一种有机‑无机纳米复合双光子荧光材料及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种复合双光子荧光材料，具体地说是一种有机-无机纳米复合双光子荧光材料及其制备方法和用途。

背景技术：

有机-无机纳米复合材料在自然界中广泛存在，如动物骨骼、牙齿、鸡蛋壳、珍珠等就是典型的天然生物复合材料。有机-无机纳米复合材料综合了有机、无机及纳米材料的优良特性，可以形成重要的多功能新材料，具有良好的机械、光、电和磁等功能特性，在许多领域包括在生命活动过程中具有广阔的应用前景。有机-无机纳米复合材料是指分散相尺寸有一维小于100nm量级的复合材料，纳米相与其它相间通过化学(共价键、配位键)与物理(氢键)作用在纳米尺度上复合，不同性能之间匹配、协同及整合，复合过程可以带来性质的增强甚至改变。

随着双光子吸收材料的研究进展，双光子荧光技术在生物样品内的应用也有了重大突破。双光子跃迁具有很强的选择激发性，可实现生物组织中特殊物质显微成像，采用激光光源为近红外或红外光时，对组织内的穿透能力强，组织自身吸收少，干扰小，可以获得较强的样品荧光。生物内源分子的双光子吸收截面大都很小，故而能够实现暗场成像，背景干扰很小。双光子荧光为长波激发、短波发射，长波激发光的穿透能力使其能到达样品内部，而且长波光源能量小对生物体的光损伤也较小，受生物组织散射的影响更小。由于激发只存在于焦点处，焦点以外的区域都不会发生光漂白现象。与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器(共焦针孔)，提高了对荧光的收集率和图像对比度，因而在光电子集成、荧光探针、生物分子探测、医疗诊断和荧光显微成像技术等领域中有巨大应用潜力和广阔应用前景。随着纳米技术的深入研究和广泛应用，具有双光子吸收性能的纳米材料在细胞显影、生物分子探测、离子检测和医疗诊断等领域迅速发展。近年来，有机-无机纳米复合双光子吸收荧光材料的制备、性质研究、生物检测和荧光探针应用等成为新的研究热点(j.geng,k.li,d.ding,x.zhang,w.qin,b.z.tangandb.lin,small,2012,8,3655-3663)。

化学荧光探针在对客体的识别过程中展现出较好的选择性，在生物分子探测、离子检测、环境监测、分子催化和生物荧光成像等领域具有潜在的应用价值。与传统的检测方法(如原子吸收光谱和等离子发射光谱、电化学法、比色法、生物和纳米传感器等)相比，化学荧光探针主要利用测试过程中发生的荧光信号变化(增强、减弱或发射波长位移等)对客体进行检测，具有成本低廉、操作简单、检测限低、灵敏性和选择性高等优点。活细胞成像技术正是利用这些荧光探针，比如小分子有机染料或者量子点来特异性标记待测的分子。

发明人对本申请的相关内容作了如下检索：

1、http://scholar.google.com网检索结果：(2017/9/26)

2、中国知网检索结果：(2017/9/26)

检索方式一：

篇名——双光子荧光三联吡啶衍生物-zns纳米复合铜离子探针无。

篇名——三联吡啶衍生物-zns纳米复合双光子荧光材料无。

篇名——三联吡啶衍生物-zns纳米复合材料无。

检索方式二：

全文——双光子荧光三联吡啶衍生物-zns纳米复合铜离子探针8项，均与目标材料无关。

全文——三联吡啶衍生物-zns纳米复合双光子荧光材料7项，均与目标材料无关。

全文——三联吡啶衍生物-zns纳米复合材料110项，均与目标材料无关。

全文——细胞内铜离子检测13600项，均与目标材料无关。

检索方式三：

关键词——双光子荧光三联吡啶衍生物-zns纳米复合铜离子探针无相关文献。

关键词——三联吡啶衍生物-zns纳米复合双光子荧光材料无相关文献。

关键词——三联吡啶衍生物-zns纳米复合材料无相关文献。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种有机-无机纳米复合双光子荧光材料及其制备方法和用途，通过将有机配体l与纳米zns通过zn(ncs)2界面配位作用复合，优化材料的双光子吸收性能，高效选择性的识别铜离子，并使其具备低细胞毒性和强双光子荧光显影功能，从而适于生物学应用。

