一种碳量子点的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于细胞成像的荧光量子点制备方法，基团修饰及其在生物医学领域的应用，属于纳米材料制备和应用领域。
【背景技术】
[0002]量子点指半径小于或接近激光波尔半径的半导体纳米晶体，是具有独特的光特性和电特性的纳米尺寸粒子。量子点作为一种荧光材料，在生物医学领域中普遍应用于细胞及活体荧光标记与成像。以往生物医学领域应用较多的的有机化学染料(如FITC、Cy5,Hoechst 33342等)和基于重金属的半导体量子点(如CdTe，CdSe等)，逐渐暴露出难以克服的局限性，主要体现在以下几方面:(I)有机试剂或含金属元素的半导体量子点属于工业合成产物，有一定的生物毒性，实际医学临床应用时具有很大的风险；(2)随着生物探针的深入研宄，对荧光标记探针的易用与稳定性要求越来越高，一般有机荧光染料抗漂白能力差，容易在使用中失效；而金属量子点的难溶解问题也逐渐制约其在活体中的应用；(3)含金属元素的半导体量子点的激发和发射波长固定，在成像时较为单一，在多色成像方面有明显的劣势；(4)有机染料和金属量子点在合成、原料采集和工艺原料方面需求苛刻，合成复杂，环保性差，不利于绿色应用和多次使用。
[0003]新型碳纳米材料，包括碳量子点、纳米晶体、纳米管、纳米线及碳多孔材料在纳米电子、生物成像、微电载体等研宄领域得到越来越多的应用。其中碳量子点(C-Dots)是一种与半导体量子点具有相似光学性能的、环境友好型荧光纳米材料，最初是通过电解单臂碳纳米管方式获得的小粒径可发光材料。目前的碳材料已从氧化石墨烯、多臂和单臂碳纳米管等原有材料逐渐扩展到有机碳微晶、多糖类及可降解碳物质如草木灰、石蜡等。这些碳量子点除拥有光学性能优良、尺寸小等传统半导体量子点所具备的优点外，还具有细胞毒性低、生物相容性好、易于大规模合成及功能化修饰、制备成本低廉、反应条件温和等优势。目前，碳量子点合成方法较多如:溶剂热法、电化学方法、高温分解法、微波加热法等，且趋于简便、高产率。但遗憾的是，尽管目前开发了多种合成方法，碳量子点的荧光量子产率仍普遍不够高；有的合成方法繁琐、条件苛刻、不够环保，这也是碳量子点应用受到限制的重要原因。我们的专利提出了一种简单快速的碳量子点制备及修饰方法，提高其荧光量子产率，推动碳量子点在生物医学成像和材料等多领域的应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对传统有机染料和金属量子点不足，设计一种以壳聚糖为原料的碳荧光量子点制备的方法。该方法采用微波高温法一步合成具有高量子产率的碳量子点，辅助亲水性聚乙二醇(PEG-4000)表面钝化，从而获得高成像能力、水溶性、成本低廉、抗光淬灭的生物/医学用成像量子点。本发明方法原料易得，制备过程简便，产物碳量子点具有优异的光学性质，特别适合应用于生物医学示踪、成像领域。
[0005]本发明首先采用壳聚糖，在酸性溶液中溶解后，辅助结合聚乙二醇(PEG-4000)，微波高温短时间促碳化，完成合成及表面钝化两部分。本发明方法包括如下步骤:
[0006]步骤1.称取定量的大分子量壳聚糖，溶解在酸度为2% -5%的乙酸溶液中；加入强氧化性酸(硫酸或硝酸)，磁力搅拌均匀。
[0007]步骤2.加入少量PEG，充分溶解，通入氮气保护一定时间，至产生均匀溶液；
[0008]步骤3.将溶液放入耐高温烧杯中，选取700w-900w功率微波炉，以不同循环时间进行微波加热，循环次数2-20次；
[0009]步骤4.将微波处理后的加热产物密封，自然冷却到室温，加入三蒸水，溶解褐色产物；
[0010]步骤5.对褐色溶液离心分离，高速离心，留取上清液；
[0011]步骤6.上清液经透析袋透析，得纯净量子点C-dots溶液，冷冻干燥，对量子点进行定量称重，密封保存；
[0012]步骤7.用紫外，荧光分光光度计进行光学性质表征，并计算量子产率。
[0013]本发明的优势在于(I)本合成方法步骤简便、成本低廉、反应条件温和、荧光量子产率高；(2)该量子点表面有氨基基团，易于修饰；(3)该量子点激发光和发射光谱可调可变，具有可多色成像的优势；(4)该量子点的光稳定性、生物相容性、抗漂白能力也得到了提高；(5)该量子点水溶性好，成像清晰，具有很好的成像示踪效果和应用前景。
【附图说明】
[0014]图1为碳量子点制备流程示意图
[0015]图2为碳量子点成像示意图
[0016]图3为碳量子点抗光淬灭效果图
[0017]图4为碳量子点的细胞成像效果图
【具体实施方式】
[0018]【具体实施方式】是对本发明做进一步说明，并不用来限制本发明的保护范围。
[0019]实施例1:微波合成水溶性壳聚糖碳量子点
[0020]步骤1.称取500mg大分子量的壳聚糖(10kDa)，溶解在250ml酸度5%的乙酸溶液中；取1ml溶液加入5ml浓硫酸，磁力搅拌均勾，并氮气保护Ih ；
[0021 ] 步骤2.将溶液放入耐高温烧杯中，选取700w功率微波炉，以20s ON, 1s OFF的方式进行微波加热，循环次数5次；
[0022]步骤3.将微波处理后的加热产物密封，自然冷却到室温，加入三蒸水5ml，溶解褐色产物；对褐色溶液离心分离，14000rpm lOmin，保留上清液；
[0023]步骤4.上清液经透析袋透析后，得纯净量子点C-dots溶液，冷冻干燥保存。
[0024]用紫外，荧光分光光度计进行光学性质表征，对比标准品硫酸奎宁计算荧光量子产率为9.71 %，该合成步骤中量子点量子产率相对较低，考虑缺乏钝化步骤，故在此基础上进行改进，改进方法见实施例2。
[0025]实施例2:微波合成水溶性壳聚糖碳量子点
[0026]步骤1.称取500mg大分子量的壳聚糖(10kDa)，溶解在250ml酸度5%的乙酸溶液中；取1ml溶液加入5ml浓硫酸，磁力搅拌均勾，并氮气保护lh。
[0027]步骤2.加入20