烈香杜鹃提取物及其提取方法和用途与流程

本发明属于植物提取物领域，具体涉及烈香杜鹃中化合物的提取。

背景技术：

烈香杜鹃(rhododendronanthopogonoidesmaxim.))为杜鹃花科杜鹃属常绿灌木，主产甘肃、青海及四川西北部。生于海拔2900-3700米高山山坡、山地林下、灌丛中，常为灌丛优势种(http://frps.iplant.cn/frps)，俗称小叶枇杷、野枇杷。《藏药志》中记载，其以花、叶、嫩枝作为药用部位，性苦、涩、寒，具有清热消炎，止咳平喘，健胃，强身，抗老等功效。现代药理学研究发现，其挥发油部分中的牻牛儿酮、α-柠檬烯、苄基丙酮和桧脑有镇咳作用，γ-芹子烯、桧脑、杜鹃次烯、杜鹃烯和柠檬烯有祛痰作用，柠檬烯、苄基丙酮、牻牛儿酮、杜鹃次烯、γ-芹子烯、桧脑等均有一定的抑菌作用，总挥发油具有显著扩血管作用。

目前，对烈香杜鹃总挥发油的研究主要集中在其叶或花部位，几乎未见有对烈香杜鹃枝部位总挥发油的研究报道。现有对烈香杜鹃中化合物的提取多用水蒸气蒸馏法。此法虽较为简易，但得率不高，并且提取温度较高，易造成提取物成分的破坏。钱伟光等人用正交试验法研究了利用超临界co2萃取法提取杜鹃叶部位总挥发油的最佳工艺，但未对其提取物化学成分和化合物对应的效果进行分析。

另一方面，不同地域和气候条件下，烈香杜鹃中所含的具有有益效果的功效成分不尽相同，并且不同部分的烈香杜鹃中有益组分含量也不尽相同。因此，在对烈香杜鹃的综合利用中，烈香杜鹃中化合物的提取和成分的分析鉴定尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供烈香杜鹃枝和叶的提取物和提取方法，以方便烈香杜鹃的综合开发利用。

本发明首次将烈香杜鹃的叶枝分离进行研究，用超临界co2萃取法分别提取得到杜鹃叶部位及枝部位提取物，即枝油和叶油并利用gc-ms法首次分析鉴定了所得杜鹃叶和枝部位挥发油的化合物组成，并对其抗氧化活性进行了测定分析。

本发明提供一种烈香杜鹃提取物，包括的首次鉴定得到组分和组分含量如下：亚油酸5-37％，亚麻酸6-24％，δ-蛇床烯1-16％。

由于脂肪酸的检测gc-ms需要预先进行甲酯化，本发明权利要求书和说明书中，所述提取物中脂肪酸(包括饱和和不饱和脂肪酸)的百分含量均以该脂肪酸对应的脂肪酸甲酯的质量百分比计。

亚油酸是功能性多不饱和脂肪酸，是人体必需脂肪酸，是人和哺乳动物生长所必需的，而体内不能合成,必须从食物中摄取。其具有降低血清胆固醇水平作用，摄入大量亚油酸对高甘油三酯疾病人有明显的疗效。我国药典仍采用亚油酸乙酯丸剂、滴剂作为预防和治疗高血压及动脉粥样硬化症、冠心病的药物。亚油酸有助于降低血清胆固醇和抑制动脉血栓的形成，因此在预防动脉粥样硬化和心肌梗塞等心血管疾病方面有良好作用。此外，亚油酸还是ω-6长链多不饱和脂肪酸尤其是γ-亚麻酸和花生四烯酸的前体。亚麻酸也不能人体制造，必须从食物中摄取，亚麻酸具有一系列的保健功效：降血脂、降胆固醇作用；降压作用；抗癌作用；改善心脑血管疾病；提高脑神经功能等。因此本发明提供的上述烈香杜鹃提取物为亚麻酸和亚油酸提供了丰富、廉价经济的来源，可作为补充亚麻酸和亚油酸的保健品添加成分；或单独通过进一步加工成保健品；或在医药开发中作为功效成分亚油酸、亚麻酸的提取原料，在药物制剂中用作辅料；或用作化工原料、添加剂等，如可作为ω-6长链多不饱和脂肪酸，尤其是γ-亚麻酸和花生四烯酸的合成中间体。

