超亮二聚或多聚染料的制作方法

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超亮二聚或多聚染料的制作方法

领域

本发明通常涉及二聚和多聚荧光或着色染料,和它们的制备方法以及在多种分析方法中的用途。

相关技术的描述

已知荧光和/或着色染料特别适用于其中需要高灵敏度的检测试剂的应用。能够优先标记样品中的特定成分或组分的染料使得研究人员能够测定特定成分或组分的存在、量和/或位置。此外,可以针对不同环境中的它们的空间和时间分布来监控特定体系。

荧光和比色法在化学和生物学方面非常普遍。这些方法对于生物分子的存在、结构、距离、取向、络合和/或位置给出了有用的信息。此外,时间分辨的方法越来越多地用于热力学(dynamics)和动力学(kinetics)的测量。因此,已经开发了用于生物分子例如核酸和蛋白质的荧光或颜色标记的许多策略。由于生物分子的分析通常发生在水性环境中,因此重点是开发和使用水溶性染料。

高度荧光或着色的染料是理想的,因为这种染料的使用增加了信噪比并提供了其它相关的益处。因此,已经尝试增加来自已知荧光和/或着色基团的信号。例如,已经制备了包含两个或更多个荧光和/或着色基团的二聚和多聚化合物,预期这样的化合物将获得更亮的染料。然而,作为分子内荧光猝灭的结果,二聚和聚合染料没有达到期望的亮度增加。

因此,本领域需要具有增加的摩尔亮度的水溶性染料。理想地,这样的染料和生物标志物应该是强烈着色或荧光的,并且应当以各种颜色和荧光波长获得。本发明满足了这一需要并提供了进一步的相关优点。

简要概述

简而言之,本发明通常涉及可用作水溶性,荧光或着色的染料和探针的化合物,其使得能够目视检测分析物分子,例如生物分子,以及用于其的试剂。还描述了使用该染料目视检测分析物分子的方法。

本发明实施方案的水溶性、荧光或着色染料是强烈着色和/或荧光的,并且可以通过目视检查或其它方式容易地观察到。在一些实施方案中,可以在没有预先照射或化学或酶促活化的情况下观察化合物。如本文所述通过适当选择染料,可以获得各种颜色的视觉上可检测的分析物分子。

在一个实施方案中,提供了具有以下结构(I)的化合物:

或其立体异构体、互变异构体或盐,其中R1、R2、R3、R4、R5、L1、L2、L3、L4、M、m和n如本文所定义。结构(I)的化合物在许多应用中找到了应用性,包括用作多种分析方法中的荧光和/或着色染料。

在另一个实施方案中,提供了染色样品的方法,该方法包括以当所述样品在适当的波长下被照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加结构(I)的化合物。

仍在其他实施方案中,本公开提供一种用于目视检测分析物分子的方法,包括:

(a)提供了(I)的化合物;和

(b)通过其可视特性检测化合物。

所公开的其他方法包括一种用于目视检测生物分子的方法,所述方法包括:

(a)将结构(I)的化合物与一种或多种生物分子混合;和

(b)通过其可视特性检测化合物。

其他实施方案涉及组合物,所述组合物包含一种结构(I)的化合物和一种或多种生物分子。还提供了这种组合物在检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。

在一些其它不同的实施方案中,提供了结构(II)的化合物:

或其立体异构体、盐、互变异构体,其中R1、R2、R3、R4、R5、L1a、L2、L3、L4、A、G、m和n如本文所定义。结构(II)的化合物在许多应用中找到了应用性,包括用作制备结构(I)的荧光和/或着色颜料的中间体。

还在其它实施方案中,提供了标记分析物分子的方法,该方法包括:

(a)将结构(II)的化合物和分析物分子混合,其中R2或R3为Q或包含连接至Q的共价键的连接基;

(b)形成该化合物和分析物分子的共轭物;和

(c)使该共轭物与式M-L1b-G′的化合物反应,从而通过G和G′的反应形成至少一个共价键,其中R2、R3、Q、G和M-L1b-G′如本文所定义。

在一些不同的实施方案中,提供了标记分析物分子的另一种方法,该方法包括:

(a)将结构(II)的化合物与式M-L1b-G′的化合物混合,其中R2或R3为Q或包含连接至Q的共价键的连接基,从而通过G和G′的反应形成至少一个共价键,和

(b)使步骤(A)的产物与分析物分子反应,从而形成步骤(A)的产物与分析物分子的共轭物,其中R2、R3、Q、G和M-L1b-G′如本文所定义。

在更多不同的实施方案中,提供了制备结构(I)化合物的方法,所述方法包括使结构(II)的化合物与式M-L1b-G′的化合物混合,从而通过G和G′的反应形成至少一个共价键,其中G和M-L1b-G′如本文所定义。

本发明的这些和其它方面将在参考以下详细的描述而显而易见。

附图简要说明

在附图中,相同的参考数字表示相似的要素。在图中要素的尺寸和相对位置不必要按照比例绘制并且这些要素的一些被可以扩大并且放置以改善附图的可读性。进一步地,所绘制的要素的特定形状不旨在传达关于特定要素的实际形状的任何信息,并且为了便于在图中的识别而被单独选择。

图1提供了3-聚体、5-聚体和10-聚体香豆素染料化合物的荧光光谱。

图2提供了3-聚体、5-聚体和10-聚体荧光素染料化合物的荧光光谱。

发明详述

在以下描述中,阐述某些具体细节旨在提供对本发明多种实施方案的透彻理解。然而,本领域技术人员将理解本发明可以在没有这些细节的情况下实施。

除非上下文另有要求,否则在本说明书和权利要求通篇范围内,词“包含”及其变体,如,“包含了”和“包含着”将解释成是开放、包括性意义,即,解释为“包括但不限于”。

本说明书通篇范围内对“一个实施方案“或“某个实施方案”的谈及意指在本发明的至少一个实施方案中包含与某实施方案联系所描述的具体特点、结构或特征。因此,短语“在一个实施方案中”或“在某个实施方案中”在本说明书通篇范围内多个位置的出现并不必然地全都指相同的实施方案。另外,具体特点、结构或特征可以在一个或多个实施方案中按任何适合的方式组合。

“氨基”指-NH2基团。

“羧基”指CO2H基团。

“氰基”指-CN基团。

“甲酰基”指-C(=O)H基团。

“羟”或“羟基”指-OH基团。

“亚胺基”指=NH基团。

“硝基”指-NO2基团。

“氧代”指=O取代集团。

“硫氢基”指SH基团。

“硫代”指=S基团。

“烷基”指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链基团,不含有不饱和度,具有1个至12个碳原子(C1-C12烷基)、1个至8个碳原子(C1-C8烷基)或1个至6个碳原子(C1-C6烷基),并且通过单键与分子的其余部分连接,例如,甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非在说明书中另有特别说明,烷基是任选取代的。

“亚烷基”或“亚烷基链”指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与基团连接的直链或支链二价烃链,其不含不饱和度并且具有1个至12个碳原子,例如,亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基,还包括亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基、亚丙炔基、正-亚丁炔基等。亚烷基链通过单键与分子的其余部分连接并通过单键与基团连接。亚烷基链与分子其余部分及与基团的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明,否则亚烷基是任选取代的。

“亚烯基”或“亚烯基链”是指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与基团连接的直链或支链二价烃链,其含有至少一个碳-碳双键并且具有2个至12个碳原子,例如亚乙烯基、亚丙烯基和正-亚丁烯基等。亚烯基链通过单键与分子的其余部分连接并通过双键或单键与基团连接。亚烯基链与分子其余部分及与基团的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明,否则亚烯基是任选取代的。

“亚炔基”或“亚炔基链”是指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与基团连接的直链或支链二价烃链,其含有至少一个碳-碳三键并且具有2个至12个碳原子,例如亚乙炔基、亚丙炔基和正-亚丁炔基等。亚炔基链通过单键与分子的其余部分连接并通过三键或单键与基团连接。亚炔基链与分子其余部分及与基团的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中另外声明,否则亚炔基是任选取代的。

“烷基醚基”指如上文定义的任何烷基,其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即,C-O-C)。烷基醚基包含至少一个碳氧键,但是可以包括多于一个碳氧键。例如,在烷基醚基的含义内包括聚乙二醇(PEG)。除非在本说明书中另外声明,否则烷基醚基是任选取代的。例如,在一些实施方案中,烷基醚基用醇基或-OP(=Ra)(Rb)Rc取代,其中Ra、Rb和Rc的每一个如结构(I)的化合物所定义。

“烷氧基”指式-ORa的基团,其中Ra是如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。除非在本说明书中另外声明,否则烷氧基可以是任选取代的。

“杂亚烷基”是指包含在亚烷基链内或在亚烷基链末端的至少一个杂原子(例如N、O、P或S)的如上所述的亚烷基。在一些实施方案中,杂原子在亚烷基链内(即,杂亚烷基包含至少一个碳-杂原子-碳键)。在其它实施方案中,杂原子是所述亚烷基的一个终端并且因此起到将亚烷基与分子的剩余部分连接的作用(例如,M1-H-A-M2,其中M1和M2是分子的部分,H是杂原子和A是亚烷基)。除非在说明书中另有特别说明,杂亚烷基是任选取代的。以下阐明了示例性的杂亚烷基连接基团:

