一种空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针及其应用的制作方法

本发明涉及一种线粒体膜电位荧光探针及其应用，尤其涉及一种空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针及其在荧光成像显示不同状态的线粒体膜电位或在同时检测、显示或区分死活细胞中的应用。

背景技术：

线粒体膜电位(MMP)是表示线粒体功能的重要参数，它的降低预示着线粒体呼吸链的损坏从而导致细胞功能紊乱甚至死亡。因此，来自不同状态MMP的反馈对于生物研究以及相关疾病的诊断是非常重要的。通常来讲，健康细胞的MMP是正常的；处于降低状态的MMP预示着某些功能性紊乱，例如，精子MMP的降低表明精子活性下降；处于消失状态的MMP表明细胞进入疾病状态，比如，MMP消失的疟疾虫表明其应经被青蒿素杀死了。因此，开发一种新的探针去方便有效地检测MMP的不同状态在生物和医学研究中是非常有意义的。

到目前为止，检测MMP的探针可以分为两类：1)荧光强度探针，主要代表有带有聚集淬灭效应的罗丹明123、TMRE和TMRM。它们可以聚集在带有正常MMP的线粒体上并且由于高浓度产生的淬灭效应发出较弱的荧光。当MMP降低时，部分的探针释放到胞质中，其余的仍然存留在线粒体上，此时这些探针的浓度降低发出较强的荧光。当MMP消失后，所有的探针都释放达到胞质中去，并且仍然是处于低浓度的探针发出与降低状态相似的荧光。因此，这就很难通过荧光照片来区分降低状态的MMP和消失状态的MMP。2)双色荧光探针，主要代表是JC-1。在MMP高的时候它处于聚集态并且发射出红色的荧光，在MMP低的时候它处于单体态并且发射出绿色的荧光。因此可以通过比较颜色变化用来判断MMP的高低。然而，当染色浓度稍低时，所述双色荧光探针就很难形成聚集体，当染色浓度稍高时，又因其很差的水溶性会形成块状沉淀阻碍观察。因此在每次实验之前都要进行反复地浓度调试，这无疑给实验操作和检测带来的很大的不便。基于此，开发一种方便有效的空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针来检测不同状态的MMP或利用其同时检测或显示死活细胞具有重要意义，也是目前迫切需要解决的科研课题。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针及其应用。

本发明所述的空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是式(I)所示结构的化合物：

式(I)所示化合物的化学名称为1-丁烷基-4-((E)-2-(9(2-乙氧基乙基)-6-((E)-2-(吡啶-4-)乙烯基)-9-咔唑-3)-乙烯基)-吡啶碘盐。简称：LAD。

上述式(I)所示化合物(LAD)的制备方法概述如下：

在干燥的三口瓶中加入9-(2-乙氧基乙基)-3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶基)-咔唑，甲醇，通氮气保护，升温至55℃，加热30min后全部溶解，加入0.168g化合物6(N-丁烷基-4-甲基吡啶碘盐)，滴加哌啶6滴，升温至回流，过夜，停止加热，冷却后蒸干溶剂，用甲醇重结晶，干燥，得到的深红色粉末即为LAD。

上述式(I)所示化合物(LAD)制备反应式如下：

本发明所述空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针在标记或显示线粒体在活细胞中分布的应用。

其中：所述活细胞为永生化细胞或正常细胞。进一步的：所述永生化细胞优选为HeLa或SiHa细胞，所述正常细胞优选为HUVEC细胞。

本发明所述空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针在检测或显示线粒体膜电位(MMP)升高、降低或消失状态中的应用。

本发明所述空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针在同时检测或显示死活细胞中的应用。

试验结果证实，本发明所述空间依赖型探针在MMP正常状态下全部聚集在线粒体上，随着MMP的降低逐渐向细胞核里移动，最终当MMP完全消失时全部靶向到细胞核上。这一实验事实证明对处于不同状态下的MMP，探针LAD可以提供与之一一对应的荧光图像，从而直观、高效地检测MMP的变化，为MMP相关的病理学研究带来了极大的方便。另外，探针LAD不仅能够检测到MMP降低的过程，而且对于MMP由低逐渐恢复正常的过程也可以给出直观的图像，这对于长时间追踪MMP的波动、监控某些相关疾病发生有非常重要的意义。

