考马斯亮蓝染色法及相关固定液和染色剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的考马斯亮蓝染色方法以及相关的固定液和染色液。所述考马斯亮蓝染色方法相关的固定液包含酸和醇，所述醇为甲醇和/或乙醇，所述酸为V乙酸：V磷酸＝1:1的混合酸；所述考马斯亮蓝染色方法相关的染色液包含质量体积浓度为0.05％～0.12％的考马斯亮蓝,体积百分含量为5％～20％的醇，体积百分含量为3％～10％的酸，质量体积浓度为3％～10％的硫酸铵。所述方法线性关系更好、质谱兼容性更好、胶体不易碎、基本无背景，并且减少了近一半的试剂用量，降低了染色成本，更加环保。
【专利说明】考马斯亮蓝染色法及相关固定液和染色剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及凝胶电泳领域，更具体地涉及在凝胶电泳中使用的考马斯亮蓝染色的 相关试剂和方法。
【背景技术】
[0002] 凝胶电泳技术，尤其是单向SDS-PAGE凝胶电泳（1-DE )和二维凝胶电泳（2-DE ) 是目前蛋白质组学研究中使用范围最广泛的蛋白质分离技术。其定量的基础是利用某种 特定的染料对胶上的蛋白进行染色，然后基于染色强度对蛋白进行定量。因此，基于凝胶 定量的灵敏度、线性范围以及定量精度均高度依赖于蛋白染色水平。现有的染色方法主 要分为4种：有机染料染色、负染、银染以及荧光染料染色。其中，有机试剂染色以考马斯 亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB)为代表，其在1963年被首次应用到醋酸 纤维素片上的蛋白染色（Fazekas De St.Groth，S.，Webster，R.G.，Datyne;r，A.，Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips [J]. Biochim. Biophys. Actal963, 71，377 - 391 )，随后 Meyer 等使用甲醇 / 乙酸 /水的溶液配制CBB R250染色液为聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白染色（M. Pink，N. Venna，A. W. Rettenmeier, et al. CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility[J]· Electrophoresis，2010, 31，593-598.)。由于 CBB 染色 法简单易用，价格低廉，且与下游的蛋白质谱分析高度兼容，因而，已成为目前使用最广泛 的染色方法。然而，其主要的问题在于染色灵敏度不高，对低丰度蛋白质的显现较差。
[0003] 自Groth等第一次使用考马斯亮蓝进行蛋白染色以来（Fazekas De St. Groth，S 等人，同上)，已有很多研究为提高其染色灵敏度进行了努力（Neuhoff V，Aix)ld N，Taube D，Ehrhard t W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using coomassie brilliant blue G_250and R-250[J]. Electroph oresis1988;9:255 - 62 ； G.Candiano, M. Brusch, L. Musant, et al.Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G_250staining for proteome analysis[J]. Electrophoresis,2004,25,13 27-1333 ;M. Pink 等人，同上；Victoria J. Gauci，Matthew P. Padula，Jens R. Coorssen. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics[J]. proteomics，2003, 90, 96-106)，其中Blue Silver被证明是更加灵敏的染色方法，该研究报 道其染色灵敏度能达到lng每蛋白条带（G. Candiano等人，同上)，但是通过肉眼判断的可 见条带下限在l〇ng左右。而且，该方法染色背景深，脱色时间较长，脱色过程中因为聚丙烯 酰胺的伸展而使胶体过度膨胀，易碎（M. Pink等人，同上)。