以上C-连接基的多聚体包括在杂亚烷基连接基的多种实施方案中。

“杂亚烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的如上所述的杂亚烃基。除非在说明书中另有特别说明,杂亚烯基是任选取代的。

“杂亚炔基”是指包含至少一个碳-碳三键的如上所述的杂亚烃基。除非在说明书中另有特别说明,杂亚炔基是任选取代的。

关于“杂原子连接基”的“杂原子的”是指由一个或多个杂原子组成的连接基。示例性的杂原子连接基包括选自O、N、P和S的单一原子,和多个杂原子,例如具有式-P(O-)(=O)O-或-OP(O-)(=O)O-的连接基和多聚体和其组合。

“磷酸酯基”是指-OP(=O)(Ra)Rb基团,其中Ra为OH、O-或ORc;和Rb为OH、O-、ORc,硫代磷酸酯基团或其它磷酸酯基团,其中Rc为反离子(例如Na+等)。

“磷烷基”是指-OP(=O)(Ra)Rb基团,其中Ra为OH、O-或ORc;和Rb为-O烷基,其中Rc为反离子(例如Na+等)。除非在说明书中另有特别说明,磷烷基基团是任选取代的。例如,在某些实施方案中,在磷烷基基团中的-O烷基部分任选被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基或硫代磷烷基醚中的一个或多个取代。

“磷烷基醚基”是指OP(=O)(Ra)Rb基团,其中Ra为OH、O-或ORc;和Rb为-O烷基醚,其中Rc为反离子(例如Na+等)。除非在说明书中另有特别说明,磷烷基醚基团是任选取代的。例如,在某些实施方案中,磷烷基醚基团中的-O烷基醚部分任选地被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基或硫代磷烷基醚基中的一个或多个取代。

“硫代磷酸酯基”是指-OP(=Ra)(Rb)Rc基团其中Ra为O或S;Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd;和Rc为OH、SH、O-、S-、ORd、SRd,磷酸酯基团或其它的硫代磷酸酯基团,其中Rd为反离子(例如Na+等)和条件是:i)Ra为S;ii)Rb为S-或SRd;iii)Rc为SH、S-或SRd;或iv)i),ii)和/或iii)的组合。

“硫代磷烷基”是指OP(=Ra)(Rb)Rc基团,其中Ra为O或S;Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd;和Rc为-O烷基,其中Rd为反离子(例如Na+等)和条件是:i)Ra为S,ii)Rb为S-或SRd;或iii)Ra为S和Rb为S-或SRd。除非在说明书中另有特别说明,硫代磷烷基是任选取代的。例如,在某些实施方案中,在硫代磷烷基中的-O烷基任选地被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基或硫代磷烷基醚基中的一个或多个取代。

“硫代磷烷基醚基”是指OP(=Ra)(Rb)Rc基团,其中Ra为O或S;Rb为OH、O-、S-、ORd或SRd;和Rc为-O烷基醚,其中Rd为反离子(例如Na+等)和条件是:i)Ra为S;ii)Rb为S-或SRd;或iii)Ra为S和Rb为S-或SRd。除非在说明书中另有特别说明,硫代磷烷基醚基团是任选取代的。例如,在某些实施方案中,在硫代磷烷基中的-O烷基醚基团任选地被羟基、氨基、硫氢基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基或硫代磷烷基醚基中的一个或多个取代。

“碳环”是指包含3-18个碳原子的稳定的3元至18元芳环或非芳环。除非在说明书中另有特别说明,碳环可以是单环、双环、三环或四环体系,其可以包括稠合或桥环体系,并且可以是部分或完全饱和的。非芳族碳环基包括环烷基,而芳族碳环基包括芳基。除非在说明书中另有特别说明,碳环基是任选取代的。

“环烷基”是指具有3-15个碳原子,优选具有3-10个碳原子的稳定的非芳族单环或多环碳环,其可以包括稠合或桥环体系,并且其是饱和的或未饱和的,并且通过单键连接分子的剩余部分。单环环烷基包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢化萘基,7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非在说明书中另有特别说明,环烷基是任选取代的。

“芳基”是指包含至少一个碳环芳环的环体系。在一些实施方案中,芳基包含6-18个碳原子。芳基可以是单环状、双环状、三环状或四环状环体系,其可以包括稠合或桥环体系。芳基包括但不限于衍生自苯并苊(aceanthrylene)、苊烯、荧蒽(acephenanthrylene)、蒽、薁、苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、非那烯(phenalene)、菲、七曜烯、芘、和三亚苯的芳基。除非在说明书中另外特别说明,芳基是任选取代的。

“杂环”是指包含1至12个碳原子和1至6个选自氮、氧和硫的杂原子的稳定3元至18元芳族或非芳族环。除非在说明书中另外特别说明,杂环基可以是单环状、双环状、三环状或四环状环体系,其可以包括稠合或桥环体系,和杂环中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化,氮原子可以任选地季化;并且杂环可以是部分或完全饱和的。芳族杂环的实例以下列于杂芳基的定义中(即,杂芳基是杂环的下位组)。非芳族杂环的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1.3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、唑烷基、哌啶、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、吡唑并嘧啶基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三烷基、三噻烷基、三嗪基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基、和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非在说明书中另外特别说明,杂环基是任选取代的。

“杂芳基”指包含1至13个碳原子、1至6个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环的5元至14元环体系。出于本发明某些实施方案的目的,杂芳基可以单环状、双环状、三环状或四环状环体系,所述环体系可以包括稠合或桥环体系;并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化;氮原子可以任选地季化。

实例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二唑基、苯并呋喃基、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环己烯基、1,4-苯并二烷基、苯并萘并呋喃基、苯并唑基、苯并二唑基、苯并二氧杂环己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并噻吩)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、

苯并唑啉酮基、苯并咪唑亚硫酰基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基,异吲哚啉基、异喹啉基、吲嗪基、异唑基、萘啶基、二唑基、2-氧代吖庚因基、唑基、环氧乙烷基、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基,1-氧基哒嗪基,1-苯基-1H-吡咯基,吩嗪基,吩噻嗪基、吩嗪基、酞嗪基、蝶啶基、蝶啶酮基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、嘧啶基、嘧啶酮基、哒嗪基、吡咯基、吡啶并[2,3-d]嘧啶酮基、喹唑啉基、喹唑啉酮基、喹喔啉基、喹喔啉酮基、喹啉基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-酮基、噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-酮基、三唑基、四唑基、三嗪基和噻吩基(即噻吩基)。除非在说明书中另有特别说明,杂芳基是任选取代的。

“稠合的”是指包含至少两个环的环体系,其中两个环分享至少一个共同的环原子,例如两个共同的环原子。当稠合环是杂环基环或杂芳基环时,共同的环原子可以是碳或氮。稠合环包括双环、三环、四环等。

本文所用的术语“取代的”意指上述任一基团(例如,烷基、亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基、烷氧基、烷基醚基、磷烷基、磷烷基醚基、硫代磷烷基醚基、碳环、环烷基、芳基、杂环和/或杂芳基),其中至少一个氢原子(例如1、2、3或所有氢原子)由与连接至非氢原子的键替换,例如但不限于:卤原子如F、Cl、Br和I;多种基团如羟基、烷氧基和酯基中的氧原子;多种基团如硫醇基、硫代烷基、砜基团、磺酰基和亚砜基团中的硫原子;多种基团如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳基胺、烷基芳基胺、二芳基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺中的氮原子;多种基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子;和多种其他基团中的其他杂原子。

“取代的”还意指上述任一基团,其中一个或多个氢原子由与杂原子(如氧代、羰基、羧基和酯基中的氧;和多种基团如亚胺、肟、腙和腈中的氮)形成的更高级键替换(例如,双键或三键)。例如,“取代的”包括其中一个或多个氢原子

由-NRgRh、-NRgC(=O)Rh、-NRgC(=O)NRgRh、-NRgC(=O)ORh、-NRgSO2Rh、-OC(=O)NRgRh、-ORg、-SRg、-SORg、-SO2Rg、-OSO2Rg、-SO2ORg、=NSO2Rg和-SO2NRgRh替代的上述任一基团。“取代的”还指上述任一基团,其中一个或多个氢原子被-C(=O)Rg、-C(=O)ORg、-C(=O)NRgRh、-CH2SO2Rg、-CH2SO2NRgRh.替代。在前述基团中,Rg和Rh相同或不同地且独立地为氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”进一步是指上述任一基团,其中一个或多个氢原子被连接至氨基、氰基、羟基、亚胺基、硝基、氧代、硫代、卤素、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基的键替换。此外,前述取代基的每一个也可以任选由一个或多个上述取代基取代。

“共轭”指一个p-轨道与另一个p-轨道横跨居间的σ键重叠。共轭可以出现在环状或非环化合物中。“共轭度”指至少一个p-轨道与另一个p-轨道横跨居间的σ键重叠。例如,1,3-丁二烯具有一个共轭度,而苯和其他芳族化合物一般具有多个共轭度。荧光和着色化合物一般包含至少一个共轭度。