值得注意地是，实验结果表明探针LAD可以在同一个细胞群落中检测、显示或区分死活细胞。目前，最广泛使用的区分死活细胞的工具要包括两种探针，但其使用时要对两种探针进行分别染色，并且要分别进行激发和收集荧光。与之先比，仅用本发明的一个探针LAD去完成死活细胞的区分不仅节省了时间提高了效率，并且中间省去繁琐步骤降低了成本，对仪器的要求也会随之降低。

综上，本发明所述的空间依赖型的线粒体膜电位荧光探针实现了荧光成像显示不同状态的线粒体膜电位或在同时检测、显示或区别死活细胞中的应用，预示其在生物研究和医疗诊断方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1：LAD依次对活SiHa细胞(a)和HUVEC细胞(b)进行染色后，488nm激光辐照下收集得到的单光子荧光显微照片。

图2：LAD和线粒体红(MTR)依次对活SiHa细胞进行染色后，分别在405和561nm激光辐照下分为两个通道收集得到的单光子荧光显微照片。其中a图为405nm激发绿色通道的照片，b为561nm激发红色通道的照片，c为a、b叠加图片，d图为c图中画线位置两个通道中荧光强度分布图。

图3：将SiHa细胞(a,b)和HUVEC细胞(b)分别用多聚甲醛固定30min(a)和CCCP处理30min(b,c)后,再用LAD对其分别进行染色。然后在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。

图4：(a)LAD与DNA的荧光滴定实验，激发波长458nm,(b)根据图a由Scatchard方程所得的拟合直线，其中[LAD]＝[phosphate in DNA]＝0–20mM，结合常数为8.30×10⁵M^-1,结合位点为1.72phosphates/dye,直线拟合优度:R²＝0.979。

图5：LAD对用H2O2(3‰,10μL)处理之前(a,Control)和之后1,2,5,8,10,12min的SiHa细胞分别进行染色，在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。h：将g的颜色用绿色代替之后与a进行叠加所得到的图片。i:不同H2O2处理时间下的细胞核的荧光强度与整个细胞的荧光强度的比值。实验做了3次，通过统计方差进行标示。

图6：LAD对用H2O2(3‰,10μL)处理之前(a,Control)和之后1,3,6,8,10min的HeLa细胞分别进行染色，在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。g:不同H2O2处理时间下的细胞核的荧光强度与整个细胞的荧光强度的比值。实验做了3次，通过统计方差进行标示。

图7：LAD对用CCCP(20μM)处理之前(a,Control)和之后(b-f,2-20min)以及洗去CCCP后(g-j,2-18min)的SiHa细胞分别进行染色，在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。k:不同CCCP处理时间下的细胞核的荧光强度与整个细胞的荧光强度的比值。实验做了3次，通过统计方差进行标示

图8：LAD和SYTOX蓝色核酸染料(S-11348)依次对活SiHa细胞进行染色后，分别在共聚焦荧光显微镜下得到的荧光显微照片。其中a图为473nm激发，500-600nm收集的绿色通道的照片，b为405nm激发,410-460nm收集的蓝色通道的照片，d为a、b和DIC图的合并图片。

具体实施方式

实施例1

LAD的合成与表征

在100mL干燥的三口瓶中加入0.185g化合物9-(2-乙氧基乙基)-3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶基)-咔唑，25mL已除水甲醇，通氮气保护，升温至55℃，加热30min后全部溶解，加入0.168g化合物6(N-丁烷基-4-甲基吡啶碘盐)，滴加哌啶6滴，升温至回流，过夜，停止加热，冷却后蒸干溶剂，用甲醇重结晶，干燥，得到深红色粉末0.06g，产率约为20％。

¹H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ(ppm):8.92(d,J＝6.6Hz,2H),8.55(m,4H),8.24(t,J＝7.8Hz,3H),7.88(m,2H),7.77(dd,J＝8.3Hz,2H),7.72(s,1H),7.58(m,3H),7.31(m,1H),4.63(t,J＝4.8Hz,2H),4.49(t,J＝7.2Hz,2H).3.78(t,J＝6.6Hz,2H),3.38(q,J＝7.0Hz,2H),0.91(m,2H),0.32(m,2H),0.95(m,6H).13C NMR(DMSO-d6,75MHz):δ(ppm):153.85,150.49,145.20,144.46,142.90,142.75,141.69,134.30,128.71,127.18,126.88,126.88,126.19,124.04,123.19,123.97,121.57,121.06,120.75,119.81,111.32,111.20,69.68,66.11,59.74,43.55,32.96,19.28,15.45,13.83.HRMS(m/z):calcd for C34H36IN3O:629.57；found:502.18(M-I)⁺。