本发明以具有双光子吸收性质的三联吡啶衍生物l作为有机组分，zns作为无机组分，通过zn(ncs)2界面配位作用进行复合，简洁高效的制备了具有双光子荧光发射性能的l-zns纳米复合材料，测得其具有较低的细胞毒性和活体细胞双光子荧光显影功能。

本发明复合双光子荧光材料作为一种荧光探针，由具有双光子激射性质的三联吡啶衍生物和无机纳米zns量子点组成，三联吡啶具有较好的刚性平面、稳定性及良好的吸电子能力，当它与共轭体系相连时能有效地扩大电子的离域范围以增强双光子吸收性能。三联吡啶中的n原子作为反应的作用位点，易于与多种金属离子或生物分子形成配位键或氢键。zns是典型的直接宽禁带ⅱ～vi族化合物半导体，室温下其禁带宽度为3.66ev，zns量子点具有双光子吸收性能。采用zns与三联吡啶衍生物在纳米尺度有效复合，可实现双光子吸收性能的优化，提高材料对cu²⁺离子的识别检测灵敏度和选择性，并可通过双光子荧光显微技术实现生物体内的识别检测。

本发明有机-无机纳米复合双光子荧光材料是由有机组分和无机组分通过zn(ncs)2界面配位作用复合得到。

所述有机组分为配体l——4-([2,2':6',2”-三联吡啶]-4'-基)-n,n-二苯胺，其制备方法参见tian课题组发明专利(一种具有活体细胞显影功能的锰配合物双光子吸收材料及其合成方法，专利号：zl201210419345.1)。

所述无机组分为zns。

本发明有机-无机纳米复合双光子荧光材料中有机组分和无机组分的物质的量之比为1:9。

本发明有机-无机纳米复合双光子荧光材料，简记为l-zns纳米复合材料，其结构如下：

本发明有机-无机纳米复合双光子荧光材料的制备方法，包括如下步骤：

称取0.1810g的zn(scn)2溶解在20ml乙醇中，常温搅拌至形成透明溶液，称取0.0476g的配体l溶解在二氯甲烷中并逐滴滴加到所述透明溶液中，常温下搅拌30min，溶液逐渐从黄色透明溶液变成黄色浑浊溶液再变成红色浑浊溶液，随后向反应液中溶解有0.0675g硫代乙酰胺(taa)的乙醇溶液，加热回流反应12h，反应液逐渐由红色浑浊溶液变成橙红色浑浊溶液，冷却，离心，用乙醇和水分别洗涤3次，干燥后得到l-zns纳米复合材料。

本发明有机-无机纳米复合双光子荧光材料的用途，是作为检测活体细胞中cu²⁺的双光子荧光探针的应用。

本发明以具有双光子吸收性质的三联吡啶衍生物l作为有机组分，zns作为无机组分，通过zn(ncs)2界面配位作用进行复合，简洁高效地制备了具有双光子吸收活性的l-zns纳米复合材料，该复合材料具有较强的双光子吸收活性且对铜离子有高效的选择性，基于探针l-zns在体外的识别性能以及它的低毒性和耐光性，发明人对其进行了细胞内双光子荧光显影的研究。

实验发现，hela细胞被l-zns纳米复合材料染色后，可清晰地观察到该复合材料能够进入hela细胞中，当向l-zns培养的hela细胞溶液中加入cu²⁺后，可观察到明显的双光子荧光猝灭现象。这一研究结果的发现，对有机-无机纳米复合双光子荧光探针的设计、制备和生物体内荧光显微成像研究具有重大的意义。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明合成的l-zns纳米复合材料是一类具有细胞显影功能的双光子荧光材料，与其它材料相比，具有较大的双光子吸收截面，激发能量低、长波长发射、穿透性强、光损伤小、低细胞毒性等优点，因此，对细胞无损伤，可用于活体细胞检测，具有明显的应用价值；

2、本发明目标产物高效的选择性识别cu²⁺，对细胞无损伤，可用于活体细胞检测，具有明显的应用价值；

3、本发明目标产物在hela细胞中，可清晰地观察到该复合材料进入到细胞中且能对铜离子有明显的响应过程；

4、本发明制备目标产物，步骤简单，节能减排。

附图说明

图1为本发明有机-无机纳米复合双光子荧光材料的结构示意图。

图2是本发明l-zns纳米复合材料的表征结果，图2(a)为x-射线粉末衍射图(xrd)，图2(b)为复合材料的透射电子显微衍射花样。从图2a中可以看出复合材料在10～20°的2θ范围内出现了配体组分的特征峰，2θ为28.7°、48.3°和56.7°时出现了复合材料中zns组分的特征峰，并且分别对应于zns的(111)、(220)和(311)三个晶面。从图2(b)中可以看出复合材料整体呈纳米片状结构，宽约100nm。