进一步地，所述提取物为由烈香杜鹃枝提取得到的枝油或由烈香杜鹃叶提取得到的叶油；

所述枝油中以质量百分比计含有5.5-6％的亚油酸，6-6.5％的亚麻酸，15-15.5％的δ-蛇床烯，还含有6-7％的4-苯基-2-丁酮；进一步地，所述枝油中还包括以质量百分比计0.1-0.6％的β-马榄烯，0.1-1％的杜松烯、0.5-2％的3,9-杜松二烯、0.5-1.5％的4(14),7(11)-桉叶二烯、1-2％的二十烷、1-2％的二十四烷、1-2％的2-十七酮、1-2％的二十六烷、1.5-2.5％的2-十九酮，以及3.8-5％的二十九烷和1.5-2.5％的土青木香酮；

所述叶油中以质量百分比计含有35-37％的亚油酸甲酯含量为，22-24％的亚麻酸甲酯，1-2％的δ-蛇床烯，0.1-1.0％的4-苯基-2-丁酮；进一步地，叶油中还包括以质量百分比计0.05-0.4％的十二酸甲酯、0.1-0.5％的1(10)6.8-杜松三烯、0.1-0.5％的十七酸甲酯和0.0-0.6％的油酸甲酯。

更进一步地，所述杜鹃枝油中还含有以质量百分比计：1.5-2.5％的α-马榄烯，6-9％的γ-桉叶醇，1-2％的肉豆蔻酸甲酯，2.5-3.5％的棕榈酸甲酯，2-3％的硬脂酸甲酯，2-3％的11顺-十八碳一烯酸甲酯，12.5-14.5％的二十七烷，2.6-3.8％的二十二酸甲酯，6-7％的二十四烷酸甲酯；

所述叶油中还含有以质量百分比计：0.1-1％的肉豆蔻酸甲酯，7.5-9.5％的棕榈酸甲酯，1.5-2.5％的硬脂酸甲酯，8.5-10.5％的11顺-十八碳一烯酸甲酯，2.5-3.5％的二十二酸甲酯，7-8％的二十四烷酸甲酯。

本发明提供一种食用油，其中含有杜鹃叶油，所述杜鹃叶油中包括以下质量含量的组分：亚油酸甲酯35-37％，亚麻酸甲酯22-24％，δ-蛇床烯1-2％，十二酸甲酯0.1-0.4％，1(10)6.8-杜松三烯0.1-0.4％，十七酸甲酯0.1-0.4％，油酸甲酯0.1-0.4％，

进一步地，所述食用油还包括γ-桉叶醇0.1-0.8％，棕榈酸甲酯8-9％，11顺-十八碳一烯酸甲酯9-10％。

本发明提供的烈香杜鹃提取物中，含有大量的亚油酸(36.61％)及亚麻酸(23.84％)。亚油酸(la)是功能性多不饱和脂肪酸(pufa)中被最早认识的一种，是必需脂肪酸(efa)，是人和哺乳动物生长所必需的，而体内不能合成,必须从食物中摄取。其具有降低血清胆固醇水平作用，摄入大量亚油酸对高甘油三酯疾病人有明显的疗效。我国药典仍采用亚油酸乙酯丸剂、滴剂作为预防和治疗高血压及动脉粥样硬化症、冠心病的药物。亚油酸有助于降低血清胆固醇和抑制动脉血栓的形成，因此在预防动脉粥样硬化和心肌梗塞等心血管疾病方面有良好作用。此外，亚油酸还是ω-6长链多不饱和脂肪酸尤其是γ-亚麻酸和花生四烯酸的前体。亚麻酸也不能人体制造，必须从食物中摄取，亚麻酸具有一系列的保健功效：降血脂、降胆固醇作用；降压作用；抗癌作用；改善心脑血管疾病；提高脑神经功能等。基于此，杜鹃叶油可考虑开发为食用油品，或作为添加组分添加到现有食用油中

本发明提供上述烈香杜鹃提取物在制备抗氧化相关产品中的用途。

根据实验验证，本发明提供的烈香杜鹃提取物具有强抗氧化性，可添加于需要具备抗氧化功效的产品中，发挥抗氧化功效。所述抗氧化相关产品可以是护肤品，保健品等。

根据文献报道，4-苯基-2-丁酮为杜鹃油中发挥药效活性作用的主要化学成分，具有镇咳、平喘作用；对呼吸、血压的影响；延长睡眠的作用；减慢心率和降低心收缩力的作用；对豚鼠离体气管平滑肌有明显松弛作用，且能对抗组胺所致的收缩效应。通过本发明实验研究发现，4-苯基-2-丁酮在叶中的含量仅为0.78％，枝中的含量高达6.63％，说明杜鹃枝油具有较高的4-苯基-2-丁酮开发利用价值。同时，传统利用水蒸气蒸馏法对嫩枝中挥发油进行提取，测定所得4-苯基-2-丁酮的含量仅为1.584％，而本发明在超临界二氧化碳萃取法条件下得到的枝油中4-苯基-2-丁酮含量高达6.63％。此外，本发明通过实验研究发现δ-蛇床烯在烈香杜鹃枝提取物中含量高达15.15％，在叶提取物中含量仅为1.61％，在需要提取δ-蛇床烯时候可优先从枝中进行提取。

