皮尔瑞俄类芽孢杆菌作为土壤生态改良修复剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及皮尔瑞俄类芽孢杆菌作为土壤生态改良修复剂的应用。基于该应用，本发明还提供了一种土壤生态改良修复剂，该土壤生态改良修复剂包括皮尔瑞俄类芽孢杆菌、有机质和微量元素。本发明皮尔瑞俄类芽孢杆菌土壤生态改良剂含有的有益微生物及抗生物质可防病、抑菌、抗重茬；含有的多种微生物活性物质、酶、有机酸，可有效改善土壤微生态系统、增强作物抗逆性、提高产量、改善品质、生态环保；添加的纯天然有机养分能有效改善土壤团粒结构，使土壤疏松，打破土壤板结，通水透气，提高肥料利用率；添加作物生长所必需的镁、硼等微量元素，可增强作物抗病、抗旱、抗寒能力。
【专利说明】皮尔瑞俄类芽孢杆菌作为土壤生态改良修复剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及土壤生态改良技术，具体涉及皮尔瑞俄类芽孢杆菌作为土壤生态改良 修复剂的应用。
【背景技术】
[0002] 土壤污染引起土壤质量恶化，已对食品安全、人类健康和农业可持续发展构成巨 大威胁和挑战。污染物源主要包括：化肥、农药，城市周边工业释放的有机物、重金属、放射 性物质、病原菌等。修复土壤污染有必要减少化学农药和化学肥料的使用量，寻找有效的替 代品，促进社会、经济、环境的可持续发展。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了皮尔瑞俄类芽孢杆菌作为土壤生态改 良修复剂的应用。
[0004] 优选的，所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌为皮尔瑞俄类芽孢杆菌BC39,保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5900。
[0005] 本发明还提供了一种土壤生态改良修复剂，该土壤生态改良修复剂包括皮尔瑞俄 类芽孢杆菌、有机质和微量元素。
[0006] 所述有机质为动物腐殖质和植物腐殖质中的一种或两种的混合物。
[0007] 所述微量元素为Fe、Mn、B、Zn和Mo中的一种或两种以上。
[0008] 本发明还提供了上述土壤生态改良修复剂的使用方法，于作物生育前期按30? 50Kg/亩均匀播撒或穴施在种植田中，随后翻耕或覆土。
[0009] 本发明还提供了一种土壤生态改良修复剂的制备方法，该制备方法包括：对皮尔 瑞俄类芽孢杆菌种进行发酵培养后获皮尔瑞俄类芽孢杆菌，再将皮尔瑞俄类芽孢杆菌与有 机质和微量元素复配得土壤生态改良修复剂。
[0010] 所述发酵培养包括：
[0011] ⑴对活化后的皮尔瑞俄类芽孢杆菌种进行两级种子发酵培养，得到种子发酵菌 液，且第二级种子发酵培养的初始发酵菌液为第一级种子发酵培养后得到的发酵菌液；
[0012] (2)以种子发酵菌液为初始发酵菌液进行生产扩大培养得到皮尔瑞俄类芽孢杆 菌。
[0013] 所述第一级种子发酵培养的培养基配方为：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%， pH为6?10 ;
[0014] 第二级种子发酵培养的培养基配方为：黄豆饼30g/L，葡萄糖20g/L，NaC15g/ L，MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，FeSO4 · 7H20 0· lg/L，培养 pH 为 6 ?8 ;
[0015] 所述生产扩大培养的培养基配方为：黄豆饼30g/L，地瓜粉5g/L，怡糖25g/L，NaCl 5g/L，MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，FeSO4 · 7H20 0· lg/L，培养 pH 为 6 ?8。
[0016] 所述复配包括：将皮尔瑞尔类芽孢杆菌与有机质及微量元素经粉碎、混合、造粒、 烘干后得土壤生态改良修复剂。
[0017] 本发明皮尔瑞俄类芽孢杆菌土壤生态改良剂含有的有益微生物及抗生物质可防 病、抑菌、抗重茬；含有的多种微生物活性物质、酶、有机酸，可有效改善土壤微生态系统、增 强作物抗逆性、提高产量、改善品质、生态环保；添加的纯天然有机养分能有效改善土壤团 粒结构，使土壤疏松，打破土壤板结，通水透气，提高肥料利用率；添加作物生长所必需的 镁、硼等微量元素，可增强作物抗病、抗旱、抗寒能力。
