-肾上腺素能受体近红外荧光配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及一类环境敏感型的a 肾上腺素能受体近红 外荧光探针以及其在α /皆上腺素受体细胞成像、亚细胞定位和表达水平检测等药理学和 生理学研究中的应用。
【背景技术】
[0002] 具有7次跨膜结构的G-蛋白偶联受体，是最大的细胞表面受体家族，其编码基因 约占人类蛋白编码基因组的4%[211&1^，1?.;父16，父.1'0018；1^016?01?(11'1^(118(30￥6^.厶(^已 Pharmacol. Sin. 2012, 33, 372-84.]。作为一种多功能的分子机器，G-蛋白偶联受体调节 着由激素和神经递质介导的大多数生理反应，是将近26%上市处方药物的作用靶点。尽 管G-蛋白偶联受体的化学与结构生物学研究取得了可喜的进展，但是由于动态受体的构 象多样性，其药理学及其生理学研究仍存在着很大的挑战[Granier, S.，Kobilka, B. A new era of GPCR structural and chemical biology. Nat. Chem. Biol. 2012, 8, 670-673.]。 为了开发出用作受体研究的有效工具，荧光标记的药物分子，即小分子荧光配体越来与受 到药物学家的关注。过去的几十年里，大量的G-蛋白偶联受体的小分子荧光配体被相继 报道出来，而且已经广泛地应用于细胞水平的受体可视化和药理学研究[Ma，Z. ;Du，L.; Li, M. Toward fluorescent probes for G-protei-coupled peceptors (GPCRs). J. Med. Chem. 2014,57,8187-8203.]。然而，这些小分子荧光配体仍然存在的局限。一方面大多数 已报道的荧光配体的荧光波长较短，常与细胞或组织本身的自发荧光产生干扰，而且这些 短波的光穿透力弱，无法有效的透过深层组织，限制了其广泛应用。另一方面，传统的荧光 配体缺乏一种有效的荧光开关机制，从而产生较强的非特异性结合信号，导致信噪比较差。
[0003] 肾上腺素能受体是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，隶属于G-蛋白偶联家 族，分为α和β两种亚型，是交感神经系统反应的重要介质。Ci1-肾上腺素能受体包含 三种亚型：α η、α 1Β和 a 1D[Zhong, H. ；Minneman, K. P. Alphal-adrenoceptor subtypes. Eur. J. Pharmacol. 1999, 375, 261-276]，主要调节平滑肌收缩、心肌收缩和肝脏葡萄糖代 谢。研究表明，Ct1-肾上腺素能受体是治疗良性前列腺增生（BPH)和高血压的药理靶点 [Rosini, M. ；Bolognesi, M. L. ；Giardina, D. ；Minarini, A. ；Tumiatti, V. ；Melchiorre, C. Recent advances inalpha1-adrenoreceptor antagonists as pharmacological tools and therapeutic agents. Curr. Top. Med. Chem. 2007, 7, 147-162]。此外，研究还发现， a f肾上腺素能受体在前列腺肿瘤组织中高度表达，其拮抗剂对雄激素依赖和非依赖前列 腺癌细胞都有促凋亡作用。a i-肾上腺素能受体的不正常表达及分布于许多生理疾病息息 相关，例如高血压、前列腺肥大、前列腺癌等。
[0004] 相比于肾上腺素能受体家族的其他成员如β受体，a i-肾上腺素能受体的药理学 和生理学特征研究相对滞后。目前运用药理学手段研究Ci1-肾上腺素能受体具有一定的 难度，这是因为a f肾上腺素能受体拮抗剂虽然在活性上较以前有了很大的改善，但在组 织选择性方面仍有待进一步优化；另一方面，a f肾上腺素能受体的三维晶体结构尚未解 析，很难从基于分子水平对这些实验现象进行解释。因此开发出高灵敏的Ci1-肾上腺素能 受体的小分子荧光配体显得尤为重要。虽然近几年有不少Ct1-肾上腺素能受体荧光探针 相继问世，但他们都存在着上述传统荧光探针的缺点，即波长短且缺乏荧光开关机制。这些 缺点大大限制了这些荧光探针的应用。
