晶(在25°C的条件下用质量百分比浓度为50%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于4°C的冰箱冷藏15小时，静置养晶)，析出的花青素结晶体经过液相检测后纯度可达96. 8%。本发明的实施例4 :从粉蓝蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，选取新鲜的粉蓝蓝莓红叶，并去除病虫烂叶，用清水清洗后，在O. I个大气压下60°C干燥14小时，将干燥后的蓝莓红叶粉碎至过60目筛，获得蓝莓红叶粗粉；向蓝莓红叶粗粉中加入质量百分比浓度为80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液与蓝莓红叶粗粉的液料比1:30，并在室温下采用300W超声波功率进行3次辅助提取，每次提取时间50min，将获得的提取溶液经过滤除渣后，在O. I个大气压下35°C条件下减压浓缩至不含乙醇，再溶解于80倍的纯水中，获得蓝莓红叶花青素水溶液；将蓝莓红叶花青素水溶液采用大孔吸附树脂进行吸附分离，选择AB-8型号大孔树脂，吸附饱和后，先以纯水洗脱糖、蛋白质等杂质，再用80%乙醇水溶液洗脱下花青素；花青素洗脱液在O. I个大气压下35°C的条件下条件下减压浓缩至不含乙醇，再将浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品；将蓝莓红叶花青素粗品在25°C的条件下用质量百分比浓度为55%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏18小时，静置养晶，析出的结晶体即为花青素结晶；将析出的结晶通过重结晶(在25°C的条件下用质量百分比浓度为50%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏16小时，静置养晶)，析出的花青素结晶体经过液相检测后纯度可达95. 3%。本发明的实施例5 :从夏普兰蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，选取新鲜的夏普兰蓝莓红叶，并去除病虫烂叶，用清水清洗后，在O. 05个大气压下60°C干燥15小时，将干燥后的蓝莓红叶粉碎至过60目筛，获得蓝莓红叶粗粉；向蓝莓红叶粗粉中加入质量百分比浓度为80%的乙醇水溶液，乙醇水溶液与蓝莓红叶粗粉的液料比1:40，并在室温下采用250W超声波功率进行2次辅助提取，每次提取时间40min，将获得的提取溶液经过滤除渣后，在O. I个大气压下39 V条件下减压浓缩至不含乙醇，再溶解于60倍的纯水中，获得蓝莓红叶花青素水溶液；将蓝莓红叶花青素水溶液采用大孔吸附树脂进行吸附分离，选择AB-8型号大孔树脂，吸附饱和后，先以纯水洗脱糖、蛋白质等杂质，再用80%乙醇水溶液洗脱下 花青素；花青素洗脱液在O. I个大气压下39°C的条件下条件下减压浓缩至不含乙醇，再将浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品；将蓝莓红叶花青素粗品在22°C的条件下用质量百分比浓度为57%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2°C的冰箱冷藏15小时，静置养晶，析出的结晶体即为花青素结晶；将析出的结晶通过重结晶(在25°C的条件下用质量百分比浓度为50%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于3°C的冰箱冷藏14小时，静置养晶)，析出的花青素结晶体经过液相检测后纯度可达95. 9%。为了验证本发明的实验效果，将实施例I至例5获得的产品用液相质谱辅助定性，检测其花青素组成
HPLC检测条件
Waters 600高效液相色谱仪、Waters 2489紫外检测器用于测定花色苷含量。Waters Empower软件分析数据。HPLC检测条件Waters Xselect-CSH色谱柱(250X4. 6mm, America),检测波长为520nm，柱温25°C，以峰面积外标法定量。流动相A为甲酸+水(10:90), B为乙腈；流速为I ml/min。进样量10μ1。标准品选用矢车菊素-3-0-匍萄糖苷。HPLC-MS/MS质谱辅助定性检测条件
Agilent 1290 HPLC(Agilent Technologies)连接 Q-TOF Ultima Agilent 1290 离子肼质谱。LC-MS检测流动相条件同HPLC检测条件，但是流速O. 6ml/min。质谱条件正、负离子电喷雾离子化，喷雾电压3300V，检测波长520 nm.，雾化压力40 psi，干燥N气流流速10 ml/min，加热毛细管温度300°C，质合比100-1000范围每秒全扫描一次，分析软件Bruker software。图谱鉴定根据保留时间先后顺序,最大吸收波长，M/Z值,碎片M/Z值结合参考文献确定。检测的图谱如图I至图6所示，其花青素的组成见表I。表I :蓝莓红叶花青素组成
权利要求
1.一种从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，其特征在于选取新鲜的蓝莓红叶，并去除病虫烂叶，用清水清洗后，经过真空干燥、粉碎过筛、提取、树脂纯化分离、减压浓缩、冷冻干燥、饱和溶解、低温养晶及重结晶工艺后，获得花青素结晶。
2.根据权利I所述的从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，其特征在于所述的真空干燥是，将蓝莓红叶在O. 05 O. 2个大气压、60°C的条件下干燥12 24小时。
3.根据权利I所述的从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，其特征在于所述的粉碎过筛是，将干燥的蓝莓红叶粉碎后过60目筛，获得蓝莓红叶粗粉，并将获得的蓝莓红叶粗粉进行密封干燥储藏，备用。
4.根据权利I所述的从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，其特征在于所述的提取是，向蓝莓红叶粗粉中加入质量百分比浓度为50 90%的乙醇水溶液，乙醇水溶液与蓝莓红叶粗粉的液料比1:20 1:50，并在室温下采用150 400W超声波功率进行2 5次辅助提取，每次提取时间10 lOOmin。
5.根据权利I所述的从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，其特征在于所述的树脂纯化分离是，选择AB-8型号大孔树脂，进行色素纯化，在树脂纯化时先用纯水洗脱糖、蛋白质等杂质，再用质量百分比浓度为50 80%乙醇水溶液洗脱下花青素，获得花青素洗脱液。
6.根据权利I所述的从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，其特征在于所述的减压浓缩是，将花青素洗脱液，在O. 05 O. 2个大气压、30 40°C的条件下减压浓缩至不含乙醇，再将浓缩物溶解于50 100倍的纯水中，获得蓝莓红叶花青素水溶液；再将浓缩物进行冷冻干燥，得到花青素粗品。
7.根据权利I所述的从蓝莓红叶中提取纯化花青素的方法，其特征在于所述的饱和溶解及低温养晶是，将获得的花青素粗品在20 30°C的条件下用质量百分比浓度为45 65%的乙醇水溶液配置饱和溶液后，置于2 4°C的冰箱冷藏12 24小时，静置养晶。
全文摘要
本发明公开了一种从蓝莓红叶中提取花青素的方法，特点是蓝莓红叶花青素提取物中一般含有2种含量接近的花青素，占提取物中花青素含量93.9-99.0%；以新鲜的蓝莓红叶为原料，去除病虫烂叶，用清水清洗后，经过真空干燥、粉碎过筛、提取、减压浓缩、大孔树脂纯化分离、减压浓缩、冷冻干燥、饱和溶解、低温养晶、重结晶等工艺制得天然蓝莓红叶色素产品。花青素经重结晶后得到的花青素纯度达到95%以上。本发明制备的花青素纯度较高，花青素组成较简单，生产成本低，具有较大推广性。
文档编号C09B61/00GK102875514SQ20121036102
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者严红光, 张文华 申请人:凯里学院