一种水不溶性天然黑色素的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于黑色素提取分离和加工技术领域，适用于植物源、微生物源和大部分动物源水不溶性黑色素的生产与加工，特别适合于水不溶性黑色素的制备方法。
【背景技术】
[0002]黑色素(melanin)是一类结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素家族的总称。在自然界中，广泛存在于生物圈、岩石圈、水圈、大气圈以及宇宙星际。在生物圈中，黑色素在动物、高等植物和微生物体内都有分布，但并不是黑颜色的色素，也有红、橙、黄、绿、蓝等颜色的黑色素存在。由于现今的生物化学和生物物理学等技术无法对这类生物大分子提供一个化学结构式，因此黑色素尚无一个严格的定义。黑色素按颜料来定义的化学标准包括黑色，通常不溶于水和常见的有机溶剂，可被氧化剂漂白以及阻抗浓酸降解；按高分子定义的另一个标准是它们的自由基特性。
[0003]黑色素通常为无定型非均匀性的大分子物质，其组成不仅与单体单元有关，而且还与聚合过程中的环境条件有关。按照意大利化学家Nicolaus的观点，可将黑色素分成真黑色素、棕黑色素和异黑色素三类:(I)真黑色素(eumelanins):主要呈黑色或棕色的含氮色素，不含硫原子；(2)棕黑色素(phaeomelanins):颜色较真黑色素浅，含氮和硫原子，常呈棕色、红色甚至黄色；(3)异黑色素(allomelanins)，常呈黑色或棕色，主要存在于植物和微生物中。然而，无论何种黑色素，其在水、有机和无机溶剂中溶解度差，甚至不溶，但都一般溶于稀碱溶液，有较强的氧化还原、光吸收、螯合金属离子、离子交换、自由基(清除或产生)、光电导性、导电性和半导体性质等特性，因此，除了作为色素外，其本身还具有多种生物功能，如:为生物体提供结构性强度；抗辐射；对光受体产生屏蔽，且具有维持体温平衡的作用；作为化学保护色素行使功能，保护生物体免受抗生素或其他药物以及重金属等有毒物质的伤害；可对能量进行吸收、保持、储存和转换；可作为伪装或性展示的装饰，并改善视觉效果，还是性成熟信号和引诱物。
[0004]基于其特殊性质，黑色素有着重要的应用价值。在医药领域，黑色素可用于抗病毒；抑制HIV病毒；治疗着色性干皮病、帕金森氏症、老年痴呆症、亨延氏舞蹈病等神经系统疾病；可提高抗辐射能力，减少皮肤癌的发生；可抗毒解毒，如毒蛇咬伤急救；有效降低肼及其衍生物对肝脏的损伤和化疗药物顺钼对肾脏的毒害；有效降低或防止止痛药醋氨酚(acetaminophen)的毒性；有效预防“世纪之毒”戴奥辛(D1xins)对肝脏、胸腺及脾脏的伤害；可提高免疫力；可用作磁共振成像造影剂；可作为抗癌药物和癌症的光动力学治疗。在农业领域，黑色素可用于某些紫外线敏感的生物体的保护剂，如可作为占据生物农药90%市场份额的苏云金芽孢杆菌杀虫制剂的保护剂；在畜牧兽医方面用于抗痢疾治疗和胁迫-保护治疗；作为特种塑料和特种玻璃的着色剂；可除去来自于被污染水体和土壤中的酚类污染物和重金属。在工业领域，黑色素具有很强的金属螯合特性，在工业方面可用于提取贵重金属。在化妆品领域，黑色素已被广泛应用于化妆品的生产，开发出的产品主要有睫毛膏、眼线笔、防晒霜、洗发剂、染发剂、白癫风遮蔽剂等。在其他方面，黑色素具有明显的光电导性和很高的电传导能力，还是生物体内唯一的一类无定形的半导体物质，在生物电子领域有着很大的开发利用价值；与很多疾病有关，对病理学研究也有着重要的意义。
[0005]综上所述，黑色素是一种具有广阔应用前景的潜在生物资源，将其充分开发，市场推广前景十分广阔。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种利用动物、植物和微生物等生物资源提取水不溶性黑色素的方法。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]I)选取干燥、无霉变且具有黑色种皮的葵花籽，剥取向日葵籽壳，粉碎成20?60目；