因此，本发明提供一种从烈香杜鹃中提取4-苯基-2-丁酮和/或δ-蛇床烯的方法，以烈香杜鹃枝为提取原料，采用超临界二氧化碳萃取法，在萃取温度48-52℃，分离温度35-39℃，萃取压力26-30mpa下提取。

进一步地，优选为在在萃取温度50℃，分离温度37℃，萃取压力28mpa下提取。

本发明通过实验研究发现，亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯在烈香杜鹃枝叶部和叶部中的含量差异较大，在叶中的含量分别高达36.61％和23.84％。因此，本发明提供一种从烈香杜鹃中提取亚油酸甲酯和/或亚麻酸甲酯的方法，以烈香杜鹃叶为提取原料，采用超临界二氧化碳萃取法，在萃取温度50℃，分离温度37℃，萃取压力28mpa下提取。

本发明提供一种鉴别烈香杜鹃枝油和叶油的方法，对烈香杜鹃提取物进行是否同时含有以下标志化合物的检测：亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、δ-蛇床烯、4-苯基-2-丁酮、杜松烯、3,9-杜松二烯、4(14),7(11)-桉叶二烯、、2-十七酮、2-十九酮、二十九烷和土青木香酮，若同时含有，判断为杜鹃枝油；或对烈香杜鹃提取物进行是否同时含有以下标志化合物的检测：亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、δ-蛇床烯、4-苯基-2-丁酮、杜松烯、3,9-杜松二烯、4(14),7(11)-桉叶二烯、2-十七酮、2-十九酮和土青木香酮，若同时含有，判断为杜鹃枝油

或对烈香杜鹃提取物进行是否同时含有以下标志化合物的检测：亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、δ-蛇床烯、4-苯基-2-丁酮、十二酸甲酯、1(10)6.8-杜松三烯、十七酸甲酯和油酸甲酯，若同时含有，判断为杜鹃叶油。

4-苯基-2-丁酮作为杜鹃油中发挥药效活性作用的主要化学成分，具有镇咳、平喘作用，对呼吸、血压的影响。在对杜鹃枝油和叶油进行鉴别时候，可以此化合物的有无，作为判断所鉴别的产品是否为具有相应药用价值的杜鹃挥发油的标准。本发明提供的上述检测和鉴定方法，优先采用气相色谱-质谱联用的方法对所述化合物进行检测，包括以下条件：

气相色谱条件：进样口温度240℃，柱温采用程序升温：初始温度40℃保持5min，以4℃/min速率升至250℃保持15min；；检测器：msd，检测器温度230℃；载气n2流速1.0ml/min；分流进样分流比10:1。

质谱条件：接口温度280℃，离子源温度230℃电子轰击离子源(ei)70ev，质量扫描范围30～600m/z。

进一步地，还包括以下检测条件：

色谱条件：色谱柱db-5ms柱(30m×0.25mm×0.25um)；进样器：pss；载气：高纯氦气；柱流量1.0ml/min；进样量：1ul；

质谱条件：仪器：thermotrace1300/8000evogc/ms/ms气相串联质谱仪。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种新的烈香杜鹃提取物，其中亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯含量分别高达36.61％和23.84％，提供一种新的具有高抗氧化性能的产品，可作为抗氧化组分添加到需要具备抗氧化功效的产品中。

2.本发明对烈香杜鹃枝部和叶部位的化学成分分别进行了检测，发现了枝和叶中的不同组分以及相同组分的不同含量，为更加科学和高效的利用烈香杜鹃的枝部和叶部位提供了方向，同时也为烈香杜鹃提取物提取部位的鉴定提供了有效方法。