[0004] 基于以上分析，本领域中需要可以显著增加现有的考马斯亮蓝染色法的灵敏度， 用量更少，与质谱兼容性更好的考马斯亮蓝染色法相关试剂以及使用其进行染色的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种在蛋白质组学研究领域中应用的经济环保的考马斯亮 蓝凝胶染色方法及其相应的凝胶固定液和染色剂，旨在形成新的染色方法，降低染色试剂 消耗，解决脱色困难的问题并具有较高的染色灵敏度，具有显著的经济环保特色。
[0006] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 在第一方面，本发明提供了一种用于考马斯亮蓝染色的固定液，所述固定液包含 酸和醇，其中所述醇为甲醇和/或乙醇，所述酸为乙酸和磷酸体积比为1:1的混合酸。
[0008] 在本发明的固定液中，所述醇的体积百分浓度可以为30%、31%、32%、33%、34%、35%、 36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49% 或 50%，优选为 35% ?45%， 最优选40%。
[0009] 在本发明的固定液中，所述混合酸的体积百分浓度可以为8%?12%，优选为 9%-11%，最优选 10%。
[0010] 在第二方面，本发明提供了一种考马斯亮蓝染色液，所述染色液包含质量体积浓 度为0. 05%?0. 12%，优选为0. 08%?0. 10%的考马斯亮蓝，体积百分含量为5%?20%， 优选为10%?15%的醇，体积百分含量为3%?10%，优选为5%的酸，质量体积浓度为3%? 10%，优选为5%的硫酸铵；其中所述考马斯亮蓝包括R250和G250中的至少一种；所述醇包 括甲醇和乙醇中的至少一种；所述的酸包括乙酸和磷酸中的至少一种。
[0011] 在本发明的染色液中，所述醇可以为甲醇和/或乙醇。
[0012] 在本发明的染色液中，所述酸可以为磷酸。
[0013] 本发明的染色液可以包含质量体积浓度为0. 05%、0. 06%、0. 07%、0. 08%、0. 09%、 0. 10%、0. 11%或0. 12%的考马斯亮蓝。
[0014] 本发明的染色液可以包含体积百分含量为5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、 14%或15%的醇。
[0015] 本发明的染色液可以包含体积百分含量为3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的酸。
[0016] 本发明的染色液可以包含体积百分含量为3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的硫酸 铵。
[0017] 在第三方面，本发明提供了一种考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，所述方法包括 将SDS-PAGE凝胶置于根据第一方面所述的固定液中进行固定和/或将SDS-PAGE凝胶置于 根据第二方面所述的染色液进行染色，任选地在所述固定和/或所述染色后在ddH 20中进 行漂洗。
[0018] 在本发明的考马斯亮蓝染色方法中，所述固定的时间为30-60min，优选地40?50 分钟，更优选地45分钟。
[0019] 在本发明的考马斯亮蓝染色方法中，所述染色的时间为8_12h，优选地9?llh，更 优选地1 Oh。
[0020] 在第四方面，本发明提供了根据第一方面所述的固定液、根据第二方面所述的染 色液和/或根据第三方面所述的方法在蛋白质研究中的应用。
[0021] 有益效果：
[0022] (1)本发明的染色方法对固定过程，染色过程试剂配比进行了优化，最后仅用蒸馏 水简单漂洗即可快速完成脱色；
[0023] (2)本发明降低了甲醇的体积百分浓度、考马斯亮蓝的质量体积浓度、硫酸铵的使 用量以及磷酸的体积百分浓度，节约了近一半的染色试剂，更经济环保，并且与一般考马斯 亮蓝染色相比提高了染色灵敏度；
[0024] (3)本发明的考马斯亮蓝染色法与Blue Silver染色法相比灵敏度相当，但性关系 更好、质谱兼容性好、胶体不易碎、基本无背景，并且减少了近一半的试剂用量，降低了染色 成本，更加环保，并且无需脱色，操作简便，效率高。
[0025] 附图简述
[0026] 图1是不同质量的牛血清白蛋白BSA按照本发明实验组一的染色结果图。
[0027] 图2是不同质量的牛血清白蛋白BSA按照本发明实验组二的染色结果图。
[0028] 图3是不同质量的牛血清白蛋白BSA按照本发明实验组三的染色结果图。