[0009]2)将其与0.1?2.0moI/L NaOH按重量体积比为1:10?1:20混合，40?80°C水浴中2?10h，冷却至10?30°C，5000?20000rpm离心10?30min，上清液为黑色素粗提液；
[0010]3)用1.0?5.0mo/L HCl调节步骤2)中的黑色素粗提液pH值介于1.0?3.0之间，黑色素沉淀，室温静置2.0?6.0h，离心分离，所得沉淀为黑色素粗提物；
[0011]4)将步骤3)获得的黑色素粗提物悬浮于重量体积比为1:10?1:15的5.0?7.0moI/L HCl中，沸水浴2.0?6.0h，冷却，5000?20000rpm离心10?30min，去除上清液，收集沉淀的黑色素固体颗粒；
[0012]5)将步骤4)中获得固体颗粒按顺序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤。每次黑色素颗粒与溶剂的重量体积比为1:10?1:30，混合，振荡，离心分离，每种溶剂重复洗涤直至上清液无色为止；
[0013]6)经过步骤5)洗涤后的黑色素颗粒用0.01?0.2mol/L10?50ml NaOH重新溶解，离心除去未溶解部分，然后用0.1?1.0mol/L HCl调节pH值介于1.0?3.0之间，静置2h?过夜，5000?20000rpm离心10?30min，取沉淀；
[0014]7)取步骤6)中产生的沉淀用双蒸水重新悬浮，之后用0.1?2mol/L NaOH调节沉淀物水溶液至PH值介于10?12.0，黑色素溶解，离心，取上清液用0.1?2.0moI/L调节PH值介于1.0?3.0之间，使黑色素沉淀，去除上清液；
[0015]8)反复步骤7)，直至上清液为无色，即获得纯化的黑色素。
[0016]本发明具有以下的技术效果:
[0017]1.本发明方法提取的黑色素收率高，最高达10.00%以上；
[0018]2.采用超声波或者微波辅助提取，能破坏提取原料细胞膜，使溶液能快速渗透到细胞中，加速有效成分的浸出，降低碱性溶液用量，极大地加大了收率，具有时间短，提取率闻;
[0019]3.利用本法可实现高纯度水不溶性黑色素的提取，可操作性强，成本低，可实现规模性提取，使向日葵籽壳中的黑色素能够充分开发利用，提升其经济价值；
[0020]4.采用碱提酸沉法得到的最终产物具有选择性高，无污染，工艺重复性高等优点。
具体实施方案
[0021]实施例1
[0022]I)选取干燥、无霉变且具有黑色种皮的葵花籽壳，剥取葵花籽壳，粉碎成60目；
[0023]2)将其与0.5mol/L NaOH按重量体积比为1:15 (g/ml)混合，70°C水浴2h，冷却至室温，20000rpm离心20min，上清液为黑色素粗提液；
[0024]3)用lmo/L HCl调节步骤2)中的黑色素粗提液pH值为2.0，黑色素沉淀，室温静置2h，离心分离，所得沉淀为黑色素粗提物；
[0025]4)将步骤3)获得的黑色素粗提物悬浮于重量体积比为1:10 (g/ml)的6mol/L HCl中，沸水浴2h，冷却至室温，1000rpm离心30min，去除上清液，收集沉淀的黑色素固体颗粒;
[0026]5)将步骤4)中获得固体颗粒按顺序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤。每次黑色素颗粒与溶剂的重量体积比为1:10 (g/ml)混合，振荡，离心分离，每种溶剂重复洗涤3?5次，直至上清液无色为止；
[0027]6)经过步骤5)洗涤后的黑色素颗粒用20ml0.lmol/L NaOH重新溶解，离心除去未溶解部分，然后用lmol/L HCl调节pH值为2.0，静置4.0h, 20000rpm离心20min,取沉淀；
