一种检测粘度的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测粘度的荧光探针及其应用。

背景技术：

粘度在生物系统中起着重要的作用，它影响着物质的输运，影响着生物分子与化学物质之间的信号相互作用。细胞内黏度异常与生理过程的改变有关，尤其与多种疾病状态有关。如糖尿病患者红细胞和血小板膜黏度升高，而血小板黏度变化可能导致胰岛素受体聚集减少，在阿尔茨海默症患者中，白细胞细胞膜黏度的降低促进淀粉样前体蛋白的积累，这些蛋白片段以不溶性斑块的形式沉积在大脑中。在细胞器水平，线粒体基质的异常黏度会引起线粒体网络组织的改变，进而影响代谢物的扩散，这与细胞方面的许多疾病和故障有关。因此，准确量化活细胞黏度变化具有重要意义。传统的机械粘度测量方法(降球粘度计、毛细管粘度计和旋转粘度计)不能用于测定细胞内粘度，目前传统的粘度分子荧光探针大部分能进行光谱成像，但是很少能进行细胞内成像。因此，需要合成新的粘度探针。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明提供一种检测粘度的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内粘度的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测粘度的荧光探针，简称rm-v，其化学结构式如式（i）所示：

式（i）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）将2,3,3-三甲基-3h-吲哚和溴乙烷在乙腈中加热回流反应，反应结束后旋干溶剂，乙醚洗涤，干燥后得到化合物1：；

（2）氮气保护下，将偶苯酰、对苯二甲醛和醋酸铵在乙酸中加热反应，反应结束将反应液冷却至室温，倒入等体积冰水中，抽滤，固体以水洗涤，干燥后得到化合物2：；

（3）氮气保护下，将化合物1和化合物2在n,n-二甲基甲酰胺中反应，反应完毕，反应液倒入等体积水中，二氯甲烷萃取，萃取液以水洗涤，干燥后去除溶剂，得到粗产物，纯化得到探针化合物。

步骤（1）中，2,3,3-三甲基-3h-吲哚与溴乙烷的摩尔比为1:1.5。

步骤（2）中，偶苯酰、对苯二甲醛和醋酸铵的摩尔比为1:1:8。

步骤（3）中，所述纯化步骤为粗产物以ch2cl2/甲醇=20:1v/v过硅胶柱。

合成路线如下：

。

一种上述荧光探针在制备检测溶液、细胞或生物体中粘度试剂中的应用。

本发明具有以下优点：

本发明合成了一种基于咪唑(给体，d)与半花菁(受体，a)通过苯环结合的线粒体靶向荧光粘度探针。本发明的探针合成步骤短、后处理简单；能够实现对线粒体的精确定位，共定位系数高；在紫外灯下可以观察到荧光颜色增强，是一种具有生色传感功能的荧光探针。该探针特异性高且颜色变化显著，可作为显示粘性/非粘性溶液和生物细胞内粘度定量检测的良好指示剂。故而，本发明是一种简单，灵敏，定位准确的粘度特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是荧光探针的¹hnmr图谱；

图2是探针rm-v对不同粘度的响应；

图3是探针rm-v对不同粘度下各种离子与分子的选择性柱状图数据；

图4是探针rm-v对不同粘度的溶液用紫外灯照射后荧光颜色的变化；

图5是探针rm-v与线粒体绿进行共定位染色；

图6是探针rm-v应用与细胞中粘度进行荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

（1）化合物1的合成：将2,3,3-三甲基-3h-吲哚(1eq)，溴乙烷(1.5eq)溶于乙腈中，加热至60℃回流反应12h。反应完毕后，旋干反应物，往残留物中加入乙醚，用布氏漏斗进行抽滤，用乙醚洗涤得到的固体，得到化合物1，产率为56%，为紫红色固体。无需进一步提纯，可以直接进行下一步反应：

；

（2）化合物2的合成：将偶苯酰(1eq)与醋酸铵(8eq)加入乙酸中，在氮气保护下加入对苯二甲醛(1eq)，110℃反应12h。tcl追踪监测反应。反应完毕后，将反应物冷却至室温，倒入冰水中析出固体，用布氏漏斗进行抽滤，用水洗涤所得固体，干燥后得到化合物2，产率为46%，为淡黄色固体。无需进一步提纯，可以直接进行下一步反应：

