一种近红外荧光分子探针及其制备方法和在细胞成像中的应用

本发明属于荧光分子探针技术领域，特别涉及一种近红外荧光分子探针及其制备方法和在细胞成像中的应用。

背景技术：

近红外光系是指位于650～900nm区间内的光波，在此范围内的光抗干扰性强，可在较深组织中产生光信号，且对机体组织无影响。近红外成像技术已广泛应用于肿瘤组织定位成像、体内金属离子或其他微量生物活性成分成像、药物修饰等生物科学领域，以其安全、有效、无损、低成本、易操作、非侵入式、实时、在位检测等优点成为当前成像检测领域的热点[maxwelld,changq,zhangx,etal.bioconjugchem,2009,20(4):702-709.yix,wangf,qinw,etal.internationaljournalofnanomedicine,2014,9:1347–1365.chenh,linw,cuih,etal.chemeurj,2015,21:733-745.cilliersc,liaoj,atangchol,etal.molimagingbiol,2015,doi:10.1007/s11307-015-0851-7]。据报道，近红外成像技术采用荧光探针标记肿瘤细胞、金属离子、抗体和多肽等，通过激发荧光基团产生发射光，其中更有效的标记方法是利用基因载体将荧光蛋白基因转染整合至人肿瘤细胞基因组中，使肿瘤细胞产生稳定的、可遗传的荧光标记，克服荧光标记探针在体内不稳定的缺点[张士新,陈明心,李芳秋.医学研究生学报,2009:195-197.成俊,史晓峰,谢森,等.医学研究生学报,2005,18(1):13-16.sheny,zhaoj,chenc,etal.guangzhouchemicalindustry,2014,42(1):47-48.]。与传统的侵入式检测方法相比，活体成像检测技术通过对活体试验对象在不同时间点进行定位，观察，检测，跟踪荧光所在位置及信号强度的变化，能清晰可见的了解目标的具体情况，数据真实可靠。迄今已有多种近红外荧光染料用于体外和体内肿瘤探测的研究，其中，吲哚菁绿(indocyaninegreen，icg)是第一种由fda批准用于人类的具有代表性的有机染料[boutross,greinerc,hwud,elal.jbiomed,2007,12(10):1117-1123.caesarj,shaldons,chiandussil,etal.clinsci,1961(21):43–57.abd-el-azizas,strohmea,okasharm.journalofmolecularstructure,2015:228–235.]。

自2011-2015年先后有克里唑替尼(crizotinib)、色瑞替尼(ceritinib)和阿来替尼(alectinib)三种药物作为小分子选择抑制剂获得美国fda批准上市，主要用于治疗诊断为alk阳性的局部晚期或转移的eml4-alk阳性非小细胞肺癌。

当前，针对eml4-alk阳性非小细胞肺癌的早期诊断及其治疗成为国际研究的热点。特别是近年来随着纳米医学和分子影像学的不断发展，针对肿瘤诊疗一体化的研究取得了一定的进展。但是，如何实现高灵敏、高分辨的肿瘤成像诊断与有效治疗的有机结合，并为肿瘤诊疗提供有效信息仍是目前癌症诊疗一体化的一大难题。因此，设计出理想诊疗试剂对于实现eml4-alk阳性非小细胞肺癌实时监测与治疗一体化策略起决定性作用。当前还没有关于eml4-alk阳性非小细胞肺癌诊疗一体化研究的研究报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种近红外荧光分子探针及其制备方法和在细胞成像中的应用，该近红外荧光分子探针可用于eml4-alk阳性非小细胞肺癌细胞靶向成像，灵敏度高，结果准确。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种近红外荧光分子探针，其结构式如下：

本发明还提供了一种上述近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：在惰性气体保护下，化合物3和化合物2反应，制得化合物1；

其中，化合物3的结构式为：

其中化合物2的结构式为：

反应路线如下：

优选的，化合物3和化合物2的摩尔比为1：(1-5)，反应温度为20-40℃，反应时间为0.5～24h，反应溶剂为dmf或者dmso。选用dmf或dmso具有独特性，只有这两种溶剂所得化合物的产率高，副产物低，且反应时间短。

