一种贵金属纳米颗粒‑金属有机框架荧光探针分子及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种贵金属纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子及其制备方法和应用，属于生物分析检测技术领域。

背景技术：

生物巯基分子例如半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽在人类的生理过程中发挥着重要的作用。其中，谷胱甘肽是细胞内含量最丰富(0.5～10mmol/l)的巯基化合物,它是由谷氨酸、甘氨酸以及半胱氨酸组成的三肽,能够维持细胞内的氧化还原平衡，对过氧化氢、汞和铅等重金属有解毒作用。细胞内的半胱氨酸浓度为50～200μmol/l,浓度远低于谷胱甘肽。研究表明，多种疾病都与细胞内谷胱甘肽含量的异常相关，如癌症、心血管疾病和艾滋病等。因此，定量检测细胞内谷胱甘肽对疾病的诊断及治疗具有重要的意义。目前，检测gsh的方法主要有液相色谱法、毛细管电泳、表面增强拉曼光谱、电化学方法、荧光法和比色法等，其中液相色谱、毛细管电泳和表面增强拉曼光谱等方法需使用昂贵的仪器。与其它方法相比，荧光分析法具有操作简便、灵敏度高及能够可视化观察等优点，能将微观上分子识别过程转化为宏观上荧光信号的变化，从而实现对靶标的检测。

金属有机框架是近十年来迅猛发展的一种配位聚合物，其通常具有三维的孔结构，即以金属离子为中心原子，一种或者多种有机配体为支撑构成空间三维的延伸，这使得它成为沸石分子筛、大孔树脂以及碳材料之外的又一类新型的重要多孔材料，在催化、储能和分离中都有广泛应用。金属中心离子在骨架中既可以作为结点提供骨架的中枢，同时还能够拓展网络结构在中枢中形成无限的分支，从而提供金属有机框架独特的物理化学性质(如多孔性和手性等)。这类材料的比表面积远大于相似孔道的沸石材料，而且能够在移除孔道中的残存的溶剂小分子后仍然保持骨架结构的不被破坏。因此，金属有机框架具有许多特殊性能亟需开发。

技术实现要素：

发明目的：针对现有谷胱甘肽检测方法的不足和存在的问题，本发明发现和提出一种具有良好的选择性的荧光探针，对谷胱甘肽进行快速简便的定量检测；并且提供该荧光探针在检测谷胱甘肽中的应用。

技术方案：本发明公开了一种选择性检测谷胱甘肽的贵金属纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子，所述荧光探针分子是以金属有机框架为基体，负载贵金属纳米颗粒所形成，其能够选择性识别谷胱甘肽。

优选，所述金属有机框架为nh2-mil-53或nh2-uio-66。

优选，所述贵金属纳米颗粒为金纳米颗粒、银纳米颗粒或者铂纳米颗粒。

优选，所述贵金属纳米颗粒的尺寸为3至15纳米。

优选，所述荧光探针分子荧光激发波长在343nm或者488nm，发射波长在435或者517nm，且不会根据激发波长的变化而改变。

本发明还提供了所述的荧光探针分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

首先，利用基体化合物和2-氨基对苯二甲酸，高压反应制备金属有机框架，然后将其分散于甲醇中，加入贵金属化合物溶液，最后再加入硼氢化钠水溶液反应后，即得所述荧光探针分子。

所述基体化合物为四氯化锆、四氯化钛或氯化铝；所述贵金属化合物为氯金酸、硝酸银或者氯铂酸。

本发明最后还提供了所述的荧光探针分子在选择性识别谷胱甘肽和/或检测谷胱甘肽浓度中的应用。

本发明通过调节金属有机框架的种类以及负载的贵金属纳米颗粒的尺寸可以精确地调节荧光探针对谷胱甘肽的检测线性范围，从而为细胞内的谷胱甘肽检测奠定良好的基础。进一步我们也发现，该贵金属纳米颗粒-金属有机框架荧光探针具有良好的生物相容性、选择性以及较低的检测限。