“荧光的”指能够吸收特定频率的光并发射不同频率的光的分子。荧光是本领域普通技术人员熟知的。

“着色”指吸收有色光谱(即,红色、黄色、蓝色等)内光的分子。

“连接基”指至少一个原子(如碳、氧、氮、硫、磷及其组合)的连续链,所述连续链将分子的一部分连接至相同分子的另一个部分或连接至不同分子、部分或固体载体(例如,微粒子)。连接基可以经共价键或其他方式如离子键或氢键相互作用连接分子。

术语“生物分子”指多种生物材料的任一者,所述生物材料包括核酸、碳水化合物、氨基酸、多肽、糖蛋白、激素、适配体及其混合物。更具体地,该术语意在包括而不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰或衍生化的核苷酸、酶、受体、朊病毒、受体配体(包括激素)、抗体、抗原和毒素,以及细菌、病毒、血细胞和组织细胞。如本文进一步描述,通过以下方式制备本发明的目视可检测生物分子(例如,与生物分子连接的结构(I)的化合物):使生物分子与具有反应性基团的化合物接触,所述反应性基团能够借助生物分子上的任何可用原子或官能团如氨基、羟基、羧基或硫氢基,使该生物分子与化合物连接。

“反应性基团”是例如能够通过替代、氧化、还原、加成或环加成反应与第二反应性基团(例如“互补反应性基团”)形成一个或多个共价键的基团。示例性的反应性基团在表1中提供,并且例如包括亲核试剂、亲电子试剂、二烯基、亲二烯基、醛基、肟基、腙基、炔基、胺基、叠氮基、酰基叠氮基、酰卤基、腈基、硝酮基、硫氢基、二硫基、磺酰卤基、异硫氰酸酯基、亚氨酸酯基、活化酯基、酮基、α,β-不饱和羰基、烯烃基、马来酰亚胺基、α-卤代酰亚胺基、环氧基、氮丙啶基、四嗪基、四唑基、膦基、生物素、硫杂环丙烷基等。

术语“可视的”和“目视可检测的”在本文中用来指没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下通过视检可观察的物质。这类目视可检测的物质在范围从约300nm至约900nm的光谱区吸收并发光。优选地,这类物质强烈着色,优选地具有至少约40,000、更优选地至少约50,000、仍然更优选地至少约60,000、仍更优选地至少约70,000和最优选地至少约80,000M-1cm-1的摩尔消光系数。可以通过用肉眼观察,或借助基于光学的检测装置包括而不限于,吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪来检测到本发明的化合物。目视可检测的物质不限于在可见光谱发射和/或吸收光的那些。“目视可检测的”物质的范围内还包括在紫外(UV))区(约10nm至约400nm)、红外(IR)区(约700nm至约1mm)发射和/或吸收光的物质和在其他电磁波谱区发射和/或吸收的物质。

为了本发明的目的,术语“光稳定的可视染料”指如上文所定义那样目视可检测并且当暴露于光时没有显著改变或分解的化学部分。优选地,在暴露于光至少1小时后,光稳定的可视染料不显示明显的漂白作用或分解。更优选地,在暴露于光至少12小时、仍然更优选地至少24小时、然而仍更优选地至少1周和最优选地至少1个月后,可视染料稳定。适用于本发明化合物和方法中的光稳定可视染料的非限制性例子包含偶氮染料、硫靛蓝染料、喹吖啶酮颜料、二嗪、酞菁、芘酮(perinone)、二酮吡咯并吡咯、喹酞酮和truarycarbonium。

如本文所用,术语“苝衍生物”意在包括目视可检测的任何取代的苝。但是,该术语不意在包括苝本身。类似地使用术语“蒽衍生物”、“萘衍生物”和“芘衍生物”。在一些优选的实施方案中,衍生物(例如,苝衍生物、芘衍生物、蒽衍生物或萘衍生物)是苝、蒽、萘或芘的酰亚胺、二酰亚胺或肼酰亚胺(hydrazamimide)衍生物。

本发明的各个实施方案目视可检测生物分子可用于广泛类型的分析应用,例如生物化学应用和生物医学应用,其中需要确定特定分析物(例如生物分子)的存在、位置或量。在另一个方面,因此,本发明提供一种用于目视检测生物分子的方法,包括:(a)向生物体系提供包含与生物分子连接的结构(I)的化合物的目视可检测生物分子;和(b)通过其可视特性检测生物分子。为了本发明的目的,短语“通过其可视特性检测生物分子”意指在没有光照或化学激活或酶促激活的情况下用肉眼或借助基于光学的检测装置观察生物分子,所述检测装置包括而不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪。光密度计可以用来对存在的目视可检测生物分子的量定量。例如,可以通过测量相对光学密度确定两份样品中生物分子的相对量。如果已知染料分子/生物分子的化学计量并已知染料分子的消光系数,则也可以从光学密度的量值确定生物分子的绝对浓度。如本文所用,术语“生物体系”是用来指除目视可检测生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。这类生物体系的非限制性例子包括细胞、细胞提取物、组织样品、电泳凝胶、分析混合物和杂交反应混合物。

“固体载体”是指在本领域已知的用于分子固相负载的任何固体基材,例如“微粒子”是指可用于与本发明化合物连接的众多小粒子的任一个,包括但不限于玻璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些实施方案中,微粒子包含聚苯乙烯珠。

“碱基配对部分”指能够借助氢键(例如,Watson-Crick碱基配对)与互补性杂环部分杂交的杂环部分。碱基配对部分包括天然碱基和非天然碱基。碱基配对部分的非限制性例子是RNA和DNA碱基,如腺苷、鸟苷、胸苷、胞嘧啶和尿苷及其类似物。

本文公开的发明的实施方案还意在涵盖通过一个或多个原子由具有不同原子质量或质量数的原子替换而进行同位素标记的全部的结构(I)或(II)化合物。可以掺入所公开化合物的同位素的例子分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素,如2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I、和125I。

同位素标记的结构(I)、(II)化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和以下实施例中所述的那些相似的方法,使用适宜的同位素标记试剂而非先前所用的非标记试剂来制备。

“稳定化合物”和“稳定结构”意指这样的化合物,所述化合物充分稳健以承受从反应混合物分离至有用纯度和配制成有效治疗剂。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能出现或可能不出现,并且这种描述包括其中所述事件或情况出现的情况及其中它不出现的情况。例如,“任选取代的烷基”意指烷基可以是取代的或可以是未取代的并且该描述包括取代的烷基和没有取代的烷基。

“盐”包括酸加成盐和碱加成盐。

“酸加成盐”指与无机酸和与有机酸形成的那些盐,所述无机酸例如是但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等,所述有机酸例如是但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟-2-萘酸、尼克酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(pamoic)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。

“碱加成盐”指从添加无机碱或有机碱至游离酸所制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐:伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂,如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙基、三丙基、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙基氨基、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星、乙二胺、氨基葡萄糖、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

结晶可以产生本文描述的化合物的溶剂化物。本发明的实施方案包括所描述化合物的全部溶剂化物。如本文所用,术语“溶剂化物”指包含一个或多个分子的本发明化合物与一个或多个分子的溶剂的聚集物。溶剂可以是水,在这种情况下溶剂化物可以是水合物。可选地,溶剂可以是有机溶剂。因此,本发明的化合物可以作为水合物存在,包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真溶剂化物,而在其他情况下,本发明的化合物可以仅保留外来水或另一种溶剂或是水外加一些外来溶剂的混合物。

本发明化合物(例如结构I或II的化合物)或其盐、互变异构体或溶剂化物的实施方案可以含有一个或多个非对称中心并且因此可以产生可以根据绝对立体化学相对于氨基酸而定义为(R)-或(S)-或定义为(D)-或(L)-的对映异构体、非对映异构体及其他立体异构形式。本发明的实施方案意在包括全部这类可能的异构体以及其消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备,或使用常规技术例如色谱和分级结晶拆分。用于制备/分离各种对映异构体的常规技术包括从适合的光学纯前体中手性合成或例如使用手性高压液相色谱(HPLC)拆分消旋物(或盐或衍生物的消旋物)。当本文所述的化合物含有烯属双键或其他几何非对称性中心时并且除非另外说明指定,否则该化合物意在包括E和Z几何异构体。同样,还意在包括全部互变异构形式。

“立体异构体”指由不可互换的借助相同键结合、但具有不同立体结构的相同原子组成的化合物。本发明构思了多种立体异构体及其混合物并且包括“对映异构体”,所述对映异构体是指其分子彼此是不可叠加镜像的两种立体异构体。

“互变异构体”指质子从分子的一个原子移动至同一分子的另一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的多种互变异构形式可由本领域普通技术人员容易地衍生。

使用ACD/命名9.07版软件程序和/或ChemDraw第11.0版软件命名程序(CambridgeSoft),本文所用的化学命名方案和结构简图是I.U.P.A.C.命名体系的修改形式。还使用本领域普通技术人员熟悉的通用名。

如上文所示,在本发明的一个实施方案中,提供了在多种分析方法中可用作荧光和/或着色染料的化合物。在其它实施方案中,提供了用于制备可用作荧光和/或着色染料的化合物的可用作合成中间体的化合物。一般来说,本发明的实施方案涉及荧光和/或着色基团的二聚体和更高级的聚合物。荧光和/或着色基团通过含磷连接基连接。不希望被理论束缚,据信连接基帮助维持荧光和/或着色基团之间足够的空间距离使得分子内淬灭降低或消除,因此产生了具有高摩尔“亮度”的染料化合物(例如高荧光发射)。