实施例2

永生化细胞(SiHa和HeLa)和正常细胞(HUVEC)培养

所有的细胞株都是在37℃，5％CO2的饱和湿度孵箱中培养。SiHa和HeLa细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清H-DMEM培养液中(含1％双抗)。HUVEC细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清M199培养液中(含2ng/mL FGF-2)。待细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将100mL细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍，用1mL 0.25％胰酶消化3-5分钟，小心地倒出培养基，加入少量新鲜培养基吹打均匀，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1×10⁵)，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入CO2培养箱中培养，使细胞爬片生长。

实施例3

LAD染色带有正常MMP的SiHa、HUVEC细胞以及与MTR复染实验

将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，2μM LAD染色细胞，在CO2培养箱中培养15min后吸出培养液，并用PBS洗三遍，洗去未结合的多余染液，，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，LAD在细胞内分布区域呈花丝状与线粒体很相似，所以接下来通过与商业化线粒体探针MTR的复染实验来证明LAD在带有正常MMP的SiHa和HUVEC细胞中染色位置是否为线粒体。

将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，2μM LAD染色细胞，在CO2培养箱中培养15min后吸出培养液，并用PBS洗三遍，洗去未结合的多余染液，用0.2μM MTR染色细胞，在CO2培养箱中30min。将染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，MTR和LAD在细胞内分布区域相似，计算SiHa细胞的平均共定位率为0.87。因此，证实了本发明所述探针LAD在MMP处于正常状态下能专一性地成像线粒体。

结果见图1和图2。

图1：LAD依次对活SiHa细胞(a)和HUVEC细胞(b)进行染色后，488nm激光辐照下收集得到的单光子荧光显微照片。

图2：LAD和线粒体红(MTR)依次对活SiHa细胞进行染色后，分别在405和561nm激光辐照下分为两个通道收集得到的单光子荧光显微照片。其中a图为405nm激发绿色通道的照片，b为561nm激发红色通道的照片，c为a、b叠加图片，d图为c图中画线位置两个通道中荧光强度分布图。

实施例4

LAD染色MMP处于消失状态的SiHa、HUVEC细胞实验以及机理研究

首先将接种好的两个SiHa细胞爬片和一个HUVEC细胞用PBS洗三遍，一个SiHa细胞爬片用多聚甲醛固定30min，另外两个爬片用CCCP处理30min，然后用PBS洗三遍并用2μM LAD染色细胞，在CO2培养箱中15min。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在显微镜下观察细胞。结果发现，三个细胞爬片的染色位置均集中在细胞中间类似于细胞核的位置，与DIC图片叠加后发现其染色位置恰好是细胞核。因此，证实了本发明所述探针LAD在MMP处于消失状态下仅仅靶向到细胞核上。

向LAD的溶液中逐渐滴加DNA，并分别测试其紫外和荧光强度。根据所得的紫外和荧光光谱计算其结合常数，方程如下：r/Cf＝kn–kr。k表示结合常数，n代表探针所结合磷酸盐的数量，r是指结合上DNA的探针的浓度与总DNA浓度的比值，Cf是指游离的探针的浓度。

结合上DNA的探针浓度计算方程式如下：Cb＝Ct[(F-F0)/Fmax-F0)]。Ct是指全部探针的浓度，F是指在所给DNA浓度下的荧光强度，F0是指未加DNA时探针的荧光强度，Fmax是指探针结合DNA达到饱和时的荧光强度。

根据以上方法，计算出CAI和9E-BMVC的结合常数，并对其进行比较，可得LAD的结合常数在CAI和9E-BMVC之间。从而得出结论：具有这种空间依赖型的线粒体膜电位探针与DNA的结合常数数量级应该在10⁵左右。

结果见图3和图4。

图3：将SiHa细胞(a,b)和HUVEC细胞(b)分别用多聚甲醛固定30min(a)和CCCP处理30min(b,c)后,再用LAD对其分别进行染色。然后在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。

