一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品加工中天然色素的分离技术，具体是关于一种从腊八蒜中提取和 分离黄色素的方法。
【背景技术】
[0002] 中国传统蒜制品腊八蒜中的绿色素是天然的植物次生代谢产物。绿色素由紫外 吸收波长分别为590、440nm的蓝色素和黄色素构成。含色素的腊八蒜提取物具有抗氧化、 抑制HL-60人白血病细胞、BGC-823胃癌细胞、人乳腺癌细胞、人肝癌细胞Bel-7402和人前 列腺癌细胞PC-3M-1E8增值等作用，研宄表明蓝色素及黄色素粗提物都具有清除DPPH、超 氧阴离子和羟自由基等作用。可见腊八蒜色素作为天然食用色素，除了具有安全、无毒等特 性，还具有一定的功能性，因此从腊八蒜中分离出色素单体成分对食品、化妆品、医药领域 都具有重大的意义。
[0003] 对于腊八蒜色素的分离纯化，目前已有一些研宄，赵晓丹等建立了初步提取分离 大蒜绿变色素的方法：以柱层析为主要手段，选用CG-50树脂、SIPI-40树脂，硅胶等不同填 料对色素进行了分离和纯化，等到了蓝色素和黄色素的粗提物，但未能得到色素的纯品；其 他学者在此基础上，经高效液相进一步分离，得到最终产物为黄色素和与黄色素性质相似 物质的混合物，仍然未能获得单体色素；近年来有学者通过体外合成的方式合成了一系列 大蒜黄色素的类似物。然而直至目前为止，没有从腊八蒜中分离出天然的单一黄色素。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法，用于解决现有技术中无法 从腊八蒜中提取高纯度的单一黄色素成分的缺陷。
[0005] 本发明提供一种从腊八蒜中提取和分离黄色素的方法，包括如下步骤：
[0006] 1)米用pH值为2_4的酸性乙醇溶液对腊八蒜进行提取，制得提取液；
[0007] 2)采用有机溶剂对所述提取液进行萃取，收取萃取液，制得含有黄色素的第一粗 提物；
[0008] 3)采用大孔树脂对所述第一粗提物中的黄色素进行吸附，并对吸附后的大孔树脂 进行洗脱，收集洗脱液，制得第二粗提物；
[0009] 4)采用酸性溶液将所述第二粗提物制成第二粗提液后，用凝胶树脂柱进行凝胶层 析，收集440nm处的洗脱液，制得黄色素初品；其中，所述凝胶层析采用的洗脱液剂为酸性 溶液和有机溶剂的混合液，所述混合液中酸性溶液与有机溶剂的体积比为（2 :8)-(5 :5)， 所述酸性溶液为PH值2-4的水溶液，所述有机溶剂为乙醇、乙腈或正丁醇。
[0010] 进一步地，在上述步骤4)结束后，还包括下述步骤5):
[0011] 5)采用高效液相色谱对所述黄色素初品进行纯化，所述高效液相色谱采用C18色 谱柱，流动相A为0. 3-0. 6 %的甲酸水溶液，流动相B为0. 3-0. 6 %乙腈溶液，洗脱梯度为 0-3min 15% B，3-10min 20% B，收集最大吸收峰值处的洗脱液，并去除洗脱液中的有机溶 剂，制得黄色素终品。
[0012] 在本发明的制备中涉及的分离手段包括步骤3)的普通柱层析方法、步骤4)的等 度液相色谱分离方法以及步骤5)的梯度液相色谱分离方法，这三者的基本原理都是利用 不同物质在各种溶剂的溶解度不同，当需要获取某一混合物中的某单一成分时，先将该混 合物附着于某一具有吸附性的固定相（载体柱）上，通过选用合适的溶剂（称为淋洗剂或 洗脱剂，该溶剂对该单一成分的溶解性极佳，对其他成分溶解性较差）对附着有混合物的 固定相进行淋洗，混合物中在该洗脱剂中溶解性最好的物质会先通过载体柱流出，从而达 到分离的目的。因此，在分离过程中，分离条件（洗脱剂的种类以及流速选择等）的确定 对于分离效果有着至关重要的作用。其中，普通柱层析的载体柱是通过在玻璃柱内加填硅 胶等物质完成固定相制备后在进行相应的上样、淋洗操作，其中玻璃柱的长短粗细以及硅 胶量的选择根据待分离混合的量进行相应的选择，而等度以及梯度液相色谱采用色谱仪进 行，适合少量物质的高精度分离，其中梯度液相色谱的分离效果由于在分离过程中在不同 时间采用了不同比例的洗脱液，所以其分离效果优于等度液相色谱。
[0013] 本发明的分离方法中，所有的用于提取、溶解、淋洗的pH值为2-4的溶液，都是采 用甲酸、乙酸、三氟乙酸和磷酸中的一种或几种进行溶液pH值的调节。控制pH值在该范围 内，既能够最大限度的对腊八蒜中的黄色素进行有效地提取与溶解，又不会使黄色素分解 发生其他化学反应。