因此,在一些实施方案中,化合物具有以下结构(A):

其中L是足以维持在一个或多个(例如,每一个)M基团之间空间距离的含磷连接,使得分子内淬灭减少或消除,并且R1、R2、R3、L1、L2、L3和n如结构(I)所定义。

在其它实施方案中,提供给了具有以下结构(I)的化合物:

或其立体异构体、盐或互变异构体,其中:

M在每次出现时独立地为包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的基团;

L1在每次出现时独立地为包含能够通过两个互补反应性基团的反应形成的官能团的连接基;

L2和L3在每次出现时独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基或杂原子的连接基;

L4在每次出现时独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基的连接基;

R1在每次出现时独立地H、烷基或烷氧基;

R2和R3各自独立地为H、OH、SH、烷基、烷氧基、烷基醚、-OP(=Ra)(Rb)Rc、Q、包含连接到Q的共价键的连接基、包含连接至分析物分子的共价键的连接基、包含连接至固体载体的共价键的连接基或包含连接至另一结构(I)化合物的共价键的连接基,其中Ra为O或S;Rb为OH、SH、O-、S-、ORd或SRd;Rc为OH、SH、O-、S-、ORd、SRd、烷基、烷氧基、烷基醚基、烷氧基烷基醚基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基或硫代磷烷基醚基;和Rd为反离子;

R4在每次出现时独立地为OH、SH、O-、S-、ORd或SRd

R5在每次出现时独立地为氧代、硫代或不存在;

Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团的基团;

m在每次出现时独立地为0或更大的整数;和

n为1或更大的整数。

在一些实施方案中,m的至少一次出现为1或更大的整数。在其它实施方案中,m的至少一次出现为2或更大的整数。仍然在不同的实施方案中,m的至少一次出现为3或更大的整数。仍然在不同的实施方案中,m的至少一次出现为4或更大的整数。仍然在不同的实施方案中,m的至少一次出现为5或更大的整数。

在结构(I)的化合物中多种连接基和取代基(例如,M、Q、R1、R2、R3、Rc、L1、L2、L3和L4)任选被一个或多个取代基取代。例如,在一些实施方案中,选择任选的取代基以优化结构(I)化合物的水溶解性或其它性能。在某些实施方案中,在结构(I)的化合物中各个烷基、烷氧基、烷基醚基、烷氧基烷基醚基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基和硫代磷烷基醚基任选被一个或多个选自羟基、烷氧基、烷基醚、烷氧基烷基醚、硫氢基、氨基、烷基氨基、羧基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基和硫代磷烷基醚基的取代基取代。

连接基L1可以用作M基团与化合物剩余部分的连接点。例如,在一些实施方案中,制备了结构(I)化合物的合成前体,和M基团使用本领域已知的任何数目的容易的方法连接到合成前体上,例如称作“点击化学”的方法。为此目的,可以将任何快速并且基本不可逆的反应用于将M连接到合成前体上以形成结构(I)的化合物。示例性的反应包括叠氮化物和炔的铜催化反应以形成三唑(Huisgen 1,3-偶极环加成)、二烯和亲二烯体的反应(Diels-Alder)、应变促进的炔-氮酮环加成、应变烯烃与叠氮化物、四嗪或四唑的反应、烯烃和叠氮化物[3+2]环加成、烯烃和四嗪的逆需求的Diels-Alder、烯烃和四唑光反应和各种置换反应,例如通过对亲电子原子的亲核攻击置换离去基团。在一些实施方案中,形成L1的反应可以在水性环境中进行。

因此,在一些实施方案中,L1是前述“点击”反应之一的产物的官能团。在不同的实施方案中,对于L1的至少一次出现,该官能团可以通过醛基、肟基、腙基、炔基、胺基、叠氮基、酰基叠氮基、酰卤基、腈基、硝酮基、硫氢基、二硫基、磺酰卤基、异硫氰酸酯基、亚氨酸酯基、活化酯基、酮基、α,β-不饱和羰基、烯烃基、马来酰亚胺基、α-卤代酰亚胺基、环氧基、氮丙啶基、四嗪基、四唑基、膦基、生物素或硫杂环丙烷基官能团与互补反应性基团的反应形成。

在其它实施方案中,对于L1的至少一次出现,官能团可以通过炔基与叠氮基的反应形成。

在更多实施方案中,对于L1的至少一次出现,官能团包含亚烷基、酯基、酰胺基、硫代酯基、二硫基、碳环、杂环或杂芳环基团。在一些更具体的实施方案中,对于L1的至少一次出现,L1为包含三唑基官能团的连接基。

仍然在其它实施方案中,对于L1的至少一次出现,L1-M具有以下结构:

其中L1a和L1b各自独立地为任选的连接基。

在不同的实施方案中,对于L1的至少一次出现,L1-M具有以下结构:

其中L1a和L1b各自独立地为任选的连接基。

因此,在一些实施方案中,该化合物具有以下结构(IA):

其中:

L1a和L1b在每次出现时独立地为任选的连接基;和

x1、x2、x3和x4在每次出现时独立地为0-6的整数

在不同的实施方案中,该化合物具有以下结构(IB):

其中:

L1a和L1b在每次出现时独立地为任选的连接基;和x1、x2、x3和x4在每次出现时独立地为0-6的整数。

在前述多种实施方案中,L1a或L1b或二者不存在。在其它实施方案中,L1a或L1b或二者存在。

在一些实施方案中,L1a和L1b当存在时各自独立地为亚烷基或杂亚烷基。例如,在一些实施方案中,L1a和L1b当存在时独立地具有以下结构之一:

在更多的实施方案中,L2、L3和L4在每次出现时独立地为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。在其它实施方案中,L4在每次出现时独立地为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。例如,在一些实施方案中,该化合物具有以下结构(IC):

其中:

x1、x2、x3和x4在每次出现时独立地为0-6的整数,和

y在每次出现时独立地为1-6的整数。

在结构(IC)的一些实施方案中,L1在每次出现时独立地包含三唑基官能团。在其它(IC)的实施方案中,对于m的每一个整数值而言,y为2。

在结构(IC)的化合物的某些实施方案中,x3和x4在每次出现时均为2。在其它实施方案中,x1、x2、x5和x6在每次出现时均为1。在不同的实施方案中,x2和x4各自为0,和x3为1。

仍然在其它任何结构(I)的前述化合物的实施方案中,R4在每次出现时独立地为OH、O-或ORd。应当理解“ORd”和“SRd”旨在是指与阳离子相联系的O-和S-。例如,磷酸酯基团的二钠盐可以如以下所表示:

其中Ra为钠(Na+)。

在其它任何结构(I)化合物的实施方案中,R5在每次出现时为氧代。

仍然在不同的实施方案中,该化合物具有以下结构(ID)或(IE)之一:

在(ID)和(IE)一些具体的实施方案中,L1在每次出现时独立地包含三唑基官能团。

在任何前述化合物的一些不同的实施方案中,R1为H。

在其它多种实施方案中,R2和R3各自独立地为OH或-OP(=Ra)(Rb)Rc。在一些不同的实施方案中,R2或R3为OH或-OP(=Ra)(Rb)Rc,和R2或R3的另一个为Q或包含连接至Q的共价键的连接基。

仍然在其它实施方案中,Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团的基团。在其它实施方案中,Q在每次出现时独立地为包含能够与互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团的基团。例如,在一些实施方案中,Q′存在于结构(I)的另外的化合物上(例如在R2或R3位置),和Q和Q′包含互补性反应性基团使得结构(I)的化合物和结构(I)的另外的化合物的反应得到结构(I)的化合物的共价连接的二聚体。以类似的方式还可以制备结构(I)的多聚体化合物并且其包括在本发明实施方案的范围内。

不限制Q基团的类型和Q基团与结构(I)的化合物的剩余部分的连接,条件是Q包含对于形成所需键具有适当反应性的基团。

在某些实施方案中,Q是在水性条件下不易水解的基团,但是具有足够的反应性以与分析物分子或固体载体上的相应的基团(例如胺基、叠氮基或炔基)形成键。

结构(I)的化合物的某些实施方案包含通常在生物共轭领域采用的Q基团。例如,在一些实施方案中,Q为包含亲核反应性基团,亲电子反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中,Q为或包含硫氢基、二硫基、活化酯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、炔基、烯基、二烯基、亲二烯基、酰卤基、磺酰卤基、膦基、α-卤代酰亚胺基、生物素、氨基或马来酰亚胺基官能团。在一些实施方案中,活化酯基为N-琥珀酰亚胺酯基、亚氨酸酯基或聚氟苯基酯基。在其它实施方案中,炔是烷基叠氮基或酰基叠氮基。

在下表1中提供了示例性的Q基团。

表1.示例性Q基团

应当注意到,在一些实施方案中,其中Q为SH,SH基团将旨在与另一个结构(I)的化合物上的另一个硫氢基形成二硫键。因此,一些实施方案包括结构(I)的化合物,其是以二硫二聚体的形式,二硫键衍生自SH Q基团。

