一种光合菌红光碳点及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种光合菌红光碳点及其制备方法和应用。


背景技术：

2.碳点(carbondots，简称cds)是一种新型的碳基材料，尺寸大小在10nm以下，通常是类似于“核
‑
壳”式的球形或半球形结构，以sp2杂化的共轭碳为核，表面有大量含氧或其他杂原子的有机基团。cds以其优异的光学性能、良好的水溶性、低毒、环保、原料来源广、成本低和良好的生物相容性而受到广泛关注。由于这些突出的特性，cds在传感、生物成像、纳米医学、催化等领域显示出巨大的前景。生物成像是一项前沿生物技术应用领域，可用于体内或体外的组织、器官和细胞的结构和功能研究。由于传统的半导体量子点及有机荧光分子具有光漂白特性，无法适用于细胞和生物组织的长期观察研究。而具有优良的固有荧光性、抗光漂白性、水溶性和低毒性等特性的碳点，有望替代传统的半导体量子点和有机荧光探针，从而成为一类新的较理想的生物成像材料。
3.目前，碳点的合成原料和合成方法等方面都已经发展到了一定的高度。然而，大多数cds在生物成像应用中也遇到了若干局限。例如，目前报道的大部分cds只在蓝光到绿光的区域表现出强烈的发射，这种发射不仅与组织和细胞的自发荧光互相干扰，还会对其造成辐射损伤，极大地限制了cds在生物医学领域的应用。据报道，波长的微小变化会造成光毒性的显著变化。例如，488nm和514nm之间的差异可能导致成像细胞的生存和死亡的差异。与这些低波长发射的cds相比，红光发射cds的能量更低，对生物体的穿透能力更强，具有更强的生物成像能力，因此在生物和医学领域更有优势。因此，制备长波长发光的cds具有广泛的应用前景。
4.现有技术中，以邻苯二胺为前驱物，利用乙醇溶剂热法制备了具有良好光学性能和生物相容性的远红
‑
近红外发光碳点，能够用于超快溶酶体成像和极性监测。但因该碳点的合成过程涉及较多的有机试剂，且提纯较复杂，限制了该碳点的进一步应用。


技术实现要素：

5.为了解决上述存在的技术问题，本发明提供一种光合菌红光碳点，产生红色荧光，结构稳定，细胞毒性低，可应用于生物成像。
6.为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
7.一种光合菌红光碳点的制备方法，是利用光合细菌为前体物，通过微波辅助热处理生成碳化产物，再经过提取、纯化得到所述光合菌红光碳点。
8.具体地，所述光合细菌包括但不限于外硫红螺菌科、着色菌科、绿色硫细菌、紫色非硫细菌、多细胞丝状绿细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌。
9.一种光合菌红光碳点的制备方法，具体包括以下步骤：
10.1)称取1～5g光合细菌加入到10～50ml去离子水中，将混合物转移到100ml烧杯
中，于微波炉中高火加热10～30min；
11.2)高火加热后，待烧杯逐渐冷却至室温，加入10～30ml去离子水，超声10～60min得到深绿色溶液；
12.3)步骤2)得到的深绿色溶液离心，去除大颗粒，收集上清液，然后将得到的上清液抽滤，去除大颗粒的不溶性物质后装入透析袋中，在超纯水中透析，去除小分子物质，得到光合菌红光碳点溶液；
13.4)将得到的光合菌红光碳点溶液通过冷冻干燥装置冷冻干燥后制得固体产物，得到光合菌红光碳点。
14.具体地，所述步骤(3)中离心时离心的速度10000～11000rpm，离心时间10～30min。
15.具体地，上述步骤(3)中，抽滤时采用孔径为0.22μm的有机水性微孔滤膜。
16.具体地，在超纯水中透析时，透析袋截留分子量为1000da，透析时间为48～72h。
17.具体地，上述步骤(4)中，冷冻干燥的时间为24～36h。
18.另外，本发明还提供了一种所述制备方法得到的光合菌红光碳点。