[0005] 为寻找更为灵敏、高效的荧光探针，Cy系列荧光染料越来越受到研究人员的青睐。 Cy荧光染料可以发近红外的荧光，并具有一定环境敏感的性质，已广泛地应用在生物大分 子，尤其是DNA的荧光检测中。但是其在蛋白质的细胞荧光成像中的应用较少。在初期的 研究中发现，Cy5荧光染料（化合物C1，实例一）可以使多种细胞明显着色，但是这种着色 没有任何选择性（附图5)。如何化学修饰和连接Cy荧光染料，使得其荧光标记具有高度的 选择性，也是科研人员亟待解决的难题。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，在已有的工作基础上，本发明把a f肾上腺素能受体特异 性识别基团与Cy5荧光团进行连接，将荧光开关机制引入探针，使荧光性质得到有效的管 理，构建出针对a f肾上腺素能受体的高灵敏小分子近红外荧光配体，并以此探针分子作 为工具药用于a i-肾上腺素能受体的生物学和生理学特征的体内和体外研究，为a i-肾上 腺素能受体的研究提供更方便、更有效、全新的研究手段；具体为：本发明提供近红外的具 有环境敏感荧光性质的a f肾上腺素能受体小分子荧光配体及其制备方法、光学性质、生 物活性、和受体药理特征研究中的应用。该小分子荧光配体对Ct1-肾上腺素能受体具有高 选择性和高灵敏度，可以作为工具药去研究a f肾上腺素能受体的生物学和生理学特征。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] -种环境敏感型的a i-肾上腺素能受体近红外荧光配体，具有下述结构通式： (I)0
[0010] 式中：&为6, 7-二甲氧基-2-(哌嗪-1-基）喹唑啉-4-氨，或1-(2-甲氧苯基） 哌嗪；X1为含或不含三唑环的长链连接基团；r2为不同取代基；χ2为卤素离子。
[0011] 优选的，叫为1~6 32为碘或溴离子。
[0012] 更为优选的，Ii1等于1 $2为甲基；X为碘离子。
[0013] 更优选的，是下述化合物：
[0014]
[0015] 本发明所述化合物可用作a i-肾上腺素能受体的小分子荧光探针；
[0016] 本发明所述化合物可用作与a f肾上腺素能受体相关疾病的诊断和/检测；优选 的，疾病为高血压、前列腺肥大、前列腺癌。
[0017] 本发明所述化合物可用于筛选a f肾上腺素能受体相关疾病的药物；优选的，所 述药物为a f肾上腺素能受体拮抗剂或激动剂。
[0018] 本发明所述化合物可用于a i-肾上腺素能受体的细胞成像和/或流式检测，在 此需要说明，所述应用方法不属于疾病的诊疗方法，首先，细胞成像和/或流式检测可用于 a f肾上腺素能受体拮抗剂或激动剂的筛选过程中；其次，用于生物体细胞时，所述细胞成 像和/或流式检测的结果，无法直接说明机体是否患a i-肾上腺素能受体相关疾病，其作 为中间结果，需要进一步的与正常细胞比对并进一步的诊断才能确定生物体是否患病。
[0019] 有益结果：
[0020] (1)本发明探针分子的荧光性质随着周围环境的改变而发生变化，尤其是其荧光 会因周围环境的极性减小或者黏度增大而显著增强；
[0021] (2)当探针与a f肾上腺素能受体结合时荧光会大大增强，可以很容易地实现受 体蛋白的可视化，提高了信噪比，避免了繁琐的洗涤步骤；
[0022] (3)本发明所述探针的荧光的波长可调范围大，可进入近红外区，能够有效的避开 生物体系的自发荧光，从而极大提供了探针的灵敏性，避免干扰；
[0023] (4)本发明所述探针在兼顾灵敏性的同时，显示出与a i-肾上腺素能受体极高的 亲和力，对Ci1-肾上腺素能受体特异性较高，以该类荧光配体作为工具药实现了 Ci1-肾上 腺素能受体细胞成像、亚细胞和细胞表达水平检测等受体药理学和生理学特征的研究。
【附图说明】
[0024] 图I. PTC-I在不同溶剂（A)以及DMSO与HEPES缓冲的混合溶液⑶中的荧光 发射光谱；PTC-I在不同体积甘油和水的混合溶液中的荧光强度和荧光寿命（C);不同浓度 PTC-I在水中的荧光寿命（D)。