在一些其它实施方案中,R2或R3之一为OH或-OP(=Ra)(Rb)Rc,和R2或R3的另一个为包含连接到分析物分子上的共价键的连接基或包含连接到固体载体上的共价键的连接基。例如,在一些实施方案中,分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物。在其它实施方案中,分析物分子为酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适体或朊病毒。仍然在不同的实施方案中,固体载体为聚合物珠粒或非聚合物珠粒。

m的值是可以基于所需荧光和/或着色强度选择的另一个变量。在一些实施方案中,m在每次出现时独立地为1-10、3-10或7-9的整数。在其它实施方案中,m在每次出现时独立地为1-5的整数,例如1、2、3、4或5。在其它实施方案中,m在每次出现时独立地为5-10的整数,例如5、6、7、8、9或10。在其它实施方案中,m的每一次出现为1或更大的整数。例如,在一些实施方案中,m的每一次出现为2或更大或3或更大的整数。

也可以通过选择不同的n值来调节荧光强度。在某些实施方案中,n为1-100的整数。在其它实施方案中,n为1-10的整数。在一些实施方案中,n为1。

M基于所需的光学性能选择,例如基于所需的颜色和/或荧光发射波长。在一些实施方案中,M在每次出现时相同;然而,重要的是注意到M每次出现不需要是相同的M,和某些实施方案包括其中M在每次出现时不相同的化合物。例如,在一些实施方案中,每一个M不相同和选择不同的M基团以具有用于荧光共振能量转移(FRET)方法的吸收和/或发射。例如,在这种实施方案中,选择不同的M基团使得通过FRET机理使在一个波长上的辐射吸收引起在不同波长上的辐射发射。基于所需最终用途,本领域技术人员可以合适地选择示例性的M基团。用于FRET方法的示例性M基团包括荧光素和5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明,琥珀酰亚胺酯)染料。

M可以由M上的任何位置(即原子)连接到分子的剩余部分。本领域技术人员将认识到将M连接到分子剩余部分的方式。示例性的方法包括本文所描述的“点击”反应。

在一些实施方案中,M为荧光或着色基团。可以使用例如在本领域已知的并且通常用于比色、UV和/或荧光实验中的任何荧光和/或着色基团的那些。可用于本发明各种实施方案中的M基团的实例包括但不限于咕吨衍生物(例如,荧光素、罗丹明、俄勒冈州绿、伊红或德克萨斯红);花青衍生物(例如,花青、吲哚羰花青、氧羰基花青、硫羰花青或部花青);方酸菁衍生物和环取代的方酸菁,包括Seta、SeTau和Square染料;萘衍生物(例如,丹酰和普罗丹衍生物);香豆素衍生物;二唑衍生物(例如吡啶并唑、硝基苯并二唑或苯并二唑);蒽衍生物(例如,蒽醌,包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙);芘衍生物,如级联蓝;嗪衍生物(例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、嗪170);吖啶衍生物(例如,原黄素、吖啶橙、吖啶黄);芳基次甲基衍生物:槐黄、结晶紫、孔雀石绿;和四吡咯衍生物(例如卟吩、酞菁或胆红素)。其它示例性的M基团包括:花青染料、黄原酸染料(如Hex、Vic、Nedd、Joe或Tet);亚基马黄;雷德蒙德红;四甲基罗丹明;德克萨斯红和染料。

仍然在其它任何前述实施方案中,M包含三个或更多个芳基或杂芳基环,或其组合,例如四个或更多个芳基或杂芳基环,或其组合,或甚至5个或更多个芳基或杂芳基环,或其组合。在一些实施方案中,M包含六个或更多个芳基或杂芳基环,或其组合。在其它实施方案中,该环是稠合的。例如,在一些实施方案中,M包含三个或更多个稠合的环,四个或更多个稠合的环,五个或更多个稠合的环,或甚至六个或更多个稠合的环。

在一些实施方案中,M是环状的。例如,在一些实施方案中,M是碳环。在其它实施方案中,M杂环。仍然在其它前述实施方案中,M在每次出现时独立地包含一个芳基。在这些实施方案的一些中,芳基是多环的。在其它更具体的实施例中,芳基是稠合多环芳基,例如其可以包含至少3、至少4或甚至超过4个芳环。

在任何前述结构(I)的化合物的其它实施方案中。M在每次出现时独立地包含至少一个杂原子。例如在一些实施方案中,杂原子是氮、氧或硫。

仍然在前述任何更多的实施方案中,M在每次出现时独立地包含至少一个取代基。例如,在一些实施方案中,取代基是氟、氯、溴、碘、氨基、烷基氨基、芳基氨基、羟基、硫氢基、烷氧基、芳氧基、苯基、芳基、甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基、羧基、磺酸酯基、酰胺基或甲酰基。

在前述一些甚至更具体的实施方案中,M在每次出现时独立地为二甲基氨基茋、喹吖啶酮、氟苯基-二甲基-BODIPY、双-氟苯基-BODIPY、吖啶、三萘嵌苯、联六苯基、卟啉、苯并芘、(氟苯基-二甲基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基、(双-氟苯基-二氟硼杂-二氮杂-引达省)苯基、联四苯基、双苯并噻唑、三苯并噻唑、双萘基、双蒽酰基、方酸菁、方酸菁鎓、9,10-乙炔基蒽或三-萘基基团。在其它实施方案中,M在每次出现时独立地为对三联苯基、苝、偶氮苯、吩嗪、菲咯啉、吖啶、硫杂蒽烯、红荧烯、晕苯、菁蓝、苝酰亚胺或苝酰胺或其衍生物。仍然在更多的实施方案中,M在每次出现时独立地为香豆素染料、试卤灵染料、二吡咯亚甲基二氟化硼染料、钌联吡啶染料、能量转移染料、噻唑橙染料、甲川或N-芳基-1,8-萘二甲酰亚胺染料。

仍然在任何前述更多的实施方案中,M在每次出现时相同。在其它实施方案中,每一个M不同。仍然在更多的实施方案中,一个或多个M相同和一个或多个M不同。

在一些实施方案中,M为芘、苝、苝单亚酰胺或6-FAM或其衍生物。在其它一些实施方案中,M具有以下结构之一:

在一些具体的实施方案中,结构(I)的化合物为选自表2的化合物:表2.示例性的结构I的化合物

如在表2中所使用的,和贯穿本申请,F、E和Y分别是指荧光素、苝和芘基团,并且具有以下结构:

表2的化合物中的L1如本文对于结构(I)的任何化合物所定义。在一些具体的实施方案中,表1的化合物中的L1是包含三唑基基团的基团,三唑基通过炔基和叠氮基的反应形成。

目前公开的染料化合物是“可调的”,是指通过在任何前述化合物中适当选择变量,本领域技术人员可以得到具有所需和/或预先确定的摩尔荧光(摩尔亮度)的化合物。化合物的可调性允许用户容易地获得用于特定实验或用于识别特定关注的分析物的具有所需荧光和/或颜色的化合物。虽然所有的变量可以对于化合物的摩尔荧光具有影响,据信合适选择M、m和n在化合物的摩尔荧光方面起到重要作用。因此,在一个实施方案中,提供了用于获得具有所需摩尔荧光的化合物的方法,所述方法包括选择具有已知荧光的M基团,制备包含M基团的结构(I)的化合物,和选择适当的m和n的变量以得到所需摩尔荧光。

在某些实施方案中,摩尔荧光可以相对于亲本荧光团(例如单体)的荧光发射倍数增加或降低来表示。在一些实施方案中,本发明化合物的摩尔荧光相对于亲本荧光团为1.1x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x或甚至更高。多种实施方案包括通过合适选择m和n制备相对于亲本荧光团在荧光上具有所需倍数增加的化合物。

为了便于阐明,包含磷基团的多种化合物(例如磷酸酯等)以阴离子状态描述(例如-OPO(OH)O-、-OPO32-)。本领域技术人员将容易地理解电荷取决于pH和不带电形式(例如质子化或盐,例如钠或其他阳离子)也包括在本发明实施方案的范围中。

在多个其他实施方案中提供了包含任何前述化合物和一种或多种分析物分子(例如生物分子)的组合物。在一些实施方案中,还提供了这类组合物在用于检测一种或多种分析物分子的分析方法中的用途。

仍然在其它实施方案中,该化合物可用于多种分析方法。例如,在某些实施方案中,该公开内容提供了染色样品的方法,所述方法包括以当所述样品在适当的波长下照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加结构(I)的化合物,例如其中R2或R3之一是包含连接至分析物分子(例如生物分子)或微粒子的共价键的连接基,和R2或R3的另一个为H、OH、烷基、烷氧基、烷基醚基或-OP(=Ra)(Rb)Rc

在前述方法的一些实施方案中,R2是包含与分析物分子(例如生物分子)共价连接的连接基。例如,核酸、氨基酸或其聚合物(例如,多核苷酸或多肽)。在仍然更多的实施方案中,生物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在前述方法的另外其他实施方案中,R2是包含与固体载体,例如微粒子共价连接的连接基。例如,在一些实施方案中,微粒子是聚合物珠或非聚合物珠。

在甚至更多的实施方案中,所述光学响应是荧光响应。

在其他实施方案中,所述样品包含细胞,并且一些实施方案进一步包含通过流式细胞术观察所述细胞。

在仍然更多的实施方案中,该方法进一步包含区分所述荧光响应与具有可检出不同光学特性的第二荧光团的荧光响应。

在其他实施方案中,本公开提供一种用于目视检测分析物分子例如生物分子的方法,包括:

(a)提供结构(I)的化合物,例如其中R2或R3的一个包含与分析物分子连接的共价键的连接基,和R2或R3的另一个为H、OH、烷基、烷氧基、烷基醚基或-OP(=Ra)(Rb)Rc;和

(b)通过其可视特性检测化合物。

在一些实施方案中,分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如,多核苷酸或多肽)。在仍然更多的实施方案中,分析物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在其他实施方案中,提供一种用于目视检测分析物分子例如生物分子的方法,所述方法包括:

(a)将任一种前述化合物与一种或多种分析物分子混合;和

(b)通过其可视特性检测化合物。

在其它实施方案中,提供了用于目视检测分析物分子的方法,该方法包括:

(a)将权利要求1的化合物与分析物分子混合,其中R2或R3为Q或包含连接至Q的共价键的连接基;

(b)形成该化合物和分析物分子的共轭物;和

(c)通过其可视特性检测该共轭物。

在一些其他不同的实施方案中,结构(I)的化合物可以用于分析细胞的多种方法。例如通过使用流式细胞术,该化合物可以用于区分活的和死亡的细胞,评价细胞的健康(例如坏死vs.早期细胞消亡vs.晚期细胞消亡vs.活的细胞),在细胞循环期间跟踪倍性和有丝分裂,并且确定细胞增殖的多种状态。虽然不希望被理论束缚,据信结构(I)的化合物的实施方案优先与带正电的基团结合。因此,在一些实施方案中,该化合物可以用于测定不完整细胞(例如坏死细胞)存在的方法。例如坏死细胞的存在可以通过将含有细胞的样品与结构(I)的化合物混合并且通过流式细胞术分析测定。结构(I)的化合物与坏死细胞结合,并且由此存在是在流式细胞术条件下可测量的。相反于其它要求胺反应性基团结合到坏死细胞的染色试剂,采用结构(I)的化合物的染色方法的实施方案不需要不含蛋白质的培养缓冲液,并且由此该方法相比相关已知的方法可更有效地进行。

在各种其他实施方案,该化合物可以用于相关的方法用于确定在完整或不完整细胞、凋亡小体、去极化膜和/或渗透膜中带正电荷基团的存在。

除了以上方法以外,结构(I)的化合物的实施方案在多种学科和方法中找到实用性,包括但不限于:在内窥镜检查步骤中成像以识别生癌的组织和其他组织;通过优先使化合物与死亡细胞结合识别坏死组织;单细胞和/或单分子分析方法,例如使用少量放大或不放大检测多核苷酸;癌症成像,例如通过将结构(I)的化合物共轭至优先与癌症细胞结合的抗体或糖或其他基团;在外科手术步骤中成像;结合组蛋白以识别多种疾病;药物递送,例如通过使结构(I)化合物中的M基团与活性药物基团置换;和/或在牙科工作和其它步骤中的对比试剂,例如通过优先将结构(I)的化合物与多种植物群和/或有机体相结合。

可以理解,如上述的结构(I)化合物的任何实施方案和本文对结构(I)化合物中变量R1、R2、R3、R4、R5、L1、L2、L3、L4、M、m和n所述的任何具体选择可以独立地与其他实施方案和/或结构(I)化合物的变量组合以形成上文没有具体描述的本发明实施方案。此外,在一个具体实施方案和/或权利要求中针对任何特定R1、R2、R3、R4、R5、L1、L2、L3、L4、M、m和n变量列出一系列选择的情况下,可以理解,每种独立选择可以从该具体实施方案和/或权利要求删除并且剩余的一系列选择将视为处于本发明的范围内。

可以理解,在本说明书中,允许所述式的取代基和/或变量的组合,只要这类组合产生稳定的化合物。

本领域技术人员还将领会,在本文所述的方法中,中间化合物的官能团可能需要通过合适的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸基。羟基的合适保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如,叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的合适保护基包括叔丁氧羰基、苯甲氧基羰基等。巯基的合适保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基包括烷基、芳基或芳烷基酯基。可以根据本领域技术人员已知和如本文所述的标准技术添加或移除保护基。保护基的用途是在Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),3rd Ed.,Wiley中详述。如本领域技术人员将领会,保护基也可以是聚合物树脂如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。

另外,可以借助本领域技术人员已知方法通过用适宜的无机碱或酸或有机碱或酸处理,将本发明的以游离碱或酸形式存在的全部化合物转化成它们的盐。可以通过标准技术,将本发明化合物的盐转化成它们的游离碱或酸形式。

以下反应方案阐明了制备本发明化合物的示例性方法。可以理解,本领域技术人员可能通过相似的方法或通过组合本领域技术人员已知其他方法,能够制备这些化合物。还应当理解,通过使用适宜的起始组分并根据需要修改合成的参数,本领域技术人员将能够以如下文描述的相似方式制备下文没有具体描述的其他的结构(I)化合物。通常而言,起始组分可以从多种来源如SigmaAldrich、LancasterSynthesis,Inc.、Maybridge、MatrixScientific、TCI和FluorochemUSA等获得或根据本领域技术人员已知的来源(参见,例如,Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版(Wiley,December 2000))合成或如本发明中所述那样制备。

反应方案I

反应方案I阐明了用于制备可用于制备结构(I)化合物的中间体的示例性方法。参考反应方案I,其中R1、L1、L2、L3、G和M如上所定义,和R2和R3如上所定义,或为其保护的变体,结构a的化合物(其可以购买或通过已知方法制备)与M-G’反应生成结构b的化合物。这里,G和G’代表了具有互补反应性的官能团(即,反应形成共价键的官能团)。G’可以是M的侧基或M结构骨架的一部分。G可以是本文描述的任何数目的官能团,例如炔基,和G’可以是许多官能团的任何一个,例如叠氮基。

结构(I)的化合物由结构b通过在熟知的自动化的DNA合成条件下与具有以下结构(c)的亚磷酰胺化合物反应,之后与另一结构b的化合物反应制备:

其中L独立地为任选的连接基。结构(I)的多聚体化合物通过将所需数目的结构b的化合物相继与合适的亚磷酰胺试剂在DNA合成条件下反应制备。

或者,结构(I)的化合物通过以下制备:首先在通常DNA合成条件下合成具有以下结构d的simeric或低聚化合物:

其中G、L1a、L2、L3、R1、R2、R3和n如本文对于结构(II)的化合物所定义,并且随后使结构d的化合物与M-L1b-G′反应,其中M、L1b和G′如本文对于结构(II)的化合物和相关方法所定义。

DNA合成方法是本领域熟知的。简要地,两个醇基团,例如在以上中间体b或d中的R2和R3分别使用二甲氧基三苯甲基(DMT)和2-氰乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺基团官能化。亚磷酰胺基团通常在活化剂例如三唑的存在下偶联至醇基团,随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基基团可以用酸移除(例如氯乙酸)以暴露游离醇,其可以与亚磷酰胺基团反应。2-氰乙基基团可以在低聚之后通过使用氨水处理而移除。

用于低聚方法中的亚磷酰胺的制备也是本领域熟知的。例如,伯醇(例如R3)可以通过与DMT-Cl的反应作为DMT基团保护。仲醇(例如R2)随后通过与合适的试剂例如2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺的反应官能化为亚磷酰胺。制备亚磷酰胺和它们低聚的方法是本领域熟知的并且在实施例中更详细地描述。

结构(I)的化合物根据上述熟知的亚磷酰胺化学通过中间体b的低聚制备。将所需数目的m和n重复单元通过亚磷酸铵偶联所需数目的次数并入到分子中。应当理解,如以下所描述的结构(II)的化合物可以通过类似的方法制备。

在多种其它实施方案中,提供了可用于制备结构(I)的化合物的化合物。该化合物可以以单体、二聚体和/或低聚形式以上制备并且随后M基团经由任何数目的合成方法(例如上述“点击”反应)共价结合到化合物以形成结构(I)的化合物。因此,在多种实施方案中,提供了具有以下结构(II)的化合物:

或其立体异构体、盐或互变异构体,其中:

G在每次出现时独立地为包含能够与互补反应性基团形成共价键的反应性基团的基团。

L1a、L2和L3在每次出现时独立地为任选的亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基或杂原子的连接基;

L4在每次出现时独立地为亚烷基、亚烯基、亚炔基、杂亚烷基、杂亚烯基或杂亚炔基的连接基;

R1在每次出现时独立地为H、烷基或烷氧基;

R2和R3各自独立地为H、OH、SH、烷基、烷氧基、烷基醚、-OP(=Ra)(Rb)Rc、Q、包含连接到Q的共价键的连接基、包含连接至分析物分子的共价键的连接基、包含连接至固体载体的共价键的连接基或包含连接至另一结构(II)化合物的共价键的连接基,其中Ra为O或S;Rb为OH、SH、O-、S-、ORd或SRd;Rc为OH、SH、O-、S-、ORd、SRd,、烷基、烷氧基、烷基醚基、烷氧基烷基醚基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷烷基、硫代磷烷基、磷烷基醚基或硫代磷烷基醚基;和Rd为反离子;

R4在每次出现时独立地为OH、SH、O-、S-、ORd或SRd

R5在每次出现时独立地为氧代、硫代或不存在;

Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子、固体载体或互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团的基团;

m在每次出现时独立地为0或更大的整数;和

n为1或更大的整数。

在一些实施方案中,m的至少一次出现为1或更大的整数。在其它实施方案中,m的至少一次出现为2或更大的整数。仍然在不同的实施方案中,m的至少一次出现为3或更大的整数。

在结构(II)的化合物中的G基团可以选自任何包含对于与M基团上的互补性基团形成共价键具有适当反应性的基团的基团的基团。在示例性的实施方案中,G基团可以选自本文所描述的任何Q基团,包括在表1中提供的那些具体实例。在一些实施方案中,G在每次出现时独立地包含适于包括以下的反应的基团:叠氮化物和炔的铜催化反应以形成三唑(Huisgen 1,3-偶极环加成)、二烯和亲二烯体的反应(Diels-Alder)、应变促进的炔-氮酮环加成、应变烯烃与叠氮化物,四嗪或四唑的反应、烯烃和叠氮化物[3+2]环加成、烯烃和四嗪的逆需求的Diels-Alder、烯烃和四唑光反应和各种置换反应,例如通过对亲电子原子的亲核攻击置换离去基团。

在一些实施方案中,G在每次出现时独立地为包含醛基、肟基、腙基、炔基、胺基、叠氮基、酰基叠氮基、酰卤基、腈基、硝酮基、硫氢基、二硫基、磺酰卤基、异硫氰酸酯基、亚氨酸酯基、活化酯基、酮基、α,β-不饱和羰基、烯烃基、马来酰亚胺基、α-卤代酰亚胺基、环氧基、氮丙啶基、四嗪基、四唑基、膦基、生物素或硫杂环丙烷官能团的基团。

在其它实施方案中,G在每次出现时独立地包含炔基或叠氮基团。在不同的实施方案中,G在每次出现时独立地包含在反应下能够与互补性反应性基团形成包含烯基、酯基、酰胺基、硫代酯基、二硫基、碳环、杂环或杂芳基的官能团的反应性基团。例如在一些实施方案中,杂芳基为三唑基。

在一些实施方案中,该化合物具有以下结构(IIA):

其中:

L1a和L1b在每次出现时独立地为任选的连接基;和

x1、x2、x3和x4在每次出现时独立地为0-6的整数。

在(II)和(IIa)一些具体的实施方案中,各个L1a不存在。在其它实施方案中,各个L1a存在。例如,在一些实施方案中,L1a在每次出现时独立地为杂亚烷基。在其它实施方案中,L1a具有以下结构:

在结构(II)化合物的多种其他实施方案中,L2、L3、L4在每次出现时独立地为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。在一些其他实施方案中,L4在每次出现时独立地为C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基。

在其它实施方案中,该化合物具有以下结构(IIB):

其中:

x1、x2、x3和x4在每次出现时独立地为0-6的整数,和

y为1-6的整数。

在其他任何前述化合物(II)的实施方案中,G在每次出现时独立地为

在结构(IIa)化合物的多个实施方案中,x3和x4在每次出现时均为2。在其它实施方案中,x1、x2、x5和x6在每次出现时均为1。在其它实施方案中,对于m的各个整数值y为2。

在其它实施方案中,R4在每次出现时独立地为OH、O-或ORd,和在不同的实施方案中R5在每次出现时为氧代。

在一些不同的实施方案中,该化合物具有以下结构(IID)或(IIE)之一:

在任何前述化合物(II)的实施方案中,G在每次出现时独立地为

在前述结构(II)化合物的一些其他不同的实施方案中,R1为H。

在结构(II)的化合物的其他多个实施方案中,R2和R3各自独立地为OH或-OP(=Ra)(Rb)Rc。在一些不同的实施方案中,R2或R3为OH或-OP(=Ra)(Rb)Rc,和R2或R3的另一个为Q或包含与Q连接的共价键的连接基。

仍然在其它结构(II)化合物的实施方案中,Q在每次出现时独立地为包含能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团的基团。在其它实施方案中,Q在每次出现时独立地为包含能够与互补反应性基团Q′形成共价键的反应性基团的基团。例如,在一些实施方案中,Q′存在于结构(II)的另外的化合物上(例如在R2或R3位置),和Q和Q′包含互补性反应性基团使得结构(II)的化合物和结构(II)的另外的化合物的反应得到结构(II)的化合物的共价连接的二聚体。以类似的方式还可以制备结构(II)的多聚体化合物并且其包括在本发明实施方案的范围内。

不限制Q基团的类型和Q基团与结构(II)的化合物的剩余部分的连接,条件是Q包含对于形成所需键具有适当反应性的基团。

在结构(II)化合物的某些实施方案中,Q是在水性条件下不易水解的基团,但是具有足够的反应性以与分析物分子或固体载体上的相应的基团(例如胺基、叠氮基或炔基)形成键。

结构(II)的化合物的某些实施方案包含通常在生物共轭领域采用的Q基团。例如,在一些实施方案中,Q为包含亲核反应性基团,亲电子反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中,Q为或包含硫氢基、二硫基、活化酯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、炔基、烯基、二烯基、亲二烯基、酰卤基、磺酰卤基、膦基、α-卤代酰亚胺基、生物素、氨基或马来酰亚胺基。在一些实施方案中,活化酯基为N-琥珀酰亚胺酯基、亚氨酸酯基或聚氟苯基酯基。在其它实施方案中,炔基是烷基叠氮基或酰基叠氮基。

在以上表I中提供了结构(II)化合物的示例性Q基团。

如结构(I)的化合物,在结构(II)化合物的一些实施方案中,其中Q为SH,SH基团将旨在与另一个结构(II)的化合物上的另一个巯基形成二硫键。因此,一些实施方案包括结构(II)的化合物,其是以二硫二聚体的形式,二硫键衍生自SH Q基团。

在结构(II)化合物的一些其它实施方案中,R2或R3之一为OH或-OP(=Ra)(Rb)Rc,和R2或R3的另一个为包含连接到分析物分子上的共价键的连接基或包含连接到固体载体上的共价键的连接基。例如,在一些实施方案中,分析物分子是核酸、氨基酸或其聚合物。在其它实施方案中,分析物分子为酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适体或朊病毒。仍然在不同的实施方案中,固体载体为聚合物珠粒或非聚合物珠粒。

在结构(II)化合物的其它实施方案中,m在每次出现时独立地为1-10、3-10或7-9的整数。在其它实施方案中,m在每次出现时独立地为1-5的整数。在其它实施方案中,m的每一次出现为1或更大的整数。例如,在一些实施方案中,m的每一次出现为2或更大或3或更大的整数。

还在结构(II)化合物的不同的实施方案中,n为1-100的整数。例如,在一些实施方案中,n为1-10的整数。

在其他不同的实施方案中,结构(II)的化合物选自表3。

表3.示例性的结构(II)的化合物

结构(II)的化合物可以用于多种方法,例如在实施方案中,提供了用于标记分析物分子的方法,该方法包括:

(a)将任何所述结构(I)的化合物与分析物分子混合,其中R2或R3为Q或包含连接到Q的共价键的连接基;

(b)形成该化合物和分析物分子的共轭物,和

(c)将该共轭物与式M-L1b-G′的化合物反应,从而通过至少一个G和至少一个G′的反应形成至少一个共价键,

其中:

M为包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的基团;

L1b为任选的亚烷基、杂亚烷基或杂原子的连接基;和

G′为与G互补的反应性基团。

不同的实施方案为标记分析物分子的方法,该方法包括:

(a)将任何本文所公开的结构(II)的化合物与式M-L1b-G′的化合物混合,其中R2或R3为Q或包含与Q连接的共价键的连接基,从而形成通过G和G′的反应形成至少一个共价键,和

(b)使步骤(A)的产物与分析物分子反应,从而形成步骤(A)产物和分析物分子的共轭物,

其中:

M为包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的基团;

L1b为任选的亚烷基、杂亚烷基或杂原子连接基;和

G′为与G互补的反应性基团。

此外,如以上所述,结构(II)的化合物可用于制备结构(I)的化合物。因此,在一个实施方案中,提供了制备结构(I)化合物的方法,该方法包括使结构(II)的化合物与式M-L1b-G′的化合物混合,从而通过G和G′的反应形成至少一个共价键,其中:

M为包含两个或更多个碳-碳双键和至少一个共轭度的基团;

L1b为任选的亚烷基、杂亚烷基或杂原子连接基;和

G′为与G互补的反应性基团。

提供了以下实施例用于解释说明的目的,而不是限制。

实施例

一般方法

在JEOL400MHz谱仪上获得1H谱。1H谱参比TMS。使用具有保持在45℃的2.1mm x 50mm Acquity BEH-C18柱的Waters Acquity UHPLC体系进行反相HPLC分析。使用MassLynx4.1采集软件,在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS(仅以MS模式)体系上进行质谱分析。用于LC/MS的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP),8.6mM三乙胺(TEA),pH8。还使用具有保持在45℃的2.1mm x 50mm Acquity BEH-C18柱的Waters Acquity UHPLC体系,采用乙腈/水流动相梯度分析亚磷酰胺和前体分子。单体中间体的分子量使用鎓阳离子注入增强电离在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS体系(仅以MS模式)获得。排阻色谱(SEC)使用Superdex 200 increase 5/150 GL分析柱完成。等度洗脱使用PBS缓冲液和流动速率为0.25ml/分钟,总的运行时间为17.5分钟。在494、405、280和260nm下检测。手动收集产物的馏分,在相继运行中集中。冷冻干燥,并在100μL的水中重构。吸光度测量在Thermo Scientific Nanodrop 2000分光光度计上进行。荧光测量在Thermo Scientific Nanodrop 3300荧光分光光度计上进行。