[0018] 本发明采用生物发酵工艺，在高浓度纯培养有益微生物后进行助剂配伍加工，生 产出微生物土壤生态改良修复剂，营养全面、肥效持久、绿色环保、无污染、能有效改善土壤 微生物环境，提高肥料利用率，以菌抑菌，抗重茬，减少作物病虫害，长期使用效果更佳。
【具体实施方式】
[0019] 解决土壤污染最经济、最安全的途径是采用微生物修复技术，即利用有益微生物 (土著菌、外来菌、基因工程菌）对污染物的代谢作用将其快速降解和转化成无害物质，使 土壤恢复其天然功能，作用方式是通过改变各种环境条件如：营养、氧化还原电位、共代谢 基质，强化微生物降解作用等。
[0020] 有益微生物以其与有害菌竞争营养和空间位点、拮抗作用、溶菌作用、诱导植物抗 性、促生作用等达到防病、抑菌、抗重茬，同时对根际土壤有明显改良作用，促进土壤中各种 养分的有效化，增加速效养分的含量，改善土壤微生态环境等。解除土壤农药残留污染最有 效途径是利用土壤微生物降解作用，一是因为微生物的最终降解产物为H 2O和0)2等，二是 因为微生物具有代谢多样性，可降解几乎所有有机污染物。目前发现可利用的有益微生物 主要包括：假单胞菌属、产氢单胞菌、黄杆菌属、红酵母属、放线菌类细菌、芽孢杆菌类细菌 等50多种。
[0021] 芽孢杆菌具有分布广、生长快、易分离培养、营养简单、无毒无害、耐热抗逆等特 点，已成为微生物菌剂研发重点。皮尔瑞俄类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae)是在 土壤中发现的具有诘抗作用的细菌，最初定名皮尔瑞俄芽孢杆菌（Bacillus peoriae) (Montefusco et al.(美国），1993)，重新定名为皮尔瑞俄类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae) (Heyndrickx et al.(英国），1996 年）。
[0022] 皮尔瑞俄类芽孢杆菌可产生多种活性物质，水解酶类如几丁质酶，纤维素酶；多肽 类抗生素，一种具有抗细菌活性属于多粘菌素；黏菌素一环杆菌素家族，包括如含有二氨基 丁酸结构的polypeptim、jolipeptin、gavascrin和saravalin等，另一种具有抗真菌和放 线菌活性包括gatavalin和thsaricidim。这些物质可起到预防植物病害和抑制植物病原 菌作用，以菌抑菌，抗重茬，最大限度的减轻真菌、细菌和病毒性病害的发生，用作生物肥料 能够在作物根际或体内定殖，能有效改善土壤微生态系统，起到特定肥料效应；还可分泌植 物激素、植物生长素、细胞分裂素促进植物生长。
[0023] 本发明提供一种微生物土壤生态改良修复剂，可以通过皮尔瑞俄类芽孢杆菌三级 培养、发酵，获得高质量菌液，并与有机质、微量元素制剂化成土壤生态改良修复剂，达到高 效抑制病原菌、防病、抗重茬作用。
[0024] 本发明的微生物土壤生态改良修复剂可由皮尔瑞俄类芽孢杆菌的发酵菌液及 有机质、微量元素制剂化而成，各组分的重量百分比可选择：皮尔瑞俄类芽孢杆菌36%? 41 %、有机质53%?58%，微量元素6%。最终有效活菌数彡0.8亿/克，水分兰20%，pH =5.0?8.0,细度彡80目。
[0025] 本发明所述的皮尔瑞俄类芽孢杆菌BC39已在国家知识产权局指定的保藏单位保 藏，保藏日期为2012年3月15日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏编号：CGMCC No. 5900。
[0026] 本发明的菌种活化为皮尔瑞俄类芽孢杆菌的常规菌种活化方法，可选用将保藏的 基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌BC39划线接种于固体种子培养基斜面上，接种前将装有培 养基的三角瓶在121°C条件下灭菌30min，接种量为1. 5?5%，优选2%，培养温度为30? 36°C，光照强度为3500?4500勒克斯，培养时间为5?8天；配成孢子液用于种子罐接种。
