一种靶向活细胞线粒体的碳基荧光探针及其制备
【技术领域】
[0001] 本发明涉及突光纳米材料，具体是一种基于碳点（CarbonDots，⑶s)的线粒体革巴 向探针的制备及应用。
【背景技术】
[0002] CDs作为一种新的荧光探针，除了具备传统量子点的激发光谱宽、粒径小，光稳定 性好、Stokes位移大、生物相容性好、荧光寿命长的优良性质外，尤其具有低毒性的特点，所 以在生物标记方面被看做是量子点的有力替代品（Ruedas-Rama,M.J.，etal.，AnalChim Acta, 2012, 751:1-23. )〇
[0003] 线粒体作为细胞的能量工厂，参与细胞的氧化磷酸化和脂质氧化等重要过程。如 其功能紊乱，则会严重影响细胞的状态，生命体表现出弗立特里希氏共济失调、帕金森病、 糖尿病和亨丁顿舞蹈症等症状。因此，线粒体成像对于亚细胞水平的诊断治疗具有重要意 义（Sharma，A.，etal.，Biomacromolecules，2012, 13 (1):239-52)。
[0004] 当前的线粒体探针主要有罗丹明 123(CallahanJ,K.J.，Biomacromolecules, 20 06, (7) : 9), JC-1 (Wang,L., etal., NanoLett, 2011. 11 (2) :p. 772-80), Mitotracker(Min amikawaT,S.A.,JournalofCellSciencel999(112):ll)系列等。虽然目前它们都已 得到广泛应用，但仍然存在水溶性差，荧光易淬灭，光毒性等不足（Yang，Y.，etal.，Chem Commun, 2012. 48(3):380-2).
【发明内容】
[0005] 针对以上问题，本发明提供了一种光稳定性好的碳基水溶性线粒体探针的制备方 法。
[0006] 本发明采用的技术方案为：
[0007] -种靶向活细胞线粒体的碳基荧光探针，是用于活细胞线粒体标记的细胞器探 针，以CDs为荧光团，TPP为线粒体靶向分子，通过CDs表面的氨基与TPP末端的羧基之间 的酰胺化反应将两者接枝在一起。
[0008] 所述碳基荧光探针的制备方法：首先以柠檬酸和尿素为原料水热法合成表面 带有氨基的CDs，然后通过酰胺化反应接枝上末端带有羧基的三苯基膦（TPP)小分子 (Marrache，S.andSDhar，ProcNatlAcadSciUSA, 2012. 109 (40): 16288-93)，用水系 膜和葡聚糖G-25凝胶柱分离纯化得到产物TPP-⑶s。
[0009] 以柠檬酸为碳源，尿素为氮源，水热法制备得到氮掺杂的高量子产率CDs，通过调 控两种原料的投料比，可以得到一系列不同羧基与氨基比的CDs;20ml水热反应釜置于马 弗炉中，反应温度为180-200°C，反应时间为4-10h;柠檬酸与尿素的摩尔比为6 :1-0 :1 ; 所得CDs溶液为金黄色液体。
[0010]由于⑶S水溶性较好，而末端羧基的TPP易溶于乙醇，故选取1:10 -10 :1比例的 乙醇/水反应体系，先期加入EDC/NHS活化溶于乙醇的40mgTPP的末端羧基，EDC，NHS，TPP 的摩尔比例为1 :1. 1 :1. 2,然后加入5ml含有20-120mgCDs水溶液室温搅拌反应12-48h;0. 22um水系膜过滤后用葡聚糖G-25凝胶分离柱分离提纯，去除未反应的原料，所得水溶液 为黄色液体。
[0011] 本发明制备的线粒体探针具有如下优点：
[0012] (1)制备方法简单，不需要繁琐的分离操作步骤；
[0013] (2)合成的线粒体靶向荧光纳米粒子粒径小，水溶性好；
[0014] (3)荧光量子产率高；
[0015] (4)光稳定性好，不存在光漂白现象；
[0016] (5)细胞毒性低、生物相容性好。
【附图说明】
[0017] 图1是TPP-⑶s的透射电镜照片；
[0018] 图2是CDs,TPP和TPP-CDs的紫外光谱图；
[0019]图 3 是CDs,TPP和TPP-CDs的Zeta电位；
[0020] 图4是CDs,TPP和TPP-CDs的红外光谱图；
[0021] 图5是⑶s和TPP-⑶s的荧光光谱图；