19.最后，本发明还提供了一种采用上述制备方法制得光合菌红光碳点用于细胞显影的效果。
20.由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
21.1)本发明首次采用光合细菌作为制作碳点的原材料，采用微波热法制作碳点。制成的光合菌红光碳点在水介质中具有很高的分散性和稳定性。
22.2)光合菌红光碳点在紫外灯照射显示出红色荧光，它具有三个吸收峰，分别为230nm、280nm和405nm；在不同的激发波长下，其荧光发射峰不同。在340nm的激发光下，光合菌红光碳点有两个荧光发射峰，分别位于450nm和595nm；随着激发波长的增加，450nm处的荧光峰发生红移，而595nm处的荧光发射峰位置不变。此外，在400nm的激发光下，光合菌红光碳点在642nm出现了一个新的荧光发射峰。
23.3)在0.1
‑
10000μg/ml浓度范围内，光合菌红光碳点对huvec细胞均没有表现出明显的细胞毒性。不同浓度的光合菌红光碳点与细胞孵育24h后，其细胞存活率在100％～108％之间波动。
24.4)本发明制得的光合菌红光碳点在1mg/ml的浓度下，能够快速进入细胞，积累在溶酶体中，显示出较好的细胞显影效果，具有良好的生物显影潜力。
附图说明
25.图1为实施例1采用15％的接种量接种绿色硫细菌于250ml本实验室配置的光合细菌培养基中，于光照培养箱中在30℃、75％相对湿度以及7920lux光照强度下培养72h，绿色硫细菌的生长情况。
26.图2为实施例2制得的光合菌红光碳点的透射电镜图，插图为对应的高分辨电镜图和粒径统计图。
27.图3为实施例2制得的光合菌红光碳点的紫外
‑
可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b，
ex
＝340nm,400nm)，插图为365nm紫外光照射下的照片。
28.图4为实施例2制得的不同浓度的光合菌红光碳点与huvec细胞孵育24h后，采用
mtt法测试的细胞毒性结果。
29.图5为一定浓度(1mg/ml)的实施例2制得的光合菌红光碳点以及lyso
‑
trackergreen(溶酶体绿色荧光探针)与huvec细胞共培养10min后，在480nm以及540nm激发光波长下获得的激光共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
31.实施例1
32.光合细菌培养基组分如下：乙酸钠3.0g，酵母提取物1g，硫酸铵1.25g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.07g，硫酸亚铁0.01g，磷酸二氢钾0.15g，加适量水溶解，定容到1000ml。将配置好的液体培养基灌满整个500ml蓝盖试剂瓶，光合细菌原液10
‑
25％比例接种于其中，然后旋紧瓶盖。在30℃、75％相对湿度以及7920lux光照强度下，将培养瓶置于光照培养箱内培养3d。在无菌条件下取30ml菌液分装到50ml的离心管内，11000rpm离心10min，弃去上清，收集红色菌体。培养的光合菌液如图1所示。
33.实施例2
34.一种光合菌红光碳点的制备方法，是利用绿色硫细菌为前体物，通过微波辅助热处理生成碳化产物，再经过提取、纯化得到所述光合菌红光碳点。
35.具体的绿色硫细菌红光碳点的制备方法，包括以下步骤：
36.1)称取2g绿色硫细菌加入到20ml去离子水中，将混合物转移到100ml烧杯中，于微波炉中高火加热10min；
37.2)高火加热后，待烧杯逐渐冷却至室温，加入10ml去离子水，超声30min得到深绿色溶液；
38.3)步骤2)得到的深绿色溶液11000rpm离心10min，去除大颗粒，收集上清液，然后将得到的上清液抽滤，抽滤时采用孔径为0.22μm的有机水性微孔滤膜,去除大颗粒的不溶性物质后装入透析袋中，在超纯水中透析72h，去除小分子物质，得到绿色硫细菌红光碳点溶液，其中在超纯水中透析时，透析袋截留分子量为1000da；