进一步优选，化合物3和化合物2的摩尔比为1:4，反应温度为25-30℃，反应时间0.5-6h。

优选的，反应后还需纯化工艺，具体为：减压浓缩反应液，加入醚类溶剂，过滤；滤饼经色谱柱层析，即得。

作为进一步优选：

其中，所述醚类溶剂为分子量为74-186的醚类化合物，选择乙醚、甲基叔丁基醚或正己醚，醚类溶剂加入量可为减压浓缩后的反应液的体积的5-30倍。

其中，色谱柱为硅胶柱，硅胶的规格为200-300目；洗脱液为体积比30:1～35:1的二氯甲烷和甲醇的混合物。之所以用过硅胶柱法纯化该化合物是因为吲哚七甲川菁类染料的稳定性很差，在制备和纯化过程中容易产生大量杂质，国外大多采用制备型高效液相分离纯化，本专利的纯化方法采用过硅胶柱法，操作简单方便，速度较快，得到产品纯度和产率较高。

本发明还提供了上述的近红外荧光分子探针在细胞成像中的应用。

进一步，本发明还提供了所述的近红外荧光分子探针在制备非小细胞肺癌靶向成像检测试剂中的应用。优选，所述非小细胞肺癌为eml4-alk阳性非小细胞肺癌(ncih3122细胞)。

上述近红外荧光分子探针在ncih3122细胞中靶向成像的应用，最佳孵育时间(30min)和投入探针的量(11μm)。

对于一般近红外荧光染料来说，其在体内代谢较快，对体内细胞没有毒性，且具有较好的荧光检测活性。而本发明将化合物3与一些功能性的分子(化合物2，色瑞替尼)相结合，以增加其生物相容性，延长其在体内的代谢时间，并可能使其具有肿瘤组织靶向识别、成像和治疗的能力。通过研究证实，该探针以eml4-alk阳性非小细胞肺癌细胞作为靶点，可用于eml4-alk阳性非小细胞肺癌的靶向成像诊断。

有益效果：相对于现有技术，本发明提供的近红外荧光分子探针结构新颖，制备工艺简单，能有效的避开生物自发荧光和细胞内源性物质的干扰，灵敏度高、光学稳定性好、细胞膜渗透性好，能够作为检测eml4-alk阳性非小细胞肺癌荧光成像的近红外荧光探针。该荧光分子探针在分析化学、生命科学、环境科学等领域具有较强的实际应用价值。

附图说明

图1是本发明的近红外荧光分子探针的ms图。

图2是本发明的近红外荧光分子探针的¹h-nmr图。

图3是本发明的近红外荧光分子探针的紫外吸收光谱图。

图4是本发明的近红外荧光分子探针的荧光发射光谱图。

图5为本发明的近红外荧光分子探针在活的eml4-alk阳性非小细胞肺癌细胞(ncih3122细胞)内荧光成像图，其中，a,b为在ncih3122细胞中先加入化合物2(色瑞替尼)后再加入化合物1的共聚焦成像图(a为白光图，b为荧光图)；c,d为在ncih3122细胞中只加入化合物1的共聚焦成像图(c为白光图，d为荧光图)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下面描述的实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂、仪器等，若无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

将0.15mmol化合物3加入到50ml反应瓶中，加入3ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)搅拌,加热到25℃，溶解，氩气保护下,加入0.6mmol化合物2，25℃搅拌2h，反应结束。将反应液倒入25ml甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得11mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。