[0029] 图4是不同质量的牛血清白蛋白BSA按照本发明实验组四的染色结果图。
[0030] 图5是不同质量的牛血清白蛋白BSA按照对照实验组一（Blue Silver)的染色结 果图。
[0031] 图6是不同质量的牛血清白蛋白BSA按照对照实验组二（Meyer Stain)的染色结 果图。
[0032] 图7是BSA含量为1?lOOOng梯度范围内的染色线性关系图：其中图A、B、C、D 分别为实验组三、对照实验组一（Blue Silver)、实验组四、对照实验组二（Meyer Stain)。
[0033] 图8是是BSA含量为1?10ng梯度范围内的染色线性关系图：其中图A、B、C、D 分别为实验组三、对照实验组一（Blue Silver)、实验组四、对照实验组二（Meyer Stain)。
[0034] 图9是不同染色方法SDS-PAGE中50ng BSA条带胶内酶解MALDI-T0F/T0F分析结 果图；其中图A、B、C、D分别为实验组三、对照实验组一（Blue Silver)、实验组四、对照实 验组二（Meyer Stain)。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0036] 下述实施例中所用方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 实验组一
[0038] 本发明实验组一所用的凝胶固定液含如下组分：凝胶固定液中的混合酸体积百分 浓度优选为12%，乙醇体积百分浓度优选为50%。具体配制过程如下：
[0039] 将250mL乙醇、30mL乙酸、30mL磷酸和190mL ddH20混匀即可。
[0040] 本发明实验组一所用的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0. 05%的 G-250的水溶液，体积百分含量为20%的乙醇，体积百分含量为10%的磷酸，质量体积浓度为 5%的硫酸铵；各溶液采用ddH20配制。具体配制过程如下：
[0041] (1)量取58. 8mL体积百分含量为85%的磷酸加入200mL ddH20中，混匀。
[0042] (2)称取25. 0g的硫酸铵加入（1)中的混合液，搅拌使硫酸铵溶解完全。
[0043] (3)加入0· 25g的G-250于（2)中的混合液。
[0044] (4)将（3)中所得溶液放到摇床上，设置转速150rpm，温度为37°C摇一个小时以 上，保证G-250完全溶解。
[0045] (5)把100mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻备用。
[0046] 本发明提供的利用上述考马斯亮蓝染色液进行染色的方法具体包括以下几个步 骤：
[0047] (1)将SDS-PAGE凝胶置于固定液中摇30分钟；
[0048] (2)将SDS-PAGE凝胶转移至ddH20中漂洗两次，每次摇15min。
[0049] (3 )将SDS-PAGE凝胶放入上述染色液中，室温摇动，染色8h。
[0050] (4)将SDS-PAGE凝胶转移至ddH20中洗掉浮色，基本无背景。
[0051] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝胶指分离胶为质量百分含量为12%聚丙烯酰胺和浓 缩胶为质量百分含量为5%聚丙烯酰胺，使用7cm模具配制1mm厚的凝胶。
[0052] 实验组二
[0053] 本发明实验组二所用的凝胶固定液含如下组分：凝胶固定液中的混合酸体积百分 浓度优选为8%，甲醇体积百分浓度优选为30%。具体配制过程如下：
[0054] 将150mL甲醇、20mL乙酸、20mL憐酸和310mL ddH20混合在一起即可。
[0055] 本发明实验组二所用的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0. 12%的 R-250的水溶液，体积百分含量为5%的甲醇，体积百分含量为3%的磷酸，质量体积浓度为 3%的硫酸铵；各溶液采用ddH 20配制。具体配制过程如下：
[0056] (1)量取17. 6mL体积百分含量为85%的磷酸加入200mLddH20中，混匀。
[0057] (2)称取15g的硫酸铵加入（1)中的混合液，搅拌使硫酸铵溶解完全。
[0058] (3)加入0· 6g的R-250于（2)中的混合液。
[0059] (4)将（3)中所得溶液放到摇床上，设置转速150rpm，温度为37°C摇一个小时以 上，保证R-250完全溶解。