[0022] 图6是CDs和TPP-CDs的pH稳定性；
[0023] 图7是⑶s和TPP-⑶s的抗光漂白性；
[0024] 图8是TPP-⑶s的细胞线粒体荧光成像图片；
[0025] 图9是TPP-〇)s与MitotrackerDeepRed在细胞成像中的突光共定位分析。
【具体实施方式】
[0026] 下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0027] 实施例
[0028] ( 1)⑶s的制备及分离提纯：
[0029] 分别取柠檬酸0. 3mol，尿素1. 8mol溶解于20ml去离子水中，搅拌均匀后将溶液转 移到水热反应釜中，马弗炉加热，程序升温至200°C，反应时间为10h，待降至室温后将所得 金黄色溶液冷冻干燥方法浓缩后用葡聚糖G-50凝胶柱分离纯化去除未反应物，之后将产 品冷冻干燥备用。
[0030] (2)TPP-CDs的合成及分离提纯：
[0031] 分别称取65mg⑶s和41mgTPP，分别溶于5ml去离子水与乙醇中，搅拌状态下首 先向TPP的乙醇溶液中加入EDC?HC1和NHS(摩尔比TPP:EDC:NHS=1 :1. 1 :1. 2)，活化羧 基20min后将⑶s溶液缓慢滴加至TPP溶液中，室温搅拌反应48h。所得溶液50°C旋蒸去 除乙醇，冷冻干燥方法浓缩后G-50葡聚糖凝胶柱分离去除未反应物，所得产物冷冻干燥备 用。（3)量子产率测定（Yang，Y.，etal.，ChemCommun，2012.48(3):380-2):
[0032]选取硫酸奎宁作为标准物，以0. 1MH2S04作溶剂，分别检测待测荧光物质与标准物 的紫外吸光度与最大荧光激发波长下的荧光发射峰面积，选用计算公式为：
【主权项】
1. 一种靶向活细胞线粒体的碳基荧光探针，是用于活细胞线粒体标记的细胞器探针， 其特征在于： 以CDs为荧光团，TPP为线粒体靶向分子，通过CDs表面的氨基与TPP末端的羧基之间 的酰胺化反应将两者接枝在一起。
2. -种权利要求1所述碳基荧光探针的制备方法，其特征在于： 首先以柠檬酸和尿素为原料水热法合成表面带有氨基的CDs，然后通过酰胺化反应接 枝上末端带有羧基的三苯基膦（TPP)分子，用水系膜和葡聚糖G-25凝胶柱分离纯化得到产 物TPP-CDs。
3. 按照权利要求2所述碳基荧光探针的制备方法，其中CDs的制备其特征在于： 以柠檬酸为碳源，尿素为氮源，水热法制备得到氮掺杂的高量子产率CDs，通过调控两 种原料的投料比，可以得到一系列不同羧基与氨基比的CDs;20ml水热反应釜置于马弗炉 中，反应温度为180_200°C,反应时间为4-10h;朽1檬酸与尿素的摩尔比为6 :1-O:1 ;所得 ⑶s溶液为金黄色液体。
4. 按照权利要求2所述碳基荧光探针的制备方法，其特征在于： 由于⑶s水溶性较好，而末端羧基的TPP易溶于乙醇，故选取1:10 -10 :1比例的乙醇/ 水反应体系，先期加入EDC/NHS活化溶于乙醇的40mgTPP的末端羧基，EDC，NHS，TPP的摩尔 比例为I:1.I:1. 2,然后加入5ml含有20-120mgCDs水溶液室温搅拌反应12-48h;0. 22um 水系膜过滤后用葡聚糖G-25凝胶分离柱分离提纯，去除未反应的原料，所得水溶液为黄色 液体。
【专利摘要】本发明公开了一种基于碳点（CDs）的新型活细胞线粒体探针的制备，首先以柠檬酸和尿素为原料水热法合成表面带有氨基的CDs，然后通过酰胺化反应接枝上末端带有羧基的三苯基膦（TPP）小分子，用水系膜和葡聚糖G-25凝胶柱分离纯化得到产物TPP-CDs。该线粒体探针制备方法简单，可大批量生产，且此线粒体探针具有较好的水溶性，光稳定性好，激发和发射光谱范围宽，解决了目前线粒体探针普遍水溶性差，易荧光淬灭的现状。此外，该线粒体探针细胞毒性低，生物友好，能成功应用于活细胞的线粒体成像。
【IPC分类】C09K11-06, G01N21-64
【公开号】CN104694116
【申请号】CN201310655434
【发明人】谭明乾, 王贝贝, 马小军
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月6日