一种高荧光氮掺杂碳量子点、其制备方法及应用与流程

本发明属于碳纳米材料领域，具体涉及一种高荧光氮掺杂碳量子点，同时还涉及该高荧光氮掺杂碳量子点的制备方法，及该高荧光氮掺杂碳量子点在生物成像中的应用。

背景技术：

重金属量子点因其出色的发光性能被广泛的研究，然而，他们大部分具有较高的毒性和较高的生产成本。探究生物相容性好、优良光致发光性能、低毒，较小粒径的荧光材料，并满足生物成像、药物运输、荧光油墨等应用，具有较大潜在应用价值。荧光碳量子点由生物相容性优异的碳元素作为核心组件，量子点材料因其纳米大小又常表现出宏观尺寸材料所不具备的特异性能，并具有良好的光学性能，高亮度和小尺寸是碳量子点最具吸引力的两个优点，因而吸引了科学家极大的关注。因碳量子点的平均尺寸小于10nm，易进入细胞或动物体后仍保持荧光性能，可用为荧光探针跟踪生物大分子或生物反应过程。因此，荧光碳量子点具有广泛的应用前景，包括生物传感、成像、光催化、药物运输和荧光油墨等领域。

目前，研究者建立了多种制备荧光碳量子点的方法：激光刻蚀法、电弧放电法、化学氧化法、电化学法、超声处理、微波辐射法和水热法。其中，水热法被认为是一种简单、高效制备荧光碳量子点的方法，它是将所选碳源置于密闭的水热反应釜中，高温下水热反应釜内会产生高压环境,使碳源发生碳化形成碳量子点，水热法具有成本低、产率高、后处理简单等优势，目前己广泛应用于碳量子点制备领域，但其碳量子点的荧光活性位点少、产率低(大部分小于15％)、选择性等成为发展的瓶颈。近年来，通过异原子掺杂等方法来克服，提高其产率及增加活性位点，其中采用氮掺杂是目前研究最多的方法，但普遍存在氮掺杂荧光效率不高，制备复杂。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种荧光效率高，制备简单，低毒、良好的生物相容性及水溶性、粒径小的高荧光氮掺杂碳量子点。

本发明的另一目的在于提供该高荧光氮掺杂碳量子点的制备方法。

本发明的再一目的在于提供该高荧光氮掺杂碳量子点在豆芽和宫颈癌细胞成像中的应用。

本发明的一种高荧光氮掺杂碳量子点，其氮的含量可达15.5～19.2％，平均荧光寿命为4.41～4.51ns，荧光量子产率最高可达20.3～32.9％。

本发明的一种高荧光氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将l-瓜氨酸溶解于去离子水中使其浓度为0.010～0.040g/ml，超声震荡5～20min，再采用水热法在180～220℃反应8～24h获取碳点溶液；

(2)将碳点溶液在17000～20000r/min超速离心20～40min，再用0.22μm滤膜过滤，获得碳点溶液。

本发明的高荧光氮掺杂碳量子点在豆芽和宫颈癌细胞中的应用。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明采用前驱体l-瓜氨酸为碳源，采用一步水热法制备氮掺杂的碳量子点，本发明具有低细胞毒性和良好的生物相容性及水溶性，低毒，粒径小等特点。适用于体内外荧光成像、药物运输、荧光油墨等领域。与其他含氮有机物为碳源合成的碳量子点相比，本发明制备的氮掺杂的碳量子点中氮的含量为15.5～19.2％，平均荧光寿命为4.46ns，荧光量子产率最高可达32.9％，且具有低细胞毒性和良好的生物相容性，在豆芽和宫颈癌细胞生物成像中具有广泛的应用价值。

附图说明

图1本发明的氮掺杂碳量子点的红外表征。

图2本发明的氮掺杂荧光碳量子点的光电子能谱图，其中(a)是全谱图，(b)是碳元素的分峰图，(c)是氮元素的分峰图，(d)是氧元素的分峰图。

图3本发明的氮掺杂荧光碳量子点的荧光寿命图。

图4本发明的的氮掺杂碳量子点在不同激发波长下对应的发射光谱图。

图5本发明的氮掺杂碳量子点的扫描电镜(a)和透射电镜(b)图。

图6本发明的氮掺杂荧光碳量子点的原子力显微镜表征图。

图7本发明的氮掺杂碳量子点的粒径分布图。

图8本发明的氮掺杂荧光碳量子点的荧光量子产率测试数据图。

图9本发明的氮掺杂荧光碳量子点的ph稳定性测试数据图。

图10本发明的氮掺杂荧光碳量子点的细胞毒理实验结果图。

图11本发明的氮掺杂的荧光碳量子点在豆芽中的应用。

图12本发明的氮掺杂的荧光碳量子点在宫颈癌细胞(hela)中的应用。

具体实施方式

实施例1

一种高荧光氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将l-瓜氨酸溶解于去离子水中使其浓度为0.010g/ml，超声震荡5min，再采用水热法在180℃反应8h获取碳点溶液；

(2)将碳点溶液在17000r/min超速离心20min，再用0.22μm滤膜过滤，获得氮含量为15.5％，平均荧光寿命为4.41ns，荧光量子产率为20.3％的碳点溶液。

实施例2

一种高荧光氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将l-瓜氨酸溶解于去离子水中使其浓度为0.020g/ml，超声震荡10min，再采用水热法在200℃反应12h获取碳点溶液；

