本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种具有非对称半花菁结构的化合物制备方法和作为半胱氨酸响应型荧光探针的应用。
背景技术：
荧光分子探针技术具有操作方便、对样品无损伤、高选择性、高灵敏性以及能够实现生物样品的原位检测和可视化检测等诸多优点。目前，基于荧光探针技术的分析方法已广泛应用于分析化学、环境检测、生物成像和疾病诊断等重要领域。
生物硫醇，如半胱氨酸（cys），高半胱氨酸（hcy）和谷胱甘肽（gsh），参与多种生物体内的生物化学过程，尤其在保持生物内环境的氧化还原状态方面发挥关键作用。生物体内的cys异常水平将对细胞分化、生长产生影响，进而导致肝损害，皮肤损伤和癌症等疾病。高半胱氨酸（hcy）与血管和肾脏疾病相关，被认为是心血管疾病和阿尔茨海默病疾病的危险因素。还原型谷胱甘肽（gsh）是一种含量丰富细胞内非蛋白硫醇（1-10mm），gsh在控制氧化应激中起关键作用，可以维持细胞生长和功能的氧化还原稳态。异常水平的gsh与各种疾病相关，例如艾滋病，癌症，肝损伤和神经退行性疾病。因此，生物硫醇的检测对研究疾病的生理病理过程以及疾病的早期诊断具有非常重要作用。
花菁结构具有近红外荧光发射的特征，因而基于花菁结构的荧光探针设计研究工作日益活跃。然而，其结构同时也存在一定局限性，比如荧光发射波长区域易受生物内环境因素影响、染料的生物相容性差等。因此，研究和开发新型结构的荧光染料有助于提高荧光检测技术的灵敏性和准确性，对于拓展荧光探针技术在分析化学领域的应用具有重要作用。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有非对称半花菁结构的新型荧光探针及其制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种具有非对称半花菁结构的新型荧光探针，其结构式如下：
所述的非对称半花菁结构的新型荧光探针的制备方法，合成路线如下：
其制备步骤包括：
（1）将4-二甲氨基苯乙酮和费舍尔氏醛溶于甲苯中，然后在反应液中加入氢氧化钠，加热至回流反应12小时，蒸除溶剂，硅胶柱色谱分离得化合物1；
（2）将化合物1溶于二氯甲烷中，加入三乙胺，冰水浴控温0˚c，氮气保护条件下，滴加丙烯酰氯溶于10ml二氯甲烷的溶液，滴毕，在0˚c条件下继续反应0.5小时，然后自然升至室温，搅拌反应12小时，蒸除溶剂，硅胶柱分离纯化得目标化合物2。
所述步骤（1）中4-二甲氨基苯乙酮、费舍尔氏醛的物质的量之比为1:1。
所述步骤（1）中4-二甲氨基苯乙酮和氢氧化钠的物质的量之比为1:1。
所述步骤（2）中化合物1与丙烯酰氯的物质的量之比为1:2，以化合物1的物质的量为基准，0.05mol的化合物1需要三乙胺0.3ml。
本发明基于半花菁和取代苯胺结构，设计了一种具有半花菁-4-二甲胺基苯结构的新型荧光化合物，并利用简捷、高效的化学方法实现了化合物的制备。本发明所设计化合物是一种具有新颖结构的近红外荧光探针。该化合物具有良好的水溶性，以475nm为激发波长，仅有cys使探针在549nm处的荧光发射增强（荧光强度增加约78倍），而在同样条件下，分别加入hcy和gsh时，探针在547nm处几乎没有荧光发射。该化合物可作为一种新型选择性检测cys的荧光探针。
附图说明
图1为化合物1的1hnmr。
图2为化合物2的1hnmr。
图3为化合物2的1cnmr。
图4为化合物1的hr-ms。
图5为化合物2的紫外光谱实验。
图6为化合物2的荧光光谱实验。
图7为化合物2的选择性荧光响应光谱实验（(1)free;(2)cys;(3)hcy;(4)gsh;(5)glu;(6)leu;(7)gly;(8)ile;(9)phe;(10)ala;(11)thr;(12)gln;(13)asn;(14)met;(15)ser;(16)pro;(17)try;(18)lys;(19)arg;(20)his;(21)nahs;(22)s2o32−;(23)s2o52−.λex=475nm，λem=549nm.）。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
仪器与主要化学试剂
brukerav-400型核磁共振仪（德国）；hitachiu-2900双光束uv-可见光分光光度计（日本）；日立f-2500荧光分光光度计（日本）；agilent1100系列lc/msd和absciextripletoftm5600+质谱仪（美国）。
本发明实施过程中所用的原料、溶剂均为商业途径购进。
实施例1
（1）化合物1的合成
4-二甲氨基苯乙酮(1.63g,0.1mol)和费舍尔氏醛(2.01g,0.1mol)加入到10ml甲苯中，然后在反应液中加入氢氧化钠(0.4g,0.1mol)，安装分水装置，加热至回流反应12小时。蒸除溶剂，硅胶柱色谱(石油醚:乙酸乙酯=3:1)分离得化合物1(亮橙色固体2.52g,产率为73%)。1hnmr(300mhz,methanol-d4)δ8.21(t,j=13.3hz,1h),7.93(d,j=9.0hz,2h),7.30-7.17(m,2h),7.02-6.82(m,3h),6.82-6.66(m,2h),5.78(d,j=12.8hz,1h),3.29(s,3h),3.08(s,6h),1.64(s,6h).