[0027] 本发明的种子发酵为二级种子发酵培养，可选用先将一级种子罐灭菌，装入培养 基后再灭菌，冷却至30°C，将孢子液按5?10 %接入培养液中，优选8 %，通入无菌氧气培 养，可得一级种子罐发酵菌；将二级种子种子罐在121°C下灭菌30min，装入培养基后再灭 菌，冷却至30°C，将一级种子罐发酵液按5?10%接种量接二级种子罐，优选8%，通入无菌 氧气，搅拌培养，可得二级种子罐发酵菌液。
[0028] 本发明的生产扩大培养可在生产发酵罐中进行培养。可选用先将发酵罐灭菌，装 入培养基后再灭菌，保压降温到30°C，按5?10%的接种量将二级种子罐发酵液接入发酵 罐中培养，优选8%，通入无菌空气，搅拌培养，可得生产用皮尔瑞尔类芽孢杆菌菌液。
[0029] 本发明制剂的复配可由皮尔瑞俄类芽孢杆菌的发酵菌液、有机质、Fe、Mn、B、Zn、Mo 等微量元素经粉碎、混合搅拌、造粒、烘干、冷却、筛分，制剂化而成。
[0030] 本发明的土壤生态改良修复剂使用方法是于作物生育前期按30?50Kg/亩均匀 播撒或穴施在种植田中，随后翻耕或覆土，可用作基肥、追肥，连年使用可控制重要病害，增 强抗逆性，提高产量和品质。
[0031] 实施例1 :
[0032] 该实施例为土壤生态改良修复剂的制备：
[0033] 选用菌种：取自杨凌绿都生物科技有限公司菌种库的皮尔瑞俄类芽孢杆菌，优选 基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌BC39。
[0034] 以下分别为皮尔瑞俄类芽孢杆菌的培养、发酵培养基：
[0035] 第一级种子发酵培养的培养基配方为：酵母膏1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%，pH为 7. 2。
[0036] 第二级种子发酵培养的培养基配方为：黄豆饼30g/L，工业葡萄糖20g/L，NaCl 5g/L, MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，FeSO4 · 7H20 0· lg/L，pH 为 6. 9。
[0037] 生产扩大培养的配方：黄豆饼30g/L，地瓜粉5g/L，怡糖25g/L，NaCl 5g/L， MgSO4 · 7H20 0· lg/L，K2HPO4O. lg/L，FeSO4 · 7H20 0· lg/L，pH 为 6· 7。
[0038] 制备流程如下：
[0039] (1)菌种活化
[0040] 将保藏的基因重组皮尔瑞俄类芽孢杆菌BC39划线接种于固体种子培养基斜面 上，接种前将装有培养基的三角瓶在121°C条件下灭菌30min，按接种量2%接种，培养温度 为33°C，光照强度为4000勒克斯，培养时间为6天；配成孢子液用于种子罐接种。
[0041] (2)种子罐发酵
[0042] 先将一级种子罐灭菌，装入培养基后再灭菌，冷却至30°C，将孢子液按8%接入 培养液中，通入无菌氧气培养，搅拌培养，可得一级种子罐发酵菌；将二级种子种子罐在 121°0下灭菌3〇11^11，装入培养基后再灭菌，冷却至30°0，将孢子液按8%接入培养液中，通 入无菌氧气，搅拌培养，可得二级种子罐发酵菌液。
[0043] (3)生产发酵罐培养
[0044] 先将发酵罐灭菌，装入培养基后再灭菌，保压降温到30°C，按8%的接种量将二级 种子罐发酵液接入发酵罐中培养，通入无菌空气，搅拌培养，可得生产用皮尔瑞尔类芽孢 杆菌菌液。
[0045] 过程中的灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121°C，压力0· 3?0· 5kg/cm2条件下灭菌 30min。一级种子罐培养条件，氧气通气量与发酵液体积比保持1:0. 5,机械搅拌270rpm， 30°C恒温培养24h ;二级种子罐培养条件，氧气通气量与发酵液体积比保持1:0. 5,机械搅 拌220rpm，30°C恒温培养24h ;发酵罐接种后，氧气通气量与发酵液体积比保持1:0. 5,机械 搅拌140rpm，30°C恒温培养65h。
[0046] (4)制剂配制
