两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料的制备方法及其标记细胞膜的应用与流程

本发明属于生物标记技术领域，具体而言，涉及两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料及其制备方法和在活体细胞膜标记荧光成像方面的应用。

背景技术：

在生物和医学研究领域里，生物荧光成像由于其检测仪器发展成熟、灵敏度高、对比度高、分辨率高、成像直观、成像速度快和无损探测等优点在生理和病理研究等方面被广泛应用。生物荧光成像依赖光学分子探针的发展，尤其是无毒，不影响生物的功能，长效作用的荧光染料分子。一张直观、清晰的静态或者动态的图像可以用来分析细胞或生物体特定区域的特征、状态，甚至特定分子的表达、分布等信息。而其中细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，它保证了细胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序运行。同时细胞必须与周围环境发生信息、物质与能量的交换，才能完成特定的生理功能。因此开发一类标记细胞膜，效果稳定、长效的动态监测对生命科学十分重要。

在众多荧光有机化合物中，苝及其衍生物具有很好的光、热、化学稳定性，荧光量子产率高，荧光发射峰窄而且发射波长可以有效避开细胞自身的背景干扰，提高信噪比。由于其优异的染色性能，已经被广泛应用于激光染料以及生物荧光探针领域。针对目前商业化的细胞膜染料的较差稳定性，作用时间短的缺陷，因此开发一种能稳定性好、标记作用时间更长并且能够动态监测细胞膜的特异性标记荧光染料具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一类光、热稳定性好、水溶性良好、结构可设计的两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料及其制备方法，该类染料可用于活体细胞膜标记，并能够实现对活细胞膜长时间动态监测。

本发明的技术方案为：使用光、热稳定性优良的苝类发色团、脂肪胺、N,N-二甲基乙二胺为原料，一步法制备得到不对称可继续功能化的苝酰亚胺衍生物，然后通过叔氨基引发磺酸内酯的开环进一步将双离子基团引入染料分子。双离子基团的引入既增加了结构的水溶性，又提供了可以和膜表面相结合的极性基团，而且双离子基团具有较高的电解质缓冲能力与低的细胞毒性，这都提高了染料在细胞内的作用时间。由于合理的设计平衡了苝酰亚胺染料结构的疏水与亲水部分，染料分子可以在水溶液中组装成粒径100-200nm的表面含有正负离子的囊泡。这种囊泡可以通过内吞作用进入细胞，在细胞内的溶酶体酸性内环境下解组装成单分子后，融入细胞内的膜结构，从而标记细胞内的膜结构。在活体昆虫肠道内的酸性环境下，这种囊泡解组装成单分子，从而直接标记活体肠细胞质膜。

本发明所述的两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料结构式为：

其中，R₁＝H，R₂＝Cl或Br；或者R₁＝R₂＝H，Br或Cl中的任意一种；m＝1-5。

上述两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料的制备方法为：通过叔氨基引发磺酸内酯的开环将双离子基团引入带叔胺基团的不对称苝酰亚胺衍生物得到两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料。

进一步的，带叔胺基团的不对称苝酰亚胺衍生物与1,3-丙磺酸内酯以摩尔比1：1-10于二氯甲烷中，在氮气保护下，室温回流反应得到两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料。

进一步的，所述带叔胺基团的不对称苝酰亚胺衍生物的制备方法为将苝四羧酸二酐类荧光核和辛胺溶于甲醇中，在氮气保护下，第一次升温回流反应，经浓缩、冲洗和真空干燥，得到暗红色固体后，与咪唑，N,N-二甲基乙二胺，在氮气保护下，第二次升温回流反应，得到带叔胺基团的不对称苝酰亚胺衍生物，其中，苝四羧酸二酐类荧光核、辛胺、N,N-二甲基乙二胺以摩尔比1：1-5：1-5。

优选的，所述苝四羧酸二酐类荧光核为海岛位取代的1,7-二氯-3,4,9,10-苝四羧酸二酐、1,7-二溴-3,4,9,10-苝四羧酸二酐、1,6,7,12-四氯-3,4,9,10-苝四羧酸二酐、1,6,7,12-四溴-3,4,9,10-苝四羧酸二酐或海岛位未取代的苝四羧酸二酐中的任意一种或几种。

优选的，所述第一次和第二次升温回流反应温度范围为85℃到120℃，反应时间为10-12h。

可替换的，所述带叔胺基团的不对称苝酰亚胺衍生物的制备方法为苝四羧酸二酐类荧光核、辛胺、N,N-二甲基乙二胺以摩尔比1：1-5：1-5于甲苯中，在氮气保护下，升温回流反应，得到带叔胺基团的不对称苝酰亚胺衍生物。

优选的，所述苝四羧酸二酐类荧光核为海岛位取代的1,7-二氯-3,4,9,10-苝四羧酸二酐、1,7-二溴-3,4,9,10-苝四羧酸二酐、1,6,7,12-四氯-3,4,9,10-苝四羧酸二酐、1,6,7,12-四溴-3,4,9,10-苝四羧酸二酐或海岛位未取代的苝四羧酸二酐中的任意一种或几种。

优选的，所述升温回流反应温度范围为85℃到120℃，反应时间为10-12h。

将上述两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料用于活体标记细胞膜荧光成像。

上述两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料在活细胞内膜标记荧光成像的应用。

本发明具有如下有益技术效果：

1、本发明提供的两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料紫外吸收和荧光发射均可以有效避免生物成像中自体荧光背景的干扰，提高信噪比。