[0060] (5)把25mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻备用。
[0061] 本发明提供的利用上述考马斯亮蓝染色液进行染色的方法具体包括以下几个步 骤：
[0062] (1)将SDS-PAGE凝胶置于固定液中摇60分钟；
[0063] (2)将SDS-PAGE凝胶转移至H20中漂洗两次，每次摇15min。
[0064] (3)将SDS-PAGE凝胶放入上述染色液中，室温摇动，染色12h。
[0065] (4)将SDS-PAGE凝胶转移至ddH20中，摇床脱色至条带清晰明亮，背景干净。
[0066] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝胶指分离胶为质量百分含量为12%聚丙烯酰胺和浓 缩胶为质量百分含量为5%聚丙烯酰胺，使用的是7cm模具配制1mm厚的凝胶。
[0067] 实验组三：
[0068] 本发明实验组三所用的凝胶固定液含如下组分：凝胶固定液中的混合酸体积百分 浓度优选为8%，甲醇体积百分浓度优选为35%。具体配制过程如下：
[0069] 将175mL甲醇、20mL乙酸、20mL磷酸和280mL ddH20混匀即可。
[0070] 本发明实验组三所用的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0. 08%的 G-250的水溶液，体积百分含量为15%的甲醇，体积百分含量为8%的磷酸，质量体积浓度为 10%的硫酸铵；各溶液采用ddH 20配制。具体配制过程如下：
[0071] (1)量取47. lmL体积百分含量为85%的磷酸加入200mL ddH20中，混匀。
[0072] (2)称取40g的硫酸铵加入（1)中的混合液，搅拌使硫酸铵溶解完全。
[0073] (3)加入0· 4g的G-250于（2)中的混合液。
[0074] (4)将（3)中所得溶液放到摇床上，设置转速150rpm，温度为37°C摇一个小时以 上，保证G-250完全溶解。
[0075] (5)把75mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混匀备用。
[0076] 本发明提供的利用上述考马斯亮蓝染色液进行染色的方法具体包括以下几个步 骤：
[0077] (1)将SDS-PAGE凝胶置于固定液中摇30分钟；
[0078] (2)将SDS-PAGE凝胶转移至ddH20中漂洗两次，每次摇15min。
[0079] (3)将SDS-PAGE凝胶放入上述染色液中，室温摇动，染色8h。
[0080] (4)将SDS-PAGE凝胶转移至ddH20中洗掉浮色，基本无背景。
[0081] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝胶指分离胶为质量百分含量为12%聚丙烯酰胺和浓 缩胶为质量百分含量为5%聚丙烯酰胺，使用7cm模具配制1mm厚的凝胶。
[0082] 实验组四
[0083] 本发明实验组四所用的凝胶固定液含如下组分：凝胶固定液中的混合酸体积百分 浓度优选为10%，乙醇体积百分浓度优选为40%。具体配制过程如下：
[0084] 将200mL乙醇、25mL乙酸、25mL磷酸和250mL ddH20混匀即可。
[0085] 本发明实验组四所用的考马斯亮蓝染色液含如下组分：质量体积浓度为0. 10%的 R-250的水溶液，体积百分含量为10%的甲醇，体积百分含量为5%的磷酸，质量体积浓度为 5%的硫酸铵；各溶液采用ddH 20配制。具体配制过程如下：
[0086] (1)量取29. 4mL体积百分含量为85%的磷酸加入200mLddH20中，混匀。
[0087] (2)称取25g的硫酸铵加入（1)中的混合液，搅拌使硫酸铵溶解完全。
[0088] (3)加入0· 5g的R-250于（2)中的混合液。
[0089] (4)将（3)中所得溶液放到摇床上，设置转速150rpm，温度为37°C摇一个小时以 上，保证R-250完全溶解。
[0090] (5)把50mL甲醇加入（4)中的混合液，用ddH20定容至500mL混勻备用。
[0091] 本发明提供的利用上述考马斯亮蓝染色液进行染色的方法具体包括以下几个步 骤：
[0092] (1)将SDS-PAGE凝胶置于固定液中摇30分钟；
[0093] (2)将SDS-PAGE凝胶转移至H20中漂洗两次，每次摇15min。
[0094] (3 )将SDS-PAGE凝胶放入上述染色液中，室温摇动，染色8h。
[0095] (4)将SDS-PAGE凝胶转移至ddH20中，摇床脱色至条带清晰明亮，背景干净。