[0014] 本发明所采用的腊八蒜是经过一段时间腌制，蒜体已经明显呈现绿色的腊八 蒜，如果腌制时间过短蒜体还未呈现绿色，则蒜中的色素含量过低，还不适于黄色素的提 取。为了能够实现腊八蒜中黄色素的完全提取，一般在对腊八蒜进行提取前，还会对腊八 蒜进行破碎处理以增大提取溶剂的接触范围，一般破碎至40-80目即可。进一步地，在步 骤1)中，采用所述酸性乙醇溶液提取腊八蒜一次以上，并且控制所述酸性乙醇溶液中乙醇 的体积含量为50-90%，所述腊八蒜与所述酸性乙醇溶液的质量体积比为1:(1-8)，提取 温度为-4-25?，提取时间为12-24h。在提取过程中，为了提高提取率，可以采用转速为 800-100r/min的搅拌装置进行搅拌提取，每Ig腊八蒜采用I-Sml的酸性乙醇溶液进行提 取，同时步骤1)可以进行一次以上，提取后，将每次的提取物合并过滤，收集滤液，制得提 取液。
[0015] 进一步地，在步骤2)中，采用所述有机溶剂萃取所述提取液一次以上，并且控制 所述提取液与所述有机溶剂的体积比为1: (1-5)，萃取时间为2_6h ;其中，所述有机溶剂为 乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。提取液中含有大量的脂溶性杂质，这些杂质在酸水中的溶解性 好，因此采用萃取的方法将脂溶性杂质从提取液中分离出去。为了得到提高萃取的效率，该 操作可进行2-5次，将每次的萃取液，即有机相，进行合并，得到第一粗提物。
[0016] 第一粗提物中除了腊八蒜色素物质还含有一些糖类、氨基酸、蛋白质等大分子组 分，为了将这些大分子组分与腊八蒜色素物质分开，特此选择与大分子组分不亲和，却能 吸附腊八蒜物质的大孔树脂作为分离载体，从而进一步的通过淋洗洗脱，实现大分子组分 与腊八蒜色素物质的分离。进一步地，所述大孔树脂为XAD-7大孔树脂、AB-8大孔树脂或 YWD-Ol大孔树脂。
[0017] 进一步地，步骤3)包括对所述第一粗提物浓缩，并将浓缩物溶于双蒸水中，制得 第一粗提液，其中控制所述浓缩物与双蒸水的质量体积比为1 : (〇. 5-4);将所述第一粗提 液上装有所述大孔树脂的层析柱，采用pH值为2-4的水溶液以3-8mL/min的流速洗涤2-4 个柱体积，随后采用PH值为2-4的酸性乙醇进行洗脱，收集洗脱液，制得第二粗提物。具体 地，可以在35°C将第一粗提物进行浓缩直至有机溶剂全部去除得到浓缩物。为了提高产品 的纯度，可以将第一粗提物的浓缩物溶解于双蒸水中得到第一粗提液，双蒸水即为蒸馏过 两次水，水中的大部分盐类、氨类以及有机物已经被除去，因此有助于色素的提纯。
[0018] 在本发明的具体方案中，将第一粗提液进行柱层析处理，所用的大孔树脂的质量 以所需处理的样品质量决定，一般为30-40:1，即处理Ig样品，需要大孔树脂30-40g。上样 后，由于第一粗提液中的一些糖类、氨基酸、蛋白质等大分子组分与树脂不亲和不会被吸附 在大孔树脂中，因此先选用pH为2-4的水溶液作为洗涤剂，以流速为3-8ml/min对大孔树 脂柱洗涤，将这些大分子组分冲洗下来，当洗涤剂的体积为2-4倍的柱体积时，第一粗提物 中的大分子组分就会被完全除去，而第一粗提物中的色素成分不易被洗涤剂冲刷仍然被吸 附在大孔树脂中。此时，再采用pH值为2-4的酸性乙醇作为洗脱剂，以3-10ml/min的流速 对大孔树脂柱进行洗脱，由于色素成分易溶于该洗脱剂中，因此能够将吸附在大孔树脂中 的色素成分冲刷出来，对洗脱液进行收集，得到第二粗提物。同样的，洗脱剂的体积为2-4 倍的柱体积时，大孔树脂中的色素成分会被全部冲刷洗脱出来。其中，柱体积通过式（1)进 行计算，
[0019] V= π r2h 式（1)
[0020] 其中，r为载体柱的半径，h为载体柱内固定相（大孔树脂）的高度。
[0021 ] 此时，第二粗提物中含有黄色素、蓝色素以及其他酚酸类物质，为了得到成分单一 的黄色素，因此对第二粗提物进行步骤4)的等度色谱处理。具体的，等度色谱中的色谱柱 可选取凝胶树脂柱，进一步地，凝胶树脂柱中填装的凝胶树脂为SephadexG-25凝胶树脂、 Sephadex LH-20凝胶树脂、SephadexG-20凝胶树脂或SephadexG-15凝胶树脂。
[0022] 进一步地，步骤4)中，在将所述第二粗提物制成第二粗提液之前，先对所述第二 粗提物进行浓缩，并将浓缩物溶于所述酸性溶液中，制得第二粗提液，其中控制所述浓缩物 与酸性溶液的质量体积比为1 : (〇. 5-3)，并且控制第二粗提液的进样量为2-6mL，所述洗脱 液的流速为l_4mL/min。具体的，在进行凝胶树脂分离前，将收集到的第二粗提物在35°C进 行浓缩处理，制得第二粗提物的浓缩物。将该浓缩物溶解在pH值2-4的水溶液中得到第二 粗提液，以2-6mL的进样量注入凝胶柱中，以洗脱剂进行洗脱，控制洗脱剂的流速为l-4ml/ min。该步洗脱正是进行黄色素与其他色素，例如蓝色素和酚酸类物质的分离，因此，洗脱剂 对于分离效果至关重要。该步骤的洗脱剂为酸性溶液和有机溶剂的混合液，所述混合液中