除非另有说明,所有反应在氮气气氛下在烘箱干燥的玻璃器皿中进行。市售的DNA合成试剂由Glen Research(Sterling,VA)购买。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基乙基胺、三乙胺、乙酸、吡啶和THF购自Aldrich。所有其他化学制品购自Aldrich或TCI并且用作其本身无额外的纯化。

固相合成

所有结构(I)的化合物使用基于亚磷酰胺偶联的方法的标准草案在ABI 394 DNA合成仪上合成。用于合成寡核苷酸磷酰胺酯的链组装周期如下:(i)脱三苯甲基化,在二氯乙烷中的3%三氯乙酸,1分钟;(ii)偶联,在乙腈中0.1M亚磷酰胺和0.45M四唑,10分钟;(iii)封端,在THF/二甲基吡啶中0.5M的乙酸酐,1/1,v/v 15s;(iv)氧化,在THF/吡啶/水中0.1M的碘,10/10/1,v/v/v,30s。

在周期内中的化学步骤之后是乙腈洗涤和用干燥的氩气冲洗0.2-0.4分钟。由载体的切割和移除基体和磷酰胺酯保护基团通过在室温下氨水处理一小时来实现。随后通过上述反相HPLC分析化合物。

化合物在Applied Biosystems 394DNA/RNA合成仪或在GE10OligoPilot上以1μmol或10μmol的规模合成并且拥有3'-磷酸酯基团。化合物直接在CPG珠或在聚苯乙烯固体载体上合成。化合物通过标准固相DNA方法在3’至5’方向合成。偶联方法采用标准β-氰乙基亚磷酰胺化学条件。所有的亚磷酰胺单体溶解在乙腈/二氯甲烷(0.1M溶液)中,并且使用以下合成循环连续顺序添加:1)使用甲苯中的二氯乙酸移除5’-二甲氧基三苯甲基保护基团;2)在乙腈中使下一个亚磷酰胺与活化剂偶联;3)使用碘/吡啶/水氧化;和4)使用乙酸酐/1-甲基咪唑/乙腈封端。将可扩展的炔(化合物9或Glen Research 10-1992)亚磷酰胺(100mg)溶解在干燥的乙腈(700uL)和二氯甲烷(300uL)中。将一些分子筛加入到烧瓶中,并且将其用氩气覆盖。如上所述利用定序器。重复合成循环直至组装5’Oligofloroside。在链组装的末端,使用二氯甲烷中的二氯乙酸或甲苯中的二氯乙酸移除单甲氧基三苯甲基(MMT)基团或二甲氧基三苯甲基(DMT)基团。在室温下使用浓缩的氢氧化铵水溶液由固体载体切割化合物2-4小时。在真空中浓缩产物并且使用SephadexG-25柱分离主要产物。使用偶联至用于分子量测定的质谱仪的RP-HPLC方法进行分析。

实施例1

荧光素(FAM)叠氮化合物的制备

在具有磁力搅拌棒和加料漏斗的250ml圆底烧瓶中置入FAM-NHS酯2(2.24g)。向烧瓶中加入二氯甲烷(35mL),开始搅拌,烧瓶被置于氮气下并且在冰上冷却。在单独的烧杯中,将2-(2-氨基乙氧基)乙醇(420μL)溶解在二氯甲烷(35mL)、甲烷(7mL)和三乙胺(1.5mL)中并且将得到的溶液加入到加料漏斗中。在30分钟内将胺溶液滴加到NHS酯中。将最终溶液在0C下搅拌1小时,由冰浴中移出烧瓶并且在室温下搅拌2小时。浓缩反应混合物并且粗产物通过硅胶色谱纯化。产物馏分通过TLC和LC/MS检查并且集中得到1.6g(72%)。

在具有磁力搅拌棒的250mL的圆底烧瓶中置入FAM醇3(1.5g)和氯仿(25mL)。向该溶液加入吡啶(470μL)和对甲苯磺酰氯(691mg)。将混合物搅拌24小时,在此点TLC表明反应不完全,加入额外的对甲苯磺酰氯(1.4g)和吡啶(1.5mL)并且将混合物搅拌额外24小时。在48小时之后反应的TLC表明反应完全。将混合物倒入分液漏斗中的饱和碳酸氢钠(200mL)和二氯甲烷(100mL)上并且分离。将有机层保留并且使用二氯甲烷(100mL)萃取水层额外两次。将有机层集中并且用硫酸钠干燥、过滤并且浓缩。使粗产物通过硅胶色谱纯化。产物馏分通过TLC识别并且集中得到所需的甲苯磺酸酯4(1.8g)。

在具有磁力搅拌器的200mL的圆底烧瓶中置入FAM-甲苯磺酸酯4(1.8g)和加入DMF(15mL)并且将混合物搅拌以影响溶解。向此加入叠氮化钠(830mg)并且将混合物加热至50C并且搅拌过夜。将混合物倒入萃取漏斗中100mM柠檬酸(150mL)和乙酸乙酯(150mL)上。分层并且保留有机层。用乙酸乙酯萃取水层额外两次。将有机层合并并且用硫酸钠干燥。将溶液过滤并且通过旋转蒸发浓缩。通过硅胶色谱纯化粗油,通过TLC鉴定产物馏分并且集中。将产物在真空浓缩以得到所需的橙色固体的FAM-叠氮化物5(0.82g)。LCMS与所需产物一致。

实施例2

炔亚磷酰胺的合成

在装配有加料漏斗和磁力搅拌器的500mL的圆底烧瓶中置入二氯甲烷(75mL)中的炔丙基氯甲酸酯(1.3mL)。烧瓶用氮气吹扫。在单独的烧杯中置入二氯甲烷(60ml)、甲醇(10ml)和三乙基胺(1.4mL)中的氨基醇6(2.0g)。向加料漏斗中加入氨基醇溶液并且在30分钟内滴加。搅拌烧瓶2小时,在此处TLC表明反应完全。反应在旋转蒸发器上浓缩并且进一步在高真空下干燥并且直接用于下一个步骤。

在具有磁力搅拌器的500mL的圆底烧瓶中置入氨基甲酸酯7(~3.1g)。向烧瓶(270mL)中加入吡啶并开始搅拌。一旦氨基甲酸酯已经溶解,将溶液置于冰上并且在氮气下搅拌15分钟。将二甲氧基三苯甲基氯(5.9g)通过粉末漏斗一次性地加入到烧瓶中。将烧瓶用氮气再次补充并且在0C下搅拌1小时。将烧瓶由冰中移除并且在室温下搅拌过夜。加入甲烷(10mL)并且搅拌混合物10分钟。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并且通过硅胶色谱纯化。产物馏分通过TLC确定,集中并且浓缩至最终油以得到单-保护的二醇8(3.3g)。

在具有磁力搅拌棒的100mL圆底烧瓶中置入单保护的二醇8(500mg)和二氯甲烷(5mL)。将混合物搅拌至起始物质溶解。同时在单独的注射器中滴加二异丙基乙基胺(600mg)和2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(440mg)。搅拌混合物1小时,在此处TLC表明反应完全。将材料倒入碳酸氢钠溶液,用二氯甲烷萃取。有机层用硫酸钠干燥,过滤并浓缩成油。通过硅胶色谱(具有5%的三乙胺的二氯甲烷)完成额外的纯化。产物馏分通过TLC确认,集中并且浓缩。最终产物分离为澄清油(670mg)。

实施例3

低聚物染料的制备和表征

3-、5-和10-聚体多炔低聚物由实施例2的亚磷酰胺制备。代表性的3-聚体染料如下制备:

在500uL微离心机管中置入磷酸酯缓冲液的溶液(31.5μL,150mM,pH=7.4)。向此加入香豆素叠氮化物(22.5L,在DMSO中10mM)和多炔的溶液(7.5μL,在水中1mM)。在单独的200uL的微离心机管中置入硫酸铜的溶液(3.0μL,50mM),三(3-羟丙基三唑基甲基)胺的溶液(THPTA,3.0μL,100mM)和抗坏血酸钠的溶液(7.5μL,100mM)。将铜溶液混合并且将整个内容物加入到香豆素叠氮化合物/多炔管中。混合反应并且允许在室温下培育过夜。将混合物用水(75μL)稀释并且通过排阻色谱纯化(Superdex 200 increase 5/150 GL,用PBS等量洗脱,0.25mL/min,在405nM和260nM检测)

以类似的方式制备了具有香豆素或荧光素基团的3-、5-和10-聚体染料。

测定了含香豆素和荧光素的化合物的荧光光谱并且分别在图1和2中呈现。数据显示随着炔反应性位点的增加而荧光增加,这表明了叠氮化物偶联至炔以形成结构(I)的化合物。

本说明书提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物,以其全部通过引用并入本文,程度是不与本说明书不一致。

由前文可以理解,虽然本发明的具体实施方案已经在本文描述用于阐明的目的,在不脱离本发明的精神和范围可以作出多种修改。因此,除了所附权利要求之外,本发明不受限制。

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