复合荧光微纳米体系及其基于一锅煮法的制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及荧光微纳米材料，具体是在复合荧光微纳米体系及其基于一锅煮法的制备工艺。
【背景技术】
[0002]荧光成像作为一种常见的成像技术，以其直观、原位的可视化检测手段在生物检测识别、医学影像等领域得到了广泛应用。基于荧光信号重建的荧光成像技术具有多个独特优势，如样品穿透性强、极高的灵敏度和选择性，显示了较好的应用前景。荧光成像探针在化学、生物及医学等领域广泛应用，但传统有机染料小分子存在一些难以克服的缺陷，如:性质不稳定，容易被光漂白，不能长期使用；有机染料不适合多色成像，只能被特定的波长激发，需要多个激发光源才能实现同时多色显示；激发和发射波长不够稳定，容易随周围环境(如PH、温度等)而变化；有机荧光染料的激发和发射光谱之间的斯托克斯位移较小，使其在动物活体荧光成像时易受到激发光及来自动物自身的背景的干扰。此外，有机荧光染料的生物安全性问题也局限了其在生物体内的应用。
[0003]近年来随着纳米技术的不断发展，将灵敏度高的荧光分子与纳米技术相结合，发展制备包载荧光分子的具有微纳米结构的复合体系，将为克服上述问题提供新的策略。以往文献报道的微纳米体系多采用磷脂，白蛋白，糖类等作为基质材料，构建策略也以层层叠加、水-油-水、油_水-油微乳等方法为主，存在步骤复杂、体系稳定性差等不足。而米用高聚物作为基质材料虽然可以提高其稳定性，但合成工艺复杂、产率较低，且多采用有毒、污染的有机溶剂作为介质，所得到的聚合物体内生物安全性尚无法评价。因此选择理想的基质材料、发展绿色、高效的构建与制备工艺尤其重要。
[0004]聚丙烯酸丁酯是经FDA认证的生物医学材料，在医学、制药等领域内广泛应用，常被用作制备医药中间体、临床止血剂等。基于其良好的生物相容性和体内可降解性，开发新型包载荧光分子的复合微纳米体系对发展新型生物探针、医用造影剂、拓展荧光造影剂的制备工艺、提高荧光微纳米探针的生物利用率、为荧光成像在生物医学领域的广泛适用具有推动作用。同时，由于某些抗癌药物分子本身具有荧光特性，发展包载抗癌药物分子的微纳米体系对于实现药物在病灶区域的高特异性靶向与释放，进而实施疾病的早期诊断与治疗具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种复合荧光微纳米体系，该复合荧光微纳米体系具有良好的生物相容性和稳定性，所包载物质兼具荧光成像与治疗功能，有望在体内标记与示踪、生物医学影像、靶向诊疗一体化、药物筛选与优化等领域得到更广泛的应用，在生命健康与个性化医疗等方面产生良好的经济与社会效益。
[0006]本发明的第二个目的是提供一种选择性构建上述复合荧光微纳米体系一锅煮的制备工艺，该制备工艺步骤简单、条件温和、工艺绿色环保、能耗少、无三废及辐射与噪声等污染，分离与提纯工艺操作简便，所得体系稳定易于保存，是一种选择性制备复合荧光微纳米体系的通用工艺。
[0007]为实现本发明的第一个目的，本发明的技术方案是该复合荧光微纳米体系结构为以聚丙烯酸丁酯为构建基质，包载组分为罗丹明、香豆素6、尼罗红、喜树碱、阿霉素中的一种或多种组合。
[0008]进一步设置是以聚丙烯酸丁酯为构建基质，包载组分为罗丹明，该包载罗丹明的复合焚光微纳米体系粒子直径为1.60±0.16微米，电位为-46.76 ±6.96晕伏；或者该包载罗丹明的复合荧光微纳米体系粒子直径为252.8±46.2纳米，电位为-39.54±4.14毫伏。
[0009]进一步设置是以聚丙烯酸丁酯为构建基质，包载组分为香豆素6，该包载香豆素6的复合荧光微纳米体系粒子直径为4.17±0.96微米，电位为-53.55±4.01毫伏；或者该包载香豆素6的复合荧光微纳米体系粒子直径为979.2 ±31.6纳米，电位为-31.70 ± 1.80毫伏。
[0010]进一步设置是以聚丙烯酸丁酯为构建基质，包载组分为尼罗红，该包载尼罗红的复合荧光微纳米体系粒子直径为2.43±0.11微米，电位为-32.16±1.36毫伏，或者该包载尼罗红的复合荧光微纳米体系的粒子直径为713.7± 14.1纳米，电位为-34.92±0.84毫伏。
[0011]进一步设置是以聚丙烯酸丁酯为构建基质，包载组分为喜树碱，该包载喜树碱的复合荧光微纳米体系粒子直径为269.5 ±3.5纳米，电位为-43.58 ± 1.97毫伏。