本发明贵金属纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子具有以下优势：

第一、本发明择性检测谷胱甘肽的贵金属-金属有机框架荧光探针分子分散性好，荧光稳定，能够良好地选择性识别谷胱甘肽。

第二、本发明选择性检测谷胱甘肽的贵金属-金属有机框架荧光探针分子，通过调节金属中心(如铝、锆)以及配体的种类可以得到不同的激发、发射波长。

第三、本发明选择性检测谷胱甘肽的贵金属-金属有机框架荧光探针分子，对谷胱甘肽具有很好的选择性，半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸对检测干扰很小。

第四、本发明选择性检测谷胱甘肽的贵金属-金属有机框架荧光探针分子，对谷胱甘肽的检测可以达到纳摩尔每升级。

第五、本发明选择性检测谷胱甘肽的贵金属-金属有机框架荧光探针分子，生物相容性好、细胞毒性低，可用于细胞内谷胱甘肽浓度变化的检测。

第六、本发明选择性检测谷胱甘肽的贵金属-金属有机框架荧光探针分子，通过调节金颗粒的种类和金属有机框架的粒径，可以有效地调节其检测的线性范围，为细胞内谷胱甘肽的定量检测奠定基础。

本发明中的金属-金属有机框架荧光探针分子的具体特征如下：

该贵金属-金属有机框架荧光探针分子对谷胱甘肽具有选择性，只有谷胱甘肽可以明显增强贵金属-金属有机框架荧光探针分子的荧光强度；检测的线性范围可以通过改变贵金属纳米颗粒的尺寸和金属有机框架的种类得到精准的调节。通过连接荧光团，该贵金属-金属有机框架探针分子具有不同的激发和发射波长，具有光稳定性。其他氨基酸如半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸对检测干扰很小；荧光探针分子对谷胱甘肽的检测可以达到纳摩尔级。

技术效果：相对于现有技术，本发明荧光探针分子与谷胱甘肽的结合络合能力高，络合后荧光明显增强。细胞毒性实验结果表明该探针对细胞几乎没有毒性，生物相容性和细胞渗透性好，并且方法应用简便易行、快速，直观，毒性低、灵敏度高、方法简单，为谷胱甘肽的检测提供了高效可行的方法。

附图说明：

图1是本发明的金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子x射线衍射，扫描电子显微镜，傅立叶变换红外以及荧光光谱图。

图2是本发明的金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子在连接了异硫氰酸荧光素之后的紫外可见漫反射，傅立叶变换红外以及荧光光谱图。

图3是本发明的金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子的荧光强度和谷胱甘肽浓度的关系。横坐标为谷胱甘肽的浓度，纵坐标为荧光强度。a，b，c中所负载的贵金属纳米颗粒的大小分别为15，6，3nm。从上到下的线条分别对应6％(正方形)，3％(圆形)，2％(上三角)，1％(倒三角)金负载量的探针在使用浓度为50μg/ml，150μg/ml，250μg/ml下的荧光相应。

图4是本发明的金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子与各种氨基酸作用后的荧光强度。光谱结果明显表明，只有谷胱甘肽明显增强贵金属-金属有机框架探针分子的荧光，其他氨基酸如半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸对检测干扰很小。

图5是本发明的金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子对细胞的毒性。横坐标是加入的贵金属-金属有机框架探针分子的浓度，纵坐标是细胞存活率。

图6是本发明的金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子用于细胞内谷胱甘肽检测。图6a是明场下的hela细胞；图6b是在加入荧光探针分子后的细胞内荧光成像图，细胞呈现出很强的荧光。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体试验结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

实施例1

金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子的制备：

将56.25毫克四氯化锆和161.25毫克2-氨基对苯二甲酸溶解于15毫升n，n-二甲基甲酰胺中，再加入1.125毫升冰醋酸，置于25毫升的高压反应釜120度下反应8小时。所得产物用20毫升的n，n-二甲基甲酰胺洗涤3次，然后用20毫升的甲醇浸泡24小时，干燥后得到黄色粉末。将0.4毫克上述粉末超声分散于1.87毫升甲醇中，加入15微升浓度为200毫摩尔每升的氯金酸溶液，6小时后，向悬浮液中加入30微升浓度为100毫摩尔每升的硼氢化钠水溶液。反应半小时后，离心，弃去上清液，并用甲醇洗涤三次。

