免洗型近红外溶酶体探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种溶酶体靶向的荧光探针的合成及应用，尤其涉及一种含有孔雀绿 陀螺型分子类探针对溶酶体内粘度敏感而荧光激活原理的荧光探针的应该用，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 溶酶体是真核细胞中由单层膜结构围绕起来的一种细胞器，内部呈酸性，pH处于 4. 0-6. 0之间，包含大约50种不同的降解酶，因此，溶酶体被称作为细胞的回收利用中心。 正常情况之下，溶酶体可以将衰老的细胞碎片以及无用的生物大分子分解为可供细胞利用 的生物小分子，供细胞进行重新利用。然而，当溶酶体某种酶缺失或功能紊乱的情况下，导 致大分子无法分解而聚集在溶酶体中，使溶酶体粘度升高，发生功能性障碍。因此，溶酶体 的粘度是紧随其内部大分子数量和密度的变化而变化的，能够实时的反映其动力学变化， 而且反映其基本的生物学和与溶酶体相关的功能性状态。另外，溶酶体还与细胞的很多生 理学过程相关，比如，新陈代谢、细胞内运输、细胞膜的循环等。然而，溶酶体的众多功能的 变化往往导致不同的生理学病变过程，特别是与癌症相关的疾病。因此，发展一种溶酶体可 视化的方法就显得尤为重要。
[0003] 化学发光传感器在活细胞器官组织分析荧光造影中已经得到了广泛的应用，其发 射信号具有快速、细胞组织的伤害性小、选择性和灵敏度都较高等优点。另外，市场上缺乏 一种针对细胞器具有特异性定位的靶向物质，要达到对某种细胞器特异性的定位往往非常 困难，目前针对于溶酶体特异性定位的探针，往往聚焦于其酸性的内部环境，包括商业化的 Lysosensor探针，都是弱碱性的，探针可以在酸性环境中质子化而选择性聚集。如大连理 工大学肖义等发展的溶酶体探针，将吗啡林与陀螺型BODIYP相连，并且通过光致电荷转移 作用（PET)效应将BODIPY荧光淬灭，探针可以利用弱碱性的吗啡林特异性的聚集于溶酶体 内，其陀螺型BODIPY荧光寿命仅随粘度的变化而变化，并测得溶酶体粘度为50-90cP，而吗 啡林基团在溶酶体中质子化，这样的质子使PET淬灭的荧光基团淬灭因子丧失淬灭作用 而达到荧光团恢复荧光的作用，同时达到对溶酶体进行荧光失踪的作用。然而，这种溶酶体 定位探针在溶酶体中显现出碱性，在与这种探针长时间孵育过程当中，溶酶体内pH值会不 断升高，另外，由于PET效应不能够对荧光团的荧光进行完全的淬灭，因此，这些探针常常 在细胞中表现出高的非特异性本底荧光。再者传统的荧光探针又存在发射波长较短、组织 穿透力弱、易受生物自发光干扰、对细胞光毒性大、光稳定性差等缺点，因此，急需发展一种 特异性好、稳定性好、长波长发射的溶酶体定位的荧光探针。
[0004] 孔雀绿是一种三苯甲烷类染料，它具有水溶性好、摩尔消光系数大、光稳定性好、 没有背景荧光等诸多优点，并且，孔雀绿便于修饰，可以对其进行各种衍生化以满足不同方 面的需求。孔雀绿类染料是一种典型的陀螺型分子，在低粘度下分子收激发光照射，基态电 子跃迀至激发态，激发态分子发生分子内部结构扭曲而将激发态能量消耗，这样分子就不 表现出荧光性质，而在高粘度条件下，激发态分子扭曲受限，分子吸收的能量主要以荧光发 射的形式表现出来，达到荧光激活的目的。并且，孔雀绿具有苯胺类弱碱性基团，可以选择 性聚集于溶酶体内，并且，随溶酶体的粘度变化荧光强度发生变化。因此设计合成了新型孔 雀绿型溶酶体长波长荧光探针。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种免洗型近红外溶酶体探针，具体为孔雀绿类粘度 激活型荧光探针，可以特异性的定位于溶酶体中，不受酸性环境干扰，对溶酶体粘度具有荧 光响应；
[0006] 本发明的另一目在于提供了所述荧光探针的合成及其在检测活细胞溶酶体方面 的应用。
[0007] 一种免洗型近红外溶酶体探针，其结构如式I所示：
[0008]
【主权项】
1. 一种免洗型近红外溶酶体探针，其结构如图I所示：
2. 根据权利要求1所述的一种免洗型近红外溶酶体探针，其特征在于，按下述步骤合 成： 对羟基苯甲醛与4-溴丁酸乙酯在丙酮中以碳酸钾为缚酸剂合成取代醛，取代醛与 N，N-二甲基苯胺在乙醇中以ZnCl2S催化剂合成丁酸乙酯修饰的孔雀石，孔雀石在丙 酮中以氢氧化钾溶液为催化剂水解丁酸乙酯，丁酸衍生孔雀石在乙酸乙酯中以2, 3-二 氯-5, 6-二氰对苯醌为氧化剂氧化孔雀绿类溶酶体靶向荧光探针。
3. 权利要求1所述的一种免洗型近红外溶酶体探针作为活细胞内近红外溶酶体荧光 探针的应用。
4. 权利要求1所述的一种免洗型近红外溶酶体探针作为活细胞内近红外溶酶体荧光 探针的应用，其特征在于，所述活细胞为Hela细胞。
【专利摘要】本发明涉及一种免洗型近红外溶酶体探针的合成及应用，属于生物技术领域。上述孔雀绿类溶酶体靶向荧光探针的合成方法是：有对羟基苯甲醛与4-溴丁酸乙酯在丙酮中以碳酸钾为缚酸剂合成取代醛，取代醛与N,N-二甲基苯胺在乙醇中以ZnCl2为催化剂合成丁酸乙酯修饰的孔雀石，孔雀石在丙酮中以氢氧化钾溶液为催化剂水解丁酸乙酯，丁酸衍生孔雀石在乙酸乙酯中以2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌为氧化剂氧化孔雀绿类溶酶体靶向荧光探针。细胞内实验证实：本发明所述孔雀绿陀螺型类近红外靶向溶酶体探针具有很好的透膜性，可以特异性的在溶酶体激活，在溶酶体外部没有荧光，达到了免洗型溶酶体标记的目的。
【IPC分类】C09K11-06, C07D295-096, G01N21-64, C12Q1-02
【公开号】CN104877668
【申请号】CN201510161497
【发明人】朱麟勇, 张大生, 夏亮, 林秋宁, 包春燕
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月7日