[0012]进一步设置是以聚丙烯酸丁酯为构建基质，包载组分为阿霉素，该包载阿霉素的复合荧光微纳米体系粒子直径为1.71 ±0.14微米，电位为-63.21 ± 1.96毫伏，或者该包载阿霉素的复合荧光微纳米体系粒子直径为283.4±2.4纳米，电位为-24.73±12.12毫伏。
[0013]为实现本发明的第二个目的，本发明的技术方案包括以下步骤:
a.将1.5毫升丙烯酸丁酯单体与0.01-0.03毫摩尔荧光物质按比例投料于含有稳定剂的反应体系；所述荧光物质为丙罗丹明、香豆素6、尼罗红、喜树碱，阿霉素中的一种或多种组合。
[0014]b.将反应体系酸碱度调至1.5-3.0，常温搅拌1-16小时后加入氢氧化钠稀溶液终止反应;
c.反应体系静置4-7小时后，将反应液转移至离心管中分离提纯；
d.弃去不含微纳米体系的清液，以稳定剂溶液洗涤、涡旋振荡数次，至少重复离心步骤
2-4 次；
e.离心浓集后得复合荧光微纳米体系。
[0015]本发明所述新型复合荧光微纳米体系及一锅煮法选择性构建方法对发展新型生物探针、拓展荧光造影剂的制备工艺、提高荧光微纳米探针的生物利用率、实现荧光治疗药物的靶向与释放及疾病的早期诊断与治疗具有重要意义。
[0016]本发明得到包载罗丹明、香豆素6、尼罗红、喜树碱、阿霉素的多种复合荧光微纳米体系，其通用结构与工艺、样品实例如图1、2所示。体系粒度分布、表面电位表征及多分布指数可由激光粒度仪测量得到(如图3)。包载罗丹明的复合荧光微纳米体系可用于裸鼠皮下注射的荧光标记与示踪，其二维荧光成像效果如图4得到确认。包载阿霉素的复合荧光微纳米体系可用于细胞层面的标记与示踪，将其与HeLa细胞共培养，在倒置荧光显微镜下可清晰观察到细胞标记图像(如图5)，从而确认该复合荧光微纳米体系在细胞标记与示踪、荧光治疗药物的靶向与释放及疾病的诊疗一体化等方面的广阔应用前景。
[0017]下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做进一步介绍。
【附图说明】
[0018]图1本发明所涉及的复合荧光微纳米体系的通用结构与工艺；
图2新型复合荧光微纳米体系样品图(从左向右依次为包载罗丹明、香豆素6、尼罗红、喜树碱、阿霉素的复合荧光微纳米体系，对应实施例1-9);
图3新型复合荧光微纳米体系的粒度分布与电位表征图(a-1分别为包载罗丹明、香豆素6、尼罗红、喜树碱、阿霉素的复合荧光微纳米体系，对应实施例1-9)；
图4包载罗丹明的复合荧光微纳米体系用于裸鼠皮下注射的荧光成像图；
图5包载阿霉素的复合荧光微纳米体系用于HeLa细胞标记示意图(左图为明场图像，右图为荧光图像)。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
[0021]本发明所米用的制备原料均为商品获得。
[0022]实施例1:将丙烯酸丁酯(1.5毫升)、聚乙二醇辛基苯基醚水溶液(250毫升)、罗丹明(9.6毫克)投料入500毫升烧杯，反应体系酸碱度调节至2.5。常温下高速搅拌I小时后加入氢氧化钠稀溶液终止反应。反应体系转移至分液漏斗静置6小时，弃去底层反应残留物。将反应液转移至离心管中纯化离心20分钟，小心收集顶层产物层，并以聚乙二醇辛基苯基醚溶液清洗。至少重复以上步骤2-4次，浓集后重新分散到聚乙二醇辛基苯基醚溶液中，并于室温下保存。经激光粒度仪测量，包载罗丹明的复合荧光微纳米体系粒径为
1.60±0.16微米，表面电位为-46.76±6.96晕伏，由倒置焚光显微镜可观察其形貌，并确认罗丹明的包载效果。将该复合荧光微纳米体系用于裸鼠皮下注射，可清晰观察到注射前后与注射过程中裸鼠皮下的荧光成像图(如图4)。
[0023]实施例2:将丙烯酸丁酯(1.5毫升)、葡聚糖水溶液(100毫升)、罗丹明(9.6毫克)投料入250毫升烧杯，反应体系酸碱度调节至2.5。常温下磁力搅拌4小时后加入氢氧化钠稀溶液终止反应。反应体系静置6小时，然后将全部反应液转移至离心管中离心30分钟，弃去上层清液，并以高纯水洗涤、涡旋振荡数次。至少重复离心步骤2-4次，浓集后得包载罗丹明的复合荧光微纳米体系，可真空冻干或重新在高纯水中分散保存。经激光粒度仪测量，包载罗丹明的复合荧光微纳米体系粒径为252.8 ± 46.2纳米，表面电位为-39.54 ±