3.本发明采用超临界二氧化碳萃取法进行提取，提取温度低，不易造成提取物成分的破坏，提取效率高。超临界二氧化碳萃取法提取结果表明，杜鹃叶油出油率(4.67％)>杜鹃枝油出油率(2.81％)，并且采用本发明方法提取的出油率明显高于现有水蒸气蒸馏法(1.5％)，特别适用于杜鹃枝及叶总挥发油的提取。

附图说明

图1为杜鹃叶油总离子流色谱图；

图2为杜鹃枝油总离子流色谱图；

图3为4-苯基-2-丁酮的离子碎片图；

图4为亚油酸甲酯的离子碎片图；

图5为亚油酸甲酯的离子碎片图；

图6为油酸甲酯离子碎片图；

图7为棕榈酸甲酯的离子碎片图；

图8为δ-蛇床烯的离子碎片图；

图9为γ-桉叶醇的离子碎片图；

图10为dpph清除实验中30min时杜鹃叶油清除率；

图11为dpph清除实验中抗氧化活性测试中60min时杜鹃叶油清除率；

图12为抗氧化活性测试中30min时杜鹃枝油清除率；

图13为抗氧化活性测试中60min时杜鹃枝油清除率；

图14abts法杜鹃叶油抗氧化能力；

图15abts法杜鹃枝油抗氧化能力；

图16frap法杜鹃叶油抗氧化能力；

图17frap法杜鹃枝油抗氧化能力。

具体实施方式

下面通过具体实施例和实验研究对本发明做进一步说明。

实施例1烈香杜鹃枝油及叶油的提取和成分分析

1.仪器和试剂

仪器：ha221-40-12型超临界流体萃取仪；1l装置。分析仪器为thermotrace1300/8000evogc/ms/ms气相串联质谱仪，检测器型号为msd；色谱柱为agilentdb-5msui(30m×0.25mm×0.25um)；epoch2微孔板分光光度计，美国伯腾仪器有限公司(biotek)。

试剂：co2气体为食品级(纯度≥99％，北京医用气体公司)、试剂盒frap、abts(南京建成生物工程研究所)、dpph。

样品来源：烈香杜鹃地上枝叶(嫩叶萌发期的枝叶)采自青海省循化大力加山，经中国科学院西北高原生物研究所卢学峰研究员鉴定为烈香杜鹃rhododendronanthopogonoidesmaxim，地上部分经人工剪选分为杜鹃枝与杜鹃叶，去除杂质后阴干至干燥，粉碎备用。

2.杜鹃枝油及杜鹃叶油的提取

将杜鹃枝叶分别用超临界co2萃取法进行提取。

萃取条件：萃取温度50℃，分离温度37℃，萃取压力28mpa。

提取率：杜鹃叶出油率为4.67％，杜鹃枝出油率为2.81％。

3.挥发油化学成分测定

气相色谱条件：进样器：pss，分流进样，分流比10∶1；进样器温度：240℃；载气：高纯氦气；柱流量1.0ml/min；程序升温：初温40℃(保持5min)，4℃/min升至250℃(保持15min)；进样量：1ul.

质谱条件：接口温度280℃，离子源温度：230℃电子轰击离子源(ei)70ev，质量扫描范围30～600m/z。

测定前按照国标gb5009.168-2016进行甲酯化：

并按照食品安全国家标准《食品中脂肪酸的测定》操作。

优选地，脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化方法如下：

在脂肪提取物中加入质量浓度2％氢氧化钠甲醇溶液8ml，连接回流冷凝器，80℃±1℃水浴上回流，直至油滴消失。从回流冷凝器上端加入7ml质量浓度15％三氯化硼甲醇溶液(甲酯化试剂)，在80℃±1℃水浴中继续回流2min。用少量水冲洗回流冷凝器。停止加热，从水浴上取下烧瓶，迅速冷却至室温。

然后准确加入10ml-30ml正庚烷，振摇2min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层正庚烷提取溶液5ml，至25ml试管中，加入3g-5g无水硫酸钠，振摇1min，静置5min，吸取上层溶液到进样瓶中待测定。

从杜鹃叶油及杜鹃枝油中共鉴定出33种化合物(见表3)，其总离子流图如图1、图2所示。其中叶油中鉴定化合物22种，含量最高者为亚油酸甲酯(36.61％)，其次为亚麻酸甲酯(23.84％)，其余化合物含量较高者(>5％)按其含量高低顺序排列依次为：11顺-十八碳一烯酸甲酯(9.57％)>棕榈酸甲酯(8.56％)>二十四烷酸甲酯(7.60％)。枝油中鉴定化合物29种，含量最高者为δ-蛇床烯(15.15)，其次为二十七烷(13.84％)，其余化合物含量较高(>5％)者按其含量高低顺序排列依次为：γ-桉叶醇(7.38％)>4-苯基-2-丁酮(6.63％)>二十四烷酸甲酯(6.60％)>亚麻酸甲酯(6.22％)>亚油酸甲酯(5.81％)。