[0028]7)取步骤6)中产生的沉淀用20ml双蒸水重新悬浮，之后用lmol/L NaOH调节沉淀物水溶液至PH值为11.0,黑色素溶解，离心，取上清液用lmol/L HCl调节pH值为2.0，使黑色素沉淀，去除上清液；
[0029]8)反复步骤7)3?5次，直至上清液为无色，即获得纯化的黑色素，得率为7.03%。
[0030]实施例2
[0031]I)选取干燥、无霉变且具有黑色种皮的葵花籽壳，剥取葵花籽壳，粉碎成60目；
[0032]2)将其与0.lmol/L NaOH按重量体积比为1:15 (g/ml)混合，60°C水浴3h，冷却至室温，1000rpm离心30min，上清液为黑色素粗提液；
[0033]3)用lmo/L HCl调节步骤2)中的黑色素粗提液pH值为2.0，黑色素沉淀，室温静置2h，离心分离，所得沉淀为黑色素粗提物；
[0034]4)将步骤3)获得的黑色素粗提物悬浮于重量体积比为1:15 (g/ml)的6mol/L HCl中，沸水浴2h，冷却至室温，1000rpm离心30min，去除上清液，收集沉淀的黑色素固体颗粒;
[0035]5)将步骤4)中获得固体颗粒按顺序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤。每次黑色素颗粒与溶剂的重量体积比为1:15 (g/ml)混合，振荡，离心分离，每种溶剂重复洗涤3?5次，直至上清液无色为止；
[0036]6)经过步骤5)洗涤后的黑色素颗粒用15ml0.lmol/L NaOH重新溶解，离心除去未溶解部分，然后用lmol/L HCl调节pH值为2.0，静置2.0h, 20000rpm离心20min,取沉淀；
[0037]7)取步骤6)中产生的沉淀用15ml双蒸水重新悬浮，之后用lmol/L NaOH调节沉淀物水溶液至PH值为11.0,黑色素溶解，离心，取上清液用lmol/L调节pH值为2.0,使黑色素沉淀，去除上清液。
[0038]8)反复步骤7)3?5次，直至上清液为无色，即获得纯化的黑色素，得率为
6.06%ο
[0039]实施例3
[0040]I)选取干燥、无霉变且具有黑色种皮的葵花籽壳，剥取葵花籽壳，粉碎成40目；[0041 ] 2)将其与0.3mol/L NaOH溶液按重量体积比为1:20 (g/ml)混合，60°C水浴2h，冷却至室温，1000rpm离心20min，上清液为黑色素粗提液；
[0042]3)用lmo/L HCl调节步骤2)中的黑色素粗提液pH值为2.5，黑色素沉淀，室温静置6h，离心分离，所得沉淀为黑色素粗提物；
[0043]4)将步骤3)获得的黑色素粗提物悬浮于重量体积比为1:10 (g/ml)的6mol/L HCl中，沸水浴2h，冷却至室温，1000rpm离心lOmin，去除上清液，收集沉淀的黑色素固体颗粒;
[0044]5)将步骤4)中获得固体颗粒按顺序用95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗涤。每次黑色素颗粒与溶剂的重量体积比为1:10 (g/ml)混合，振荡，离心分离，每种溶剂重复洗涤3?5次，直至上清液无色为止；
[0045]6)经过步骤5)洗涤后的黑色素颗粒用1ml0.lmol/L NaOH重新溶解，离心除去未溶解部分，然后用lmol/L HCl调节pH值为2.0，静置2.0h, 20000rpm离心20min,取沉淀；
[0046]7)取步骤6)中产生的沉淀1ml用双蒸水重新悬浮,之后用lmol/L NaOH调节沉淀物水溶液至PH值为11.0,黑色素溶解，离心，取上清液用lmol/L溶液调节pH值为2.0，使黑色素沉淀，去除上清液；
[0047]8)反复步骤7)3?5次，直至上清液为无色，即获得纯化的黑色素，得率为
5.99%。
[0048]实施例4
[0049]I)选取干燥、无霉变且具有黑色种皮的葵花籽壳，剥取葵花籽壳，粉碎成60目；
[0050]2)将其与0.3mol/L NaOH按重量体积比为1:15 (g/ml)混合