39.4)将得到的绿色硫细菌红光碳点溶液通过冷冻干燥装置冷冻干燥30h后制得固体产物，得到绿色硫细菌红光碳点。
40.本实施例制得的绿色硫细菌红光碳点，其透射电镜图如图2所示，可见该碳点形貌为类球形结构，尺寸大约为3.9nm，内部具有晶面间距为0.242nm的晶格条纹，说明该绿色硫细菌红光碳点结晶性较好。
41.另外，绿色硫细菌红光碳点的紫外
‑
可见吸收光谱(a)和荧光发射光谱(b，
ex
＝340nm,400nm)，分析可知在365nm的紫外灯下呈明亮的红色荧光，在340nm光激发下，绿色硫细菌红光碳点水溶液在595nm有一个荧光发射峰。
42.实施例3
43.实施例2制得绿色硫细菌红光碳点在生物医学领域的应用，具有良好的生物显影的效果。
44.初步研究发现，在1mg/ml的浓度下，能够快速进入细胞，积累在细胞中，显示出良好的细胞显影效果。
45.huvec细胞培养条件：在60mm细胞培养皿中，加入10ml含10％胎牛血清、1％双抗的dmem培养液，置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养。huvec为贴壁细胞，待细胞长到80％时，用1ml的胰蛋白酶液消化2min30s，用4ml含10％胎牛血清、1％双抗的培养液终止胰酶作用，反复吹打瓶底细胞使其充分分散。在1000rpm转速下，离心5min，弃去上清液，在细胞沉淀中加入新鲜培养基，吹打均匀后以1：4的比例转到新培养瓶中继续培养待用。
46.采用mtt法检测制得的绿色硫细菌红光碳点的细胞毒性。mtt法是一种常见的检测细胞存活和生长的方法，检测原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt(噻唑蓝)还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒以沉积在细胞中，死细胞却无此功能，然后用dmso(二甲基亚砜)溶解出细胞中的甲瓒，再用酶标仪在560nm，630nm波长条件下测定其吸光度，以此反映细胞存活率。
47.mtt细胞毒性测试结果显示huvec细胞(血管上皮细胞)与不同浓度的绿色硫细菌红光碳点共培养24h后，结果如图4所示。由图4可知，在0.1
‑
10000g/ml浓度范围内，绿色硫细菌红光碳点对huvec细胞均没有表现出明显的细胞毒性，表明制得的绿色硫细菌红光碳点具有很低的毒性。
48.收集对数生长期的huvec细胞，按照2
×
104细胞/皿接种于激光扫描共聚焦显微镜(clsm)专用的玻底培养皿中。置于co2培养箱中37℃培养24h后，吸除clsm培养皿的上清液，用pbs洗两次后加入配制好的lyso
‑
trackergreen，孵育30min，弃去培养基，用pbs洗两次后加入配制好的1mg/ml的绿色硫细菌红光碳点溶液，放回培养箱继续培养10min。培养结束后，移除培养皿中的上清液，pbs洗三次后用300μl4％多聚甲醛室温固定细胞15min。pbs洗三次，于4℃下避光保存，用激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。结果如图5，表明绿色硫细菌红光碳点具有良好的生物显影潜力，并且该碳点聚集在细胞溶酶体。
49.综上，本发明的制备方法具有反应步骤简单、成本低、绿色环保等优点，所制备的光合菌红光碳点粒径均匀，结构稳定，具有荧光性能。
50.光合菌红光碳点对细胞活性的影响极小，同时显示出红色荧光，具有良好的细胞显影效果。以光合细菌作为出发碳源制备的光合菌红光碳点具有很低的细胞毒性和良好的细胞显影能力，在生物医学中具有潜在的应用前景。
51.以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。