表3gc—ms含量测定结果

注：“—”代表未检出

由于脂肪酸进行gc-ms定量测定需先进行甲酯化处理，此表格中甲酯类化合物的含量均为对应的脂肪酸的含量。

实施例2抗氧化活性测定

1.dpph清除实验

称取dpph0.0197g，用无水乙醇定容至250ml，配制成浓度为0.2mmol/ml的溶液，4℃保存。

分别称取杜鹃叶油及杜鹃枝油各2.8045g，用无水乙醇作溶剂，分别配制成浓度为(mg/ml)0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、10、12的系列溶液。

分别量取不同浓度的杜鹃叶油及杜鹃枝油溶液各2ml，与2mldpph溶液混合于试管中，避光反应30min、60min。吸取反应后试剂于96孔板中，517nm处读取吸光度值。

2ml无水乙醇和2mldpph反应液为空白对照组。

清除百分率％＝1-a样品/a空白×100％

测定结果：分别测得杜鹃叶油及杜鹃枝油在30min及60min时对dpph的清除率，如图10-图13所示。

2.总氧化能力abts法

分别称取杜鹃叶油及杜鹃枝油各2.8040g，用无水乙醇作溶剂，并分别配制成浓度为(mg/ml)200、150、120、96、48、24、12、6、3、1.5的系列溶液。

试剂三按1：39的比例加蒸馏水(即40倍)配制成应用液，现配现用。按照比例试剂一：试剂二：试剂三应用液＝76:5:4配制工作液，试剂一为检测缓冲液，试剂二为abts溶液，试剂三为过氧化物溶液，试剂四为过氧化物酶。室温避光保存，30min内使用完毕。试剂四应用液按照试剂四：试剂一＝1:9的比例配制(即10倍)，现配现用。

空白对照为：10ul水+20ul试剂四应用液+170ul工作液。

测定管为：10ul样品+20ul试剂四应用液+170ul工作液。

室温下反应6min，于439nm处测定od值。

清除百分率％＝1-a样品/a空白×100％

标准曲线：y(对应标准液体积，即抗氧化能力强弱)＝-1.1214x(od值)+1.1262r2＝0.9957；

因此od值越大说明y值越小，抗氧化能力越弱。

表1总氧化能力abts法操作表

测试结果：分别测得杜鹃叶油及杜鹃枝油在abts实验中的抗氧化能力，如图14、图15所示。

3.frap实验

分别称取杜鹃叶油及杜鹃枝油各2.8040g，用无水乙醇/石油醚(1:1)作溶剂，配制成浓度为(mg/ml)200、120、96、75、60、48、30、24、12、3的系列溶液。

配制frap工作液，按照试剂一：试剂二：试剂三＝10:1:1配制，现用现配。

对照组：5ul蒸馏水+180ulfrap工作液。

测定组：5ul样品溶液+180ulfrap工作液。

37℃反应3-5min，于593nm处测定od值。

清除百分率％＝1-a样品/a空白×100％。

表2frap实验操作表

实验结果：分别测得杜鹃叶油及杜鹃枝油在abts实验中的抗氧化能力，如图16、图17所示。

抗氧化能力测试结果分析：

在dpph清除实验中，杜鹃叶油及杜鹃枝油均在30min时，6mg/ml浓度处对dpph清除率达到最大。其中杜鹃叶油在该处对dpph清除率为93.9％，杜鹃枝油为90.5％。

在abts实验中，杜鹃叶油的最高抗氧化能力为0.740，对应测试浓度为150mg/ml；杜鹃枝油的最高抗氧化能力为0.716，对应测试能力为200mg/ml。

在frap实验中，杜鹃叶油的最高抗氧化能力为0.908，对应测试浓度为150mg/ml；杜鹃枝油的最高抗氧化能力为0.898，对应测试能力为200mg/ml。

从三种不同抗氧化测定方法比较杜鹃叶油及杜鹃枝油的抗氧化能力，杜鹃叶油dpph清除率更高，abts实验中和frap实验中杜鹃叶油和杜鹃枝油而另外两者差别并不显著，杜鹃枝油也具有很好的抗氧化能力。