[0025] 图2. PTC-I (A)和荧光团Cl (B)对不同蛋白的荧光响应；多沙唑嗪淬灭PTC-I对 α 1-受体三种亚型蛋白特异性响应的荧光强度（C) ;PTC_1对α 1-受体转染的HEK293细胞 特异性响应（D) ;PTC-1 的 ΗΕΚ293 细胞成像结果（E) : α 1Α-ΗΕΚ293 细胞（a，b)，a 1D-HEK293 细胞（c，d)，ΗΕΚ293 细胞（e)，a 1B-EGFP-HEK293 细胞（f，g);细胞以 PTC-l(300nM)孵育 (a，c，e，f)，细胞以PTC-I与多沙唑嗪混合溶液（300nm+3 μΜ)进行孵育（b，d，g)
[0026] 图3. PTC-I的不同肿瘤细胞成像结果。a，PC-3细胞，PTC-I ;a'，PC-3细胞， PTC-l+doxazosin ;b，DU145 细胞，PTC-I ;b'，PC-3 细胞，PTC-l+doxazosin ;PTC-1 ;c，Hela 细胞，PTC-I ;d，ES-2 细胞，PTC-I ;e，A549 细胞，PTC-I ;f，MCF-7 细胞，PTC-I ;g，！fepG2 细 胞，PTC-I。
[0027] 图4.流式细胞术测定α I-受体表达。A，α 1A-HEK293与HEK293细胞；B，PC_3与 Hela细胞。
[0028] 图5. Cy荧光染料Cl (30nM)在不同细胞的成像结果。（A)HEK293细胞；(B)PC-3 细胞；（C) ES-2细胞.（a)明场；(b)红色荧光；（c) a与b的叠合.Scale bar = 20 μ m。
【具体实施方式】
[0029] 下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。
[0030] 实例一 ：PTC_1~3的合成
[0032] 反应试剂与条件：（a)3_碘代丙酸，乙腈，回流，48h，81 % ; (b)碘甲 烷，乙腈，回流，12h，86 % ; (c)盐酸-N-(3-苯氨基-2-丙烯亚基）苯胺，AcOH/ AC2O, 120°C，4h ;吡啶 /AcOH, 120°C，4h ;30%两步；（d)炔丙胺，EDCI, DMAP,二氯甲烷，匕 t.，6h，53 % ; (e)哌嗪，H2O, 100 °C，81 % ; (f)酰基氯，TEA,乙腈，lh，0 °C，62-75 % ; (g) NaN3, DMS0, 100 °C，6h, 35-88 %; (h)CuS04,抗坏血酸钠，tBu0H/H20 = 2:1，50°C，lh，48. 9-67. 3%。
[0033] 中间体C3 :1 -(2-駿乙基）-2, 3, 3-二甲基-3H- Π 引噪-I-鹏鐵
[0034] 2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚（I. 0g, 6. 23mmol)和 3-碘丙酸（I. 86g, 9. 3mmol)溶于 15mL乙腈中，回流48小时后，降至室温。旋干溶剂后，在超声震荡下，缓慢加入IOOmL乙酸 乙酯，有大量沉淀析出。过滤，20mL乙酸乙酯洗涤滤饼，干燥后等白色固体I. 8g，产率81 %。 熔点：181-183°c · 1HnmrgoomhzJMSO-CI6) : δ 12. 72 (s, 1H), 8· 01-7. 98 (m, 1H), 7· 85-7. 83 (m ,1Η), 7. 62-7. 60 (m, 2Η), 4. 67 (t, 2Η, J = 7. 0Hz), 3. 00 (t, 2Η, J = 7. 0Hz), 2. 86 (s, 3Η), 1. 53 (s, 6Η). 13CNMRdOOMHz, DMSO-(I6) : δ 198. 4, 172. Ο, 142. 2, 141. 3, 129. 8, 129. 4, 124. Ο, 116. 0, 54. 7, 44. 0, 31. 6, 22. 4, 14. 9· ESI-MS:m/z[M-I ]calcd for C14HlsN202+232. I, found232. 4。
[0035] 中间体C4 :1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚-I-碘鑰
[0036] 2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚（2. Og, 12. 5mmol)和碘甲烷（2. 3g, 16. 3mmol)溶于 20m