所得荧光探针分子是以nh2-uio-66为金属有机框架，负载金纳米颗粒所形成。

实施例2

金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子的结构、形貌和荧光特性。将样品的粉末置于x射线粉末衍射仪的样品台上保持表面平滑，对其在5度到60度进行扫描。将样品超声后滴加于平整洁净的硅片表面，在扫描电镜下观察其形貌。将贵金属-金属有机框架粉末与溴化钾粉末混合后充分研磨，在25mpa压力下压成片状以测试其红外光谱。将金纳米颗粒-金属有机框架粉末超声30分钟以分散在超纯水或者磷酸缓冲溶液(ph7.4,7mm)配制成浓度为10mg/ml的母液。取一定量的母液用相应的溶剂如超纯水或者磷酸缓冲溶液稀释到实验所用的浓度50μg/ml。稀释后的悬浮液加到干净的4ml石英比色皿中，设置激发波长为343nm。实验结果如图1所示，从图中可以看到金属有机框架呈现uio-66的衍射峰，颗粒的大小在90nm左右。激发波长在343nm，发射波长在435nm。

实施例3

异硫氰酸酯荧光素连接的金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子的结构以及光学性能。将异硫氰酸酯荧光素连接的金纳米颗粒-金属有机框架粉末与溴化钾粉末混合后充分研磨，在25mpa压力下压成片状以测试其红外光谱。将异硫氰酸酯荧光素连接的贵金属-金属有机框架粉末压入硫酸钡基底以测试其紫外可见漫反射光谱。将异硫氰酸酯荧光素连接的金纳米颗粒-金属有机框架超声30分钟以分散在超纯水或者磷酸缓冲溶液(ph7.4,7mm)配制成浓度为10mg/ml的母液。取一定量的母液用相应的溶剂如超纯水或者磷酸缓冲溶液稀释到实验所用的浓度50μg/ml。稀释后的悬浮液加到干净的4ml石英比色皿中，设置激发波长为343nm和488nm。实验结果如图2所示，从图中可以看出异硫氰酸荧光素成功地连接到金属有机框架上，并且保持488nm的激发波长和517nm的发射波长。

实施例4

金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子对谷胱甘肽的荧光响应。

使用金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子评价对谷胱甘肽的荧光响应。取一定量的上述已经配置好的母液用磷酸缓冲溶液稀释到本实验所用的浓度50，150或者250μg/ml。加到干净的4ml石英比色皿中，用相应的激发波长测量。用微量注射器将200mm的谷胱甘肽溶液滴加到悬浮液中混合均匀，检测不同谷胱甘肽浓度下的荧光光谱。分别对不同金负载量(6％，3％，2％，1％)和不同探针用量下的荧光响应做了测试，实验结果如图3所示，从图中可以看出随着谷胱甘肽浓度的增加，荧光强度也不断增强，不同的探针具有不同的线性范围。

实施例5

使用金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子评价对谷胱甘肽的选择性。

取一定量的上述已经配置好的母液用相应的溶剂如超纯水或者磷酸缓冲溶液稀释到本实验所用的浓度50μg/ml。把浓度50μg/ml的金纳米颗粒-金属有机框架探针分子悬浮液加到干净的4ml石英比色皿中，用343或者488nm激发波长测量。首先，检测金纳米颗粒-金属有机框架探针分子本身的荧光光谱，随后，用微量注射器分别加入浓度10mm的干扰氨基酸如半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，混合均匀，检测各种干扰氨基酸存在的条件下的荧光光谱。相同的方法测量加入谷胱甘肽后的荧光光谱。实验结果如图4所示。所有光谱的发射峰位置在435或者517nm，对于纵坐标的荧光强度，加入干扰氨基酸时的荧光强度与金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针本身的荧光强度相比没有明显增强。加入谷胱甘肽后，荧光强度明显增强。从图中可以看出，本发明的金纳米颗粒-金属有机框架探针分子对谷胱甘肽具有明显的选择性识别能力。