（2）化合物2的合成
化合物1(1.73g,0.05mol)溶于20ml二氯甲烷中,加入0.3ml三乙胺,冰水浴控温0˚c，氮气保护条件下，在0.5小时内滴加丙烯酰氯(8.13ml,0.1mol)溶于10ml二氯甲烷的溶液。滴毕，在0˚c条件下继续反应0.5小时，然后自然升至室温，搅拌反应12小时。蒸除溶剂，硅胶柱分离(二氯甲烷:甲醇=20:1,v/v)纯化得化合物2(蓝色晶体，产率为71.4%)。1hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.06-7.80(m,2h),7.72(dd,j=10.1,5.6hz,3h),7.54-7.41(m,3h),6.87-6.62(m,3h),6.51(d,j=10.4hz,1h),6.23(dd,j=10.4,1.1hz,1h),4.23(s,3h),3.11(s,6h),1.64(s,6h).13cnmr(75mhz,chloroform-d)δ179.57,163.21,161.15,153.43,149.18,142.21(d,j=30.6hz),134.79,129.76,128.42,126.79,122.33,119.18,115.38-112.89(m),112.31,45.92,40.29,34.64,27.74.hrms(esi)m/zcalcdforc26h29n2o2+(m+h)+:401.22235,found:401.22263.
应用实验
（一）化合物的紫外和荧光光谱效应实验：
如图5和图6所示，本发明所述化合物具有良好的水溶性，在dmso/pbs缓冲液（1:9，v/v，10mm，ph7.4）中，化合物的最大吸收峰在630nm处，以630nm波长激发时，探针的荧光发射在650nm，显示近红外发射特征。当探针溶液分别加入gsh（谷胱甘肽），cys（半胱氨酸）和hcy（高半胱氨酸）后，仅有cys使探针在630nm处的最大吸收峰下降，并在475nm处出现一个新的吸收峰；而在分别加入hcy和gsh时，探针在630nm处的吸收峰几乎不变。以475nm为激发波长，仅有cys使探针在549nm处的荧光发射增强（荧光强度增加约78倍），而在同样条件下，分别加入hcy和gsh时，探针在547nm处几乎没有荧光发射。
（二）化合物对cys的选择性响应实验：
在25℃环境温度条件下，化合物2在dmso/pbs缓冲液（1:9，v/v，10mm，ph7.4）中孵育120分钟后加入20倍当量的各种氨基酸和生物活性硫物质后，化合物2的荧光强度变化（图2）。实验结果表明，针对不同的生氨基酸（半胱氨酸(hcy),谷胱甘肽（gsh），谷氨酸（glu），亮氨酸（leu），甘氨酸（gly），异亮氨酸（ile），苯丙氨酸（phe），丙氨酸（ala），苏氨酸（thr），谷氨酰胺（gln），天冬酰胺（asn），蛋氨酸（met），丝氨酸（ser），脯氨酸（pro），色氨酸（trp），赖氨酸（lys），精氨酸（arg），组氨酸（his）以及活性硫（nahs，s2o32-，s2o52-），化合物2对cys显示出显著的选择性响应特征，表明化合物2可作为一种新型选择性检测cys的荧光探针。实验结果见图7。
本发明所述化合物拼合了半花菁和4-二甲氨苯结构片段，是一种具有新颖结构的近红外荧光探针。本发明所述化合物具有良好的水溶性，在dmso/pbs缓冲液（1:9，v/v，10mm，ph7.4）中，化合物的最大吸收峰在630nm处，以630nm波长激发时，探针的荧光发射在650nm，显示近红外发射特征。当探针溶液分别加入gsh（谷胱甘肽），cys（半胱氨酸）和hcy（高半胱氨酸）后，仅有cys使探针在630nm处的最大吸收峰下降，并在475nm处出现一个新的吸收峰；而在分别加入hcy和gsh时，探针在630nm处的吸收峰几乎不变。以475nm为激发波长，仅有cys使探针在547nm处的荧光发射增强（荧光强度增加约78倍），而在同样条件下，分别加入hcy和gsh时，探针在549nm处几乎没有荧光发射。通过实验考察了化合物2对cys的选择性检测：针对不同的生氨基酸，物硫醇以及活性硫，化合物2对cys显示出显著的选择性响应特征。该化合物可作为一种新型选择性检测cys的荧光探针。此外，本发明所述化合物的制备方法具有操作简便、条件温和、反应收率高等特点。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。