(2)将碳点溶液在18000r/min超速离心20min，再用0.22μm滤膜过滤，获得氮含量为19.2％，平均荧光寿命为4.46ns，荧光量子产率为32.9％的的碳点溶液。

实施例3

一种高荧光氮掺杂碳量子点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将l-瓜氨酸溶解于去离子水中使其浓度为0.040g/ml，超声震荡20min，再采用水热法在220℃反应24h获取碳点溶液；

(2)将碳点溶液在20000r/min超速离心40min，再用0.22μm滤膜过滤，获得氮含量为18.6％，平均荧光寿命为4.51ns，荧光量子产率为28.3％的的碳点溶液。

试验例1

将实施例2中制备的碳点采用红外和光电子能谱对其表面官能团及结构进行表征；荧光寿命、荧光发射光谱是对其光致发光性能进行表征；原子力显微镜、扫描电镜、透射电镜是对其粒径大小、高度等表面形貌特征进行表征；实验结果如下：

图1红外光谱图，3433cm^-1为–nh伸缩振动峰；1625cm^-1处为c＝o伸缩振动峰；1408cm^-1为c-o的伸缩振动峰；674cm^-1为c-h的面外弯曲震动吸收峰。图2光电子能谱及分峰图，284.78、400.48、530.38ev分别对应图中的c1s、n1s、o1s吸收峰，且碳点中c、n、o的原子含量分别为54.5％、19.2％、26.3％，再对c1s、n1s、o1s吸收峰进行分峰，c1s：284.38、284.48、285.38、287.38ev分别对应的为c-c、c-n、c-o、c＝o键；n1s：398.98、400.28、400.68ev分别对应的为n-h、c-n、c-n-c键；o1s：530.38、531.38ev分别对应的为c＝o、c-oh键。综合红外和光电子能谱及原材料的分子结构，可以确定存在–oh、coo-、-nh2这些官能团。通过仪器测量，碳点的平均荧光寿命为见图3。图4为其荧光发射光谱，考查了320～600nm的激发波长，在激发波长为360nm条件下，碳点的荧光强度达到最大值。图5和图6分别为扫描电镜、透射电镜图和原子力显微镜图，经形貌测量，实施例2氮掺杂碳量子点的平均高度和粒径大约为2nm，近乎微观准球形的碳纳米材料，且碳点的粒径分布符合正态分布(图7)。

试验例2

测量荧光量子产率：选取硫酸奎宁(qy＝54.0％)为标准物，在相同的激发波长下(350nm)，获得吸光度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05的标样和待测样溶液，分别测其荧光强度，分别获得标准物和实施例2样品的标准曲线方程，如图8所示，分别将图中标准物和实施例2样品的标准曲线方程的斜率带入下列方程：

qyx＝qyst(gx/gst)(ηx/ηst)²

qyx和qyst:样品和标准物的荧光量子产率；

gx和gst:样品和标准物标准曲线方程的斜率；

ηx和ηst：样品和标准物溶液所用溶剂的折射率；

经计算，获得了较高荧光量子产率的碳量子点，为32.9％。

试验例3

将实施例1、实施例2和实施例3制备的碳点进行氮掺杂荧光碳量子点的ph稳定性测试：调节ph所用的试剂为naoh和hcl稀溶液，取2.0ml浓度为4mg/ml的碳点溶液，用naoh和hcl调节ph，分别为1、3、5、7、9、11、13，溶液定容至20ml，实验结果如图9所示，在ph为5～9的范围内，碳点溶液展示了良好的荧光稳定性，证明其适用于体外成像。

试验例4

将实施例1、实施例2和实施例3制备的碳点进行mtt比色法毒性测试，步骤如下：(1)将细胞在5％co2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，在每孔加入待测溶液，使待测溶液在每孔的浓度梯度分别为0、20、100、300、500、1000μg/ml^-1；(2)24h过后，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h；(3)终止培养，小心吸去孔内培养液；(4)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。

从图10实验结果可知，随着浓度的增加和培养时间的延长，细胞的存活率虽有所下降，但在浓度1000μgml^-1培养48h的条件下，细胞存活率为80％，证明本发明的氮掺杂的碳量子点基本适合于活体细胞成像的研究。

试验例5

将实施例2中制备的氮掺杂的荧光碳量子点在豆芽中进行应用。将准备好的黄豆浸泡在水中2h，待黄豆吸水至饱满时放入塑料制篮子里培养，每天分早中晚给黄豆浇水至表面湿润，待黄豆芽长至约2cm长时转入浓度为4mg/l的样品溶液中培养约6h(2cm长豆芽浸没溶液中约1cm)。培养结束后取出豆芽，用去离子水清洗三次，将豆芽放在紫外灯下观察其荧光标记情况。如图11所示，在365nm的紫外灯照射下，黄豆芽的胚根上发出了蓝色荧光，取得了较好的荧光标记效果。

试验例6

将实施例2中制备的氮掺杂的荧光碳量子点在宫颈癌细胞(hela)中进行应用。在细胞培养基中加入100μg·ml^-1碳点溶液，将培养基放在培养箱中培养4h。取出，后用磷酸缓冲溶液清洗三次，分别在405nm、488nm的激发波长下进行激光共聚焦成像。如图12所示，细胞的荧光标记效果较好，本实验的碳点在癌细胞中的荧光标记取得了较好的效果，为下一步的实验做好一个良好的铺垫。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。