实施例6

细胞毒性实验

胰蛋白酶消化处于对数生长期的l02，hela，u87，hepg2细胞，制成浓度为1×10⁵/ml单细胞悬液，接种于96孔板中，培养24h后，用不同浓度的金纳米颗粒-金属有机框架探针分子(10，20，30，40，50，100，200μg/ml)进行处理；然后继续于37℃、含有5％二氧化碳，95％湿度的培养箱中培养至24h，每个实验点设五个复孔。mtt比色法检测细胞生存率：培养时间终止后每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl继续培养4h；然后吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)150μl，终止反应，将96孔板移入平板震荡器，水平震荡10min，使mtt还原产物完全溶解，然后用酶联免疫检测仪于492nm波长处测定每孔吸光度(od值)，并以空白对照孔的od值调零。结果以每组5复孔的均数±标准误差表示，实验至少重复3次。细胞存活率用下式表示：

细胞生存率(％)＝[od实验值-od空白值]492nm/[od对照值-od空白值]×100％

实验结果如图5所示，结果表明当卟啉浓度达到200μm时，细胞的存活率仍在90％以上，说明该金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子生物相容性好，对细胞的毒性非常低。

实施例7

金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子对细胞内谷胱甘肽的检测。

hela人宫颈癌细胞株置于含有10％胎牛血清的dmem(链霉素100μg/ml青霉素100iu/ml)培养基中，于37℃、含有5％co2，95％湿度的培养箱中培养。成像前，把细胞放到培养皿中培养，待细胞贴壁后加入一定浓度的金纳米颗粒-金属有机框架探针分子，终浓度为50μg/ml。培养0.5h后，用无菌磷酸缓冲溶液轻轻冲洗，进行荧光共聚焦显微镜成像。

实验结果如图6所示，结果表明，经过金纳米颗粒-金属有机框架荧光探针分子标记过的hela细胞，可以看到细胞质内有明显荧光增强(图6b)。说明金纳米颗粒-金属有机框架探针分子可以通过共聚焦荧光强度对细胞中的谷胱甘肽浓度变化进行检测。

由以上具体实例结果表明：该金纳米颗粒-金属有机框架探针分子本身具有良好生物相容性和化学光稳定性，可以对谷胱甘肽进行选择性识别和细胞内谷胱甘肽浓度变化检测。这种利用荧光进行检测的方法简便易行、快速，直观，毒性低、灵敏度高、方法简单，为谷胱甘肽的检测提供了高效可行的方法。

实施例8

利用基体化合物四氯化钛和2-氨基对苯二甲酸，高压反应制备金属有机框架，然后将其分散于甲醇中，加入贵金属化合物氯金酸溶液，最后再加入硼氢化钠水溶液反应后，其他条件与实施例1相同，最后所得荧光探针分子是以uio-66为金属有机框架，负载金纳米颗粒所形成。

经过实施例2-7相同的方法进行检测，结果与金纳米颗粒-金属有机框架探针分子的性能基本相同。

实施例9

利用基体化合物四氯化锆和2-氨基对苯二甲酸，高压反应制备金属有机框架，然后将其分散于甲醇中，加入贵金属化合物硝酸银溶液，最后再加入硼氢化钠水溶液反应后，其他条件与实施例1相同，最后所得荧光探针分子是以nh2-uio-66为金属有机框架，负载银纳米颗粒所形成。

经过实施例2-7相同的方法进行检测，结果与金纳米颗粒-金属有机框架探针分子的性能基本相同。

实施例9

利用基体化合物四氯化锆和2-氨基对苯二甲酸，高压反应制备金属有机框架，然后将其分散于甲醇中，加入贵金属化合物氯铂酸溶液，最后再加入硼氢化钠水溶液反应后，其他条件与实施例1相同，最后所得荧光探针分子是以nh2-uio-66为金属有机框架，负载铂纳米颗粒所形成。

经过实施例2-7相同的方法进行检测，结果与金纳米颗粒-金属有机框架探针分子的性能基本相同。