2、本发明提供的两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料具有水溶性，引入了抗电解质缓冲能力强的双离子基团并且具有较低的生物毒性。

3、本发明提供的两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料，由于采用光、热稳定性优良的苝做荧光发色团，因而可以长时间稳定标记活细胞内膜，标记持续时间可达72小时以上。

4、本发明提供的两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料设计简单，合成方便，原料经济，结构光稳定性好，毒性低，并且可以通过简单的方式标记活体组织的细胞膜，是一类新型的长时间特异性标记活体细胞膜染料。

附图说明

图1本发明中用到的荧光发色团。

图2合成两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料的反应流程图。

图3实施例1中产物的核磁氢谱表征。

图4实施例1中产物的核磁碳谱表征。

图5实施例1中产物的质谱表征。

图6为实施例1中两亲性对称苝酰亚胺染料P1的光谱性能。

图7为实施例1中P1标HeLa细胞膜的共聚焦荧光成像。

图8为实施例1中P1标记活昆虫活体肠道质膜的共聚焦荧光成像。

图9为实施例1中P1的细胞毒性测试。

图10两亲性不对称双离子苝酰亚胺与细胞膜结合的示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用原料均为市售商品。

实施例1

1、将3,4,9,10-苝四羧酸二酐527mg(1mmol)、辛胺130mg(1mmol)溶于15ml甲醇中，加入到50mL三口瓶中，随后用橡胶塞密封体系，在氮气保护下，磁力搅拌30min，升温到85℃回流。经过12h反应。反应物经过浓缩后，用乙醇冲洗得到沉淀。浓缩真空干燥后，得到暗红色固体。

将上述暗红色固体，咪唑10g，N,N-二甲基乙二胺106mg(1.2mmol约132ul)加入到三口瓶中，随后用橡胶塞密封体系，在氮气保护下，升温到120℃回流反应。经过12h反应。反应物经过浓缩后，过滤得到沉淀，用大量的水洗涤后，用柱层析硅胶柱分离接取第二个点，淋洗剂用三氯甲烷。浓缩真空干燥后，得到218mg产物1(产率26％)。

2、将上述产物1 57mg(0.1mmol)加入聚合管中，再加入10ml二氯甲烷，置于室温水浴中搅拌，再将4uL 1,3-丙磺酸内酯5.5mg(约0.045mmol)加入到体系，氮气保护环境下，30℃下回流反应。反应完全后，除去溶剂在正己烷中沉淀得到62mg产物P1(产率93％)。

两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料的毒性测试：将不同浓度的上述苝酰亚胺染料P1，商业化细胞膜染料DiI分别与果蝇S2细胞仪器培养24小时，检测细胞存活率，高浓度下与P1一起培养的细胞存活率仍高于90％。

两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料长效标记细胞膜的动态监测：将P1与商业化染料DiI与活HeLa细胞一起培养，在0到48小时内观察二者的荧光。DiI仅在2小时内有较高的荧光强度，但P1直到48小时还有很强的荧光，表明P1可用于长时间标记细胞膜，实现动态监测细胞膜。

两亲性不对称双离子苝酰亚胺染料长效标记昆虫活体肠道细胞膜：将P1添加到果蝇幼体的食物中喂养三天后。将果蝇肠道围食膜剥离后，荧光成像中观察到P1清晰的标记了肠道细胞膜。

实施例2

1、将1,6,7,12-四氯-3,4,9,10-苝四羧酸二酐530mg(1mmol)、辛胺130mg(1mmol)溶于15ml甲苯中，加入到50mL三口瓶中，用微量进样器取N,N-二甲基乙二胺106mg(1.2mmol约132ul)加入到体系，随后用橡胶塞密封体系，在氮气保护下，磁力搅拌30min，升温到105℃回流。经过12h反应。反应物经过浓缩后，用柱层析硅胶柱分离接取第二个点，淋洗剂用二氯甲烷/正己烷(v/v＝1/1)。浓缩真空干燥后，得到278mg产物2(产率39％)。

2、将上述产物1 46mg(0.05mmol)加入聚合管中，再加入10ml二氯甲烷，置于室温水浴中搅拌，再将4uL 1,3-丙磺酸内酯5.5mg(约0.045mmol)加入到体系，氮气保护环境下，30℃下回流反应。反应完全后，除去溶剂在正己烷中沉淀得到40mg产物P2(产率93％)。

两亲性不对称双离子苝酰亚胺标记细胞膜荧光成像：将上述合成的苝酰亚胺染料P2与活HeLa细胞一起培养24小时，染料能够特异性标记出细胞膜，并具有较高的荧光强度。

本发明使用海岛位氯或溴取代的苝四羧酸二酸酐或海岛位未修饰的苝四羧酸二酐为荧光发色团，在双端分别引入疏水烷基链和亲水双离子基团得到一类两亲性不对称双离子苝酰亚胺荧光染料。双离子基团的引入提高了结构整体的水溶性与生物相容性并且降低了结构整体的细胞毒。所有染料均可用于体外和体内细胞膜标记荧光成像。由于采用了光化学稳定性好，发射波长近红外的苝作为荧光发色团，以及双离子结构与膜结构的静电力作用，在生物成像过程中可大大提高其有效标记时间，持续时间可达72小时以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。