图4：(a)LAD与DNA的荧光滴定实验，激发波长458nm,(b)根据图a由Scatchard方程所得的拟合直线，其中[LAD]＝[phosphate in DNA]＝0–20mM，结合常数为8.30×10⁵M^-1,结合位点为1.72phosphates/dye,直线拟合优度:R²＝0.979。

实施例5

LAD染色处于降低状态MMP的SiHa、HeLa细胞实验

首先，将接种好的SiHa、HeLa细胞爬片用PBS洗三遍，2μM LAD染色细胞，在CO2培养箱中15min。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞的着色情况，然后加入H2O2，观察随着H2O2加入时间的延长荧光位置逐渐向细胞核里移动。同时计算出细胞核里荧光强度与整个细胞的荧光强度的比值，可以看到，随着H2O2加入时间的增加，比值逐渐增加。以上数据表明线粒体膜电位处于降低状态时，LAD可以同时靶向到线粒体与细胞核，并且线粒体膜电位降低程度越大，靶向到核里的越多。

又因为生物体内的多种因素导致线粒体膜电位不止是降低的，而是处于波动状态的。因此选取了CCCP来处理线粒体膜电位使其降低又通过将其洗去来使得线粒体膜电位恢复原态。将接种好的SiHa细胞爬片用PBS洗三遍，2μM LAD染色细胞，在CO2培养箱中15min。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞的着色情况，然后加入CCCP，观察随着CCCP加入时间的延长荧光位置逐渐向细胞核里移动。直到加入20min后，荧光几乎全部出现在细胞核中。然后将细胞内的CCCP洗掉，观察细胞内荧光位置的变化。可以看到，随着CCCP洗出时间的增加，荧光逐渐向线粒体上移动，直到18分钟后，几乎所有的荧光都出现在线粒体上。同时计算出细胞核与整个细胞的荧光强度比，与荧光强度的变化完全相符。说明LAD不仅仅能够检测到线粒体膜电位降低的过程同时也能够检测到线粒体膜电位升高的过程。

结果见图5，图6和图7。

图5：LAD对用H2O2(3‰,10μL)处理之前(a,Control)和之后1,2,5,8,10,12min的SiHa细胞分别进行染色，在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。h：将g的颜色用绿色代替之后与a进行叠加所得到的图片。i:不同H2O2处理时间下的细胞核的荧光强度与整个细胞的荧光强度的比值。实验做了3次，通过统计方差进行标示。

图6：LAD对用H2O2(3‰,10μL)处理之前(a,Control)和之后1,3,6,8,10min的HeLa细胞分别进行染色，在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。g:不同H2O2处理时间下的细胞核的荧光强度与整个细胞的荧光强度的比值。实验做了3次，通过统计方差进行标示。

图7：LAD对用CCCP(20μM)处理之前(a,Control)和之后(b-f,2-20min)以及洗去CCCP后(g-j,2-18min)的SiHa细胞分别进行染色，在488nm激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。k:不同CCCP处理时间下的细胞核的荧光强度与整个细胞的荧光强度的比值。实验做了3次，通过统计方差进行标示

实施例6

LAD能够同时区分死活细胞

SYTOX蓝色核酸染料(S-11348)是一种商业化的只染死细胞中核酸的蓝色荧光染料。将接种好的SiHa细胞爬片用PBS洗三遍，2μM LAD染色细胞，在CO2培养箱中30min。吸出培养液，并用PBS洗三遍，洗去未结合的多余染液。然后用5μM S-11348染色细胞，在CO2培养箱中30min。。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在共聚焦荧光显微镜下观察细胞。S-11348着色的细胞，LAD只染色到细胞核上，而LAD染色线粒体的细胞，S-11348并没有发光，说明LAD只染色活细胞中的线粒体而对于死细胞LAD只染色其细胞核。因此通过荧光照片LAD可以简单清晰的区分出细胞的死活。而目前商业化的方法来区分死活细胞要需要两种染料同时染色细胞，操作复杂，相比之下，LAD的使用会简化操作步骤，更加快速方便地进行区分具有良好的商业前景

结果见图8。

图8：LAD和SYTOX蓝色核酸染料(S-11348)依次对活SiHa细胞进行染色后，分别在共聚焦荧光显微镜下得到的荧光显微照片。其中a图为473nm激发，500-600nm收集的绿色通道的照片，b为405nm激发,410-460nm收集的蓝色通道的照片，d为a、b和DIC图的合并图片。