；

（3）探针rm-v的合成：将化合物1(1eq)和化合物2(1eq)溶于5mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中。混合物在90℃反应6小时，氮气保护，将反应混合物冷却至室温，然后将反应混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，用水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。在减压下除去溶剂。所得残余物通过硅胶柱色谱(ch2cl2/甲醇=20：1，v/v)纯化，得到探针rm-v，为紫红色粉末，产率为56.6%：

，

其¹hnmr图谱如图1。

实施例2荧光探针对不同粘度溶液的响应

取实施例1制备的荧光探针rm-v溶于二甲基亚砜（dmso）中，制成1.0mm的探针母液。所用的溶液体系，均为乙醇和丙三醇的混合溶剂。用乙醇和丙三醇配成不同比例(10:90；20：80；30:70；40:60；50:50；60:40；70:30；80:20；90:10；95:5)的粘度测试液。取2ml系列粘度测试液，各加入20μl探针母液，测试体系中探针的终浓度为10.0μm，用530nm进行激发，且其在575nm处的荧光比（i/i0）的对数显示出与溶液粘度的对数有良好的线性关系。如图2所示，其中，a为探针530nm激发下rm-v随丙三醇/乙醇体系中丙三醇含量的提高荧光谱图的变化情况；b为探针rm-v(10μm)的log(i575nm)与etoh/甘油溶剂（在530nm激发）中的log（粘度）之间的线性关系。

实施例3荧光探针对不同粘度下各种分子与离子的选择性

取实施例2制备的探针母液，加入分别加入两个体系，一个体系为纯乙醇溶液，另一个体系为乙醇；丙三醇为10:90的混合溶液。在两个体系中分别加入ni⁺，mn²⁺，fe²⁺，mg²⁺，no3^-，s2o3^2-，cd²⁺，so3^2-，hso3^-，ag⁺，dtbp，tbhp，h2o2，cys。用530nm进行激发，检测波长575nm，得到荧光光谱图，将光谱图数据处理成柱状图，如图3所示。可以发现这些离子或者分子都不能引起探针在粘性\非粘性溶液中荧光强度有明显改变。

实施例4荧光探针对不同粘度溶液的可视化检测

准备两个相同的石英皿，分别加入2ml乙醇与2ml乙醇：甘油=10:90甘油的乙醇溶液，各加入30μl实施例2配制的探针母液，在普通光源下未发生明显的颜色变化；但是伴随着紫外灯下肉眼可视的发现，非粘性溶液为白色，而粘性溶液发出橘黄色荧光，如图4所示，说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。

实施例5荧光探针与商业探针的共定位

将本发明探针应用与hela细胞中对粘度进行荧光成像应用，具体操作步骤如下：将hela细胞加入到培养液中，再加入20μm探针dmso溶液和商业染料线粒体绿(mito-trackergreen)，将两者都放在二氧化碳培养箱中培养15min后用共聚焦显微镜进行共定位成像，如图5所示，561nm激发，rm-v与商业染料线粒体绿(mito-trackergreen)共定位成像。其中a.绿色通道，b.红色通道。c.绿色通道与红色通道复合场。d.共定位皮尔逊系数图。成像结果表明，rm-v的绿色通道与红色通道可以非常好的重合，其共定位系数为97%，实验结果表明本发明的探针能够准确定位细胞线粒体。

实施例6荧光探针在活细胞中的成像应用

将本发明探针应用与hela细胞中对粘度进行荧光成像应用，具体操作步骤如下：将hela细胞加入到培养液中，再将20μm探针dmso溶液加入到另外一盘育有hela细胞的细胞培养液中，将两者都放在二氧化碳培养箱中培养15min后用共聚焦显微镜进行成像，561nm激发，结果如图6所示，其中：a.hela细胞中培养20min后明场图，b.hela细胞中培养20min后的荧光成像图，c.a和b的叠加图。d.探针浓度为1mm加入20μm到hela细胞中培养20min后的明场图，e.探针浓度为1mm加入20μm到hela细胞中培养20min后的荧光成像图，f.d和e的叠加图。结果表明，进行明场成像，可以看到细胞大致的轮廓，且都看不到荧光；用561nm进行激发观察，未经探针处理的hela细胞无荧光，而经过探针处理的细胞可以看到明显的红色荧光，且红光集中在细胞线粒体上。