[0047] 将步骤⑶得到微生物菌液原料，再加入有机质，硫酸铁、硫酸锰、硼酸、硫酸锌和 钼酸铵，经粉碎、混合搅拌、造粒、烘干、冷却、筛分等程序制剂化得土壤生态改良修复剂，各 组分的体积百分比为：皮尔瑞俄类芽孢杆菌38 %、有机质56 %，微量元素6 %。最终有效活 菌数=I. 1亿/克，水分18%，pH = 6. 6,细度彡80目。
[0048] 实施例2 ：
[0049] 该实施例为利用实施例1制得的土壤生态改良修复剂防治小麦全蚀病：
[0050] 试验地设在西北农林科技大学附近试验田，连续种植小麦10年以上，目前小麦全 蚀病发生处于上升态势，小麦长势不好，白株死苗率严重。
[0051] 试验设置施用皮尔瑞俄芽孢杆菌土壤生态改良修复剂40千克/亩处理，施用枯草 芽孢杆菌复合微生物菌肥40千克/亩处理，不施任何土壤修复剂对照3个处理，3次重复， 每一小区50m 2。
[0052] 播种前按试验设计在小区内均匀撒施皮尔瑞俄类芽孢杆菌土壤生态改良修复剂、 枯草芽孢杆菌复合微生物菌肥，撒施后随播种盖土。按照常规方法进行田间管理，发病盛期 调查小麦全蚀病病病情指数，计算防治效果，收货时测产，结果见表1 :
[0053] 表1皮尔瑞俄芽孢杆菌土壤生态改良修复剂与常规菌肥防治小麦全蚀病效果对 比
[0054]
【权利要求】
1. 皮尔瑞俄类芽孢杆菌作为土壤生态改良修复剂的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮尔瑞俄类芽孢杆菌为皮尔瑞俄类芽 孢杆菌BC39,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5900〇
3. -种土壤生态改良修复剂，其特征在于，该土壤生态改良修复剂包括皮尔瑞俄类芽 孢杆菌、有机质和微量元素。
4. 如权利要求3所述的土壤生态改良修复剂，其特征在于，所述有机质为动物腐殖质 和植物腐殖质中的一种或两种的混合物。
5. 如权利要求3所述的土壤生态改良修复剂，其特征在于，所述微量元素为Fe、Mn、B、 Zn和Mo中的一种或两种以上。
6. 权利要求3所述土壤生态改良修复剂的使用方法，其特征在于，于作物生育前期按 30?50Kg/亩均匀播撒或穴施在种植田中，随后翻耕或覆土。
7. -种土壤生态改良修复剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：对皮尔瑞俄 类芽孢杆菌种进行发酵培养后获皮尔瑞俄类芽孢杆菌，再将皮尔瑞俄类芽孢杆菌与有机质 和微量元素复配得土壤生态改良修复剂。
8. 如权利要求7所述的土壤生态改良修复剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养 包括： (1) 对活化后的皮尔瑞俄类芽孢杆菌种进行两级种子发酵培养，得到种子发酵菌液，且 第二级种子发酵培养的初始发酵菌液为第一级种子发酵培养后得到的发酵菌液； (2) 以种子发酵菌液为初始发酵菌液进行生产扩大培养得到皮尔瑞俄类芽孢杆菌。
9. 如权利要求7所述的土壤生态改良修复剂的制备方法，其特征在于： 所述第一级种子发酵培养的培养基配方为：酵母膏1 %、蛋白胨2 %、葡萄糖2 %，pH为 6 ?10 ; 所述第二级种子发酵培养的培养基配方为：黄豆饼30g/L，葡萄糖20g/L，NaCl 5g/ L，MgS04 ? 7H20 0? lg/L，K2HP040. lg/L，FeS04 ? 7H20 0? lg/L，pH 为 6 ?8 ; 所述生产扩大培养的培养基配方为：黄豆饼30g/L，地瓜粉5g/L，怡糖25g/L，NaCl 5g/ L，MgS04 ? 7H20 0? lg/L，K2HP040. lg/L，FeS04 ? 7H20 0? lg/L，pH 为 6 ?8。
10. 如权利要求7所述的土壤生态改良修复剂的制备方法，其特征在于，所述复配包 括：将皮尔瑞尔类芽孢杆菌与有机质及微量元素经粉碎、混合、造粒、烘干后得土壤生态改 良修复剂。
【文档编号】C09K17/00GK104498041SQ201410629067
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月10日 优先权日:2014年11月10日
【发明者】杨轩, 杨长锁, 谢咸升, 付强, 安天赐, 田佳, 安德荣 申请人:杨凌绿都生物科技有限公司