图3为本发明l-zns纳米复合材料识别铜离子前后的双光子荧光光谱，激发波长为820nm。从图3中可以看出，复合材料在580nm左右处具有很强的双光子荧光发射，加入铜离子后双光子荧光明显猝灭。

图4是l-zns纳米复合材料对20种不同离子的荧光识别筛选图，从图中可以看出铜离子对复合材料有明显的猝灭现象而其它离子则没有影响。

图5是其它金属离子对l-zns纳米复合材料识别铜离子的干扰实验结果图。从图中看出复合材料对铜离子有明显的猝灭现象且其它离子的存在对其选择性识别铜离子无干扰。

图6是l-zns纳米复合材料对hela细胞双光子荧光显微成像照片(a)、复合材料对摄入铜离子的hela细胞双光子荧光显微成像照片(b)。从图6可以清楚地看到，目标产物l-zns纳米复合材料已透过hela细胞的细胞膜进入细胞质，对其均匀着色，细胞中摄入铜离子后复合材料的双光子荧光发射明显猝灭。这种复合材料的制备对于双光子荧光细胞显影材料的设计、筛选，对于生命科学、材料科学的发展等方面都有着重要意义。

具体实施方式

1、l-zns纳米复合材料的制备

称取0.1810g的zn(scn)2溶解在20ml乙醇中，常温搅拌至形成透明溶液，将0.0476g的配体l溶解在二氯甲烷中并逐滴滴加到上述透明溶液中，常温下搅拌30min，溶液逐渐从黄色透明溶液变成黄色浑浊溶液再变成红色浑浊溶液，随后向反应液中加入溶解有0.0675g硫代乙酰胺(taa)的乙醇溶液，加热回流反应12h，反应液逐渐由红色浑浊溶液变成橙红色浑浊溶液，冷却，离心，用乙醇和水分别洗涤3次，干燥过夜得到l-zns纳米复合材料。

2、目标产物l-zns对铜离子的识别

选择性行为是荧光探针的最重要特征之一。如图4、5所示，当用420nm激发时，荧光强度是强的。当加入和目标产物l-zns相等量的广泛的环境和生理上重要的金属离子，如：na⁺,mg²⁺,zn²⁺,cr³⁺,al³⁺,fe³⁺,ag⁺,ba²⁺,k⁺,cd²⁺,li⁺,pb²⁺,ca²⁺,co²⁺,ni²⁺,cu²⁺,la⁺,mn²⁺,hg²⁺,bi³⁺时，室温下，加入铜离子的目标产物l-zns在水中的荧光强度明显下降，其他金属离子却没有明显的荧光强度改变。图5干扰试验显示，其它各种金属离子不干扰目标产物l-zns对铜离子识别。

3、目标产物l-zns双光子荧光细胞显影效果的测试

将清洗干净且灭菌的盖玻片放入6孔组织培养板中，hela细胞5×10⁵个/孔的密度接种在直径35mm的6孔板培养皿中，并用dmem作为细胞培养基进行细胞培养，细胞培养基中含有胎牛血清(10％)、青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)。细胞培养皿置于含5％co2和95％o2的培养箱中维持温度37℃进行细胞培养24h，用pbs(磷酸缓冲液，ph＝7.4，gibco试剂公司生产)洗涤hela细胞三次，洗去培养基。然后分别加入4μl目标产物的dmso溶液(1mm)，培养0.5h，用pbs缓冲溶液(ph＝7.4)冲洗盖玻片6～7次，滴1ml4％多聚甲醛/pbs溶液固定细胞10min，蒸馏水冲洗盖玻片6～7次。将盖玻片卡在洁净载玻片上，置于激光共聚焦显微镜(lsm-710，zeiss，德国)下观察细胞形态及荧光摄取情况，结果见图6。

从图6(a)可以清楚地看到，目标产物l-zns均透过hela细胞的细胞膜，进入细胞质中，并对它完全均匀的着色，从图6(b)可以清晰的看出目标产物在加入铜离子后有明显的猝灭现象。这种有机-无机纳米复合双光子荧光探针材料的制备对于细胞显影材料的设计、筛选，对于生命科学、材料科学的发展等方面都有着重要意义。