其质谱谱图见图1，氢谱谱图见图2。

esi-msm/z：1060.56[m+h-i]⁺。

¹h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ(ppm)＝8.18(s,1h)，7.95(d,1h)，7.93(s,1h)，7.88-7.76(d,1h)，7.73-7.70(m,3h)，7.70(d,1h)，7.41-7.32(m,4h)，7.14-7.11(m,3h)，6.95(s,1h)，5.99(d,1h)，4.65(d,1h)，4.18-4.16(s,2h)，4.00-3.97(m,3h)，3.84-3.86(m,2h)，2.67(m,10h)，2.27(m,3h)，2.12-2.09(m,2h)，1.98-1.93(m,5h)，1.74-1.71(m,9h)，1.61(s,6h)，1.40-1.25(m,14h)，1.07-1.04(m,5h)。

其紫外吸收光谱见图3，其荧光发射光谱见图4。

实施例2

将0.15mmol化合物3加入到50ml反应瓶中，加入3ml无水二甲基亚砜(dmso)搅拌,加热到25℃，溶解，氩气保护下,加入0.6mmol化合物2，25℃搅拌2h，反应结束。将反应液倒入25ml乙醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得10mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。

实施例3

将0.15mmol化合物3加入到50ml反应瓶中，加入3ml无水二甲基亚砜(dmso)搅拌,加热到25℃，溶解，氩气保护下,加入0.6mmol化合物2，25℃搅拌2h，反应结束。将反应液倒入25ml乙醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比35:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得8mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。

实施例4

将0.15mmol化合物3加入到50ml反应瓶中，加入3ml无水二甲基亚砜(dmso)搅拌,加热到20℃，溶解，氩气保护下,加入0.3mmol化合物2，20℃搅拌2h，反应结束。将反应液倒入25ml甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得8mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。

实施例5

将0.15mmol化合物3加入到50ml反应瓶中，加入3ml无水dmf搅拌,加热到20℃，溶解，氩气保护下,加入0.15mmol化合物2，20℃搅拌4h，反应结束。将反应液倒入30ml乙醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得5mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光探针。

实施例6

将0.15mmol化合物3加入到50ml反应瓶中，加入3ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)搅拌,加热到25℃，溶解，氩气保护下,加入0.6mmol化合物2，25℃搅拌2h，反应结束。将反应液倒入25ml甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比35:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得10mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。

实施例7

将0.15mmol化合物3加入到50ml反应瓶中，加入3ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)搅拌,加热到25℃，溶解，氩气保护下,加入0.6mmol化合物2，25℃搅拌0.5h，反应结束。将反应液倒入25ml甲基叔丁基醚中，析出绿色固体，滤纸过滤，收集上层固体物质。200-300目硅胶柱柱层析分离提纯，洗脱液为体积比30:1的二氯甲烷和甲醇的混合物，得7mg绿色金属色泽晶体为近红外荧光分子探针。

实施例8

如图5所示，a,b为在ncih3122细胞中先加入化合物2(色瑞替尼)后再加入探针化合物1的共聚焦成像图(图5a为白光图，b为荧光图)，从b图中可以看到，细胞几乎没有荧光信号。c，d为在ncih3122细胞中只加入探针化合物1的共聚焦成像图(图5c为白光图，d为荧光图)，从d图中可以看到，细胞荧光强度较强。从图a，c中可以看到，标记新探针的ncih3122细胞外形呈边缘光整的单核形态，该肿瘤细胞分裂增殖速度较慢，且细胞活力较弱。

通过激光共聚焦成像实验证明了荧光探针化合物1具有成像的活性。当ncih3122细胞首先加入了alk阳性抑制剂色瑞替尼，再加入荧光探针化合物1后，细胞中没有荧光信号；相同条件下，在细胞中直接加入荧光探针化合物1，细胞有荧光信号。实验结果说明，alk阳性抑制剂色瑞替尼进入了含有alk阳性肿瘤细胞中且阻碍了探针化合物1继续进入细胞，而在没有色瑞替尼的另一组实验中，探针化合物1进入细胞内部且产生了荧光信号。这充分说明，探针化合物1同色瑞替尼一样具有alk阳性抑制的作用，且具有在alk阳性肿瘤细胞中荧光成像的性质。本实验组的激光共聚焦显微镜(20倍物镜)最大激发波长是690nm。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。