[0096] 上述（1)中所述SDS-PAGE凝胶指分离胶为质量百分含量为12%聚丙烯酰胺和浓 缩胶为质量百分含量为5%聚丙烯酰胺，使用的是7cm模具配制1mm厚的凝胶。
[0097] 对照实验组
[0098] 对照实验组一选用了 Blue Silver染色法，染色步骤如下：
[0099] (1)将 SDS-PAGE 凝胶置于染色液（0. 12%CBB G-250、10% 硫酸铵、10% 磷酸、20% 甲 醇水溶液）中染色过夜；
[0100] (2)染色完成后，SDS-PAGE凝胶用蒸馏水漂洗脱色，直至背景无颜色即可。
[0101] 对照实验组二选用了经典的Meyer Stain染色法，染色步骤如下：
[0102] (1)将SDS-PAGE凝胶置于染色液（0. 1%的R-250,45%的甲醇，10%乙酸）中摇lh ;
[0103] (2)染色完成后，SDS-PAGE凝胶用蒸馏水漂洗一下，转入脱色液（25%乙醇、8%乙 酸）中脱色，每15min更换一次脱色液，直至背景无颜色即可。
[0104] 其中上述染色过程中所用甲醇硫酸铵优选自生工生物，R-250、G-250等均优选自 Amresco〇
[0105] 1、实验组一至四和对照组的染色实验结果如图1-6所示。
[0106] 其中实验组一的灵敏度也可达到10ng，与Blue Sliver的灵敏度10ng相当，但减 少了 58. 3%的染色试剂G-250和50%的硫酸铵消耗，高于Meyer Stain法灵敏度20ng，并且 所得的凝胶背景浅，用蒸馏水旋摇洗掉凝胶表面的浮色即可获得清晰明亮的条带，再用蒸 馏水震荡lh即可完成脱色，整个过程凝胶膨胀变化小，有利于后续的质谱分析。
[0107] 实验组二的灵敏度可达到8ng，与Blue Sliver的灵敏度10ng相当，但减少了 50% 的甲醇、70%的磷酸和70%的硫酸铵消耗，高于Meyer Stain法灵敏度20ng，并且所得的凝 胶背景浅，用蒸馏水旋摇洗掉凝胶表面的浮色即可获得清晰明亮的条带，无需脱色液即可 完成脱色，整个过程凝胶膨胀变化小，有利于后续的质谱分析。
[0108] 实验组三的灵敏度可达到2ng，与Blue Sliver的灵敏度10ng相当，但减少了 25% 的染色试剂G-250、25%的甲醇、20%的磷酸和20%的硫酸铵消耗，高于Meyer Stain法灵敏 度20ng，并且所得的凝胶背景浅，用蒸馏水旋摇洗掉凝胶表面的浮色即可获得清晰明亮的 条带，再用蒸馏水震荡lh即可完成脱色，整个过程凝胶膨胀变化小，有利于后续的质谱分 析。
[0109] 实验组四的灵敏度也可达到10ng，与Blue Sliver的灵敏度10ng相当，但减少了 16. 7%的染色试剂G-250、50%的甲醇、50%的磷酸和50%的硫酸铵消耗，高于Meyer Stain法 灵敏度20ng，并且所得的凝胶背景浅，用蒸馏水旋摇洗掉凝胶表面的浮色即可获得清晰明 亮的条带，无需脱色液即可完成脱色，整个过程凝胶膨胀变化小，有利于后续的质谱分析。
[0110] 其中实验组一至实验组四的灵敏度差异不大，约为6ng左右，与对照实验组一 (Blue Silver)的灵敏度10ng相当，远远高于对照实验组二（Meyer Stain)染色法仅能检 测到20ng的牛血清蛋白（BSA)。本发明的灵敏度与Blue Sliver的灵敏度相当，比经典的 Meyer Stain染色法灵敏度高很多，且本发明所需试剂少，成本低，产生的废液量也显著降 低，更加环保，与对照实验组一相比能降低50%以上的试剂消耗。此外对照实验组Meyer Stain和Blue Sliver染色法的脱色时间较长，胶体易碎，但实验组一至四染色后基本无背 景，用蒸馏水洗掉浮色即可，无需脱色液即可完成脱色，故整个过程凝胶膨胀变化小，胶体 不易碎，更有利于后续的质谱分析。
[0111] 2、Blue Silver、Meyer Stain染色法与本发明实验组三、实验组四染色法线性关 系比较
[0112] 双向电泳技术是蛋白质组学研究中的经典技术，复杂的蛋白样品，经过双向电泳 分离后，再经染色，通过比较不同蛋白含量和不同样本中相同蛋白的含量差异，寻找有兴趣 的区域，再结合质谱对其进行鉴定。那么一个染色方法具备良好的定量线性关系对于基于 双向电泳技术的蛋白质组学研究而言是非常重要，因此考察较宽浓度范围内的蛋白着色情 况及其响应的线性关系是非常必要的，此外，低丰度蛋白（low abundance protein)在细胞 内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的"冰山之尖"，因此考察低浓度蛋白着色 情况及其在较窄浓度范围内响应的线性关系也是非常必要的。故本发明考察了实验组三、 实验组四、Blue Silver和Meyer Stain四种染色方法的线性关系，分别对它们的SDS-PAGE 凝胶蛋白条带光密度值（Vol%)与1?lOOOng范围的BSA含量的相关性进行分析，以及 SDS-PAGE凝胶蛋白条带光密度值（Vol%)与低浓度范围的BSA(1?10ng)的相关性进行分 析，结果见图7和图8。
[0113] 从图7中可以看出，在BSA含量为1?lOOOng范围内，四种染色方法均有相对较 好的线性关系；但从图8中可以看出，在低含量的BSA (1?10ng)梯度内，Meyer Stain、 Blue Silver和实验组四都不能随着蛋白量的增加而形成一定的线性关系，而实验组三不 仅在1?lOOOng BSA范围内线性关系良好，且在低含量的BSA (1?10ng)范围内仍保持 较好的线性关系。从各染色方法低蛋白含量线性关系图可以看出，实验组三具有较宽的定 量线性范围，因此，CBBG-250在该染色体系中比CBB R-250有更加广泛的适用性，更加适合 于定量。另外，也表明通过染色前增加固定过程，染色液中磷酸、硫酸铵、甲醇的浓度降低对 定量结果是有利的。
[0114] 3、Blue Silver、Meyer Stain染色法与本发明实验组三、实验组四染色法质谱兼 容性评估
[0115] 尽管以上评价结果表明本发明实验组三、实验组四为灵敏的蛋白染色方法，在一 定范围内定量线性关系也较好，但是由于不同的染色方法对后续的质谱分析有重要影响， 因此评价改良方法的质谱兼容也非常重要。为了评价四种染色方法的质谱兼容性情况，我 们将其SDS-PAGE凝胶中250ng和50ng的BSA条带进行胶内酶解消化，然后进行质谱分析 (见图3)及鉴定，结果见表1 ;图表结果表明实验组三在低蛋白含量时依然保持了较好的质 谱兼容性，能准确鉴定出BSA，而其它三种方法在低蛋白含量时不能稳定鉴定或不能鉴定出 BSA。该结果说明本发明的实验组三更有利于后续质谱分析。
[0116] 表1四种染色方法的SDS-PAGE凝胶中BSA条带MALDI-T0F/T0F鉴定分析情况表
[0117]
【权利要求】
1. 一种用于考马斯亮蓝染色的固定液，其特征在于，所述固定液包含酸和醇，其中所述 醇为甲醇和/或乙醇，所述酸为:V_g=l: 1的混合酸。
2. 根据权利要求1所述的固定液，其特征在于，所述醇的体积百分浓度为30%?50%， 优选为35%?45%，最优选40%。
3. 根据权利要求1或2所述的固定液，其特征在于，所述混合酸的体积百分浓度为 8%?12%，优选为9%-11%，最优选10%。
4. 一种考马斯亮蓝染色液，其特征在于，所述的染色液包含质量体积浓度为0. 05%? 0. 12%，优选为0. 08%?0. 10%的考马斯亮蓝，体积百分含量为5%?20%，优选为10%?15% 的醇，体积百分含量为3%?10%，优选为5%的酸，质量体积浓度为3%?10%，优选为5%的 硫酸铵；其中所述考马斯亮蓝包括R250和G250中的至少一种；所述醇包括甲醇和乙醇中 的至少一种；所述的酸包括乙酸和磷酸中的至少一种，优选的为磷酸。
5. 根据权利要求4中所述的染色液，其特征在于，所述醇为甲醇和/或乙醇。
6. 根据权利要求4或5所述的染色液，其特征在于，所述酸为磷酸。
7. -种考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，所述方法包括将SDS-PAGE凝胶置于根据权 利要求1至3中任一项所述的固定液中进行固定和/或将SDS-PAGE凝胶置于根据权利要 求4至6中任一项所述的染色液进行染色，任选地在所述固定和/或所述染色后在ddH 20中 进行漂洗。
8. 根据权利要求7中所述的方法，其特征在于，所述固定的时间为30?60min，优选地 40?50分钟，更优选地45分钟。
9. 根据权利要求7或8中所述的方法，其特征在于，所述染色的时间为8h?12h，优选 地9?llh，更优选地10h。
10. 根据权利要求1至3中任一项所述的固定液、根据权利要求4至6中任一项所述 的染色液和/或根据权利要求7至9中任一项所述的方法在蛋白质组学研究中的定性和/ 或定量中的应用。
【文档编号】C09B67/14GK104266893SQ201410083962
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】饶维桥, 訾金, 肖伟敏, 张继远, 饶媛, 林梁 申请人:深圳华大基因研究院