一种苯二胺与柠檬酸制备细胞显影用碳量子点标记探针的方法
【技术领域】
[0001]本发明是生物材料的制备和应用，具体是由苯二胺与柠檬酸为原料制备纳米荧光显影材料，与普通碳量子点多蓝色荧光发光相比，具有多色荧光显影的效果，是材料学技术与荧光技术的交叉应用。
【背景技术】
[0002]现代医学中，可以通过将荧光物质与待测物通过化学反应以共价键连接，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等仪器的检测，利用荧光物质，在受到紫外光或蓝紫光照射时，由可激发成为激发态，当从激发态恢复至基态时，发出荧光的原理，来达到定位、示踪、含量测定等目的。这一技术称为荧光标记技术，是分子影像技术中重要的一部分，当下已经在生物化学、免疫学、分子
生物学、病理学和诊断学等方面得到了广泛的运用，极大的推动诸如癌症早期诊断，药物传输，病原体检测，诱导干细胞疗法，影像引导手术等新兴医疗技术的发展。而荧光标记技术中所使用的荧光物质除了传统的荧光物质之外，还出现了新兴的纳米荧光物质。纳米荧光物质相较于传统的荧光物质，有着其独特的特性:1、荧光纳米粒子具有更高的亮度和光稳定性，也能更加容易地实现水分散性和生物相容性。2、对纳米粒子的尺度的精确控制及对粒子功能化手段的日臻完善，使得荧光发射光谱在一定程度上实现可控，同时激发光谱宽且连续。3、由于本身纳米尺度的大小，使得其具有较大表面积，其可通过与其它分子上的化学基团形成共价键，连接诸如:蛋白质、DNA等物质，从而实现改性或功能化。纳米荧光材料包括诸多种类，其中碳量子点材料在近年得到了广泛关注。碳量子点材料由于其具有尺寸相关荧光性质，被广泛应用于纳米荧光材料领域。碳量子点的传统合成方法可分为自上而下合成法和自下而上合成法两大类，自上而下法包括激光销蚀法[1]、电化学法[2]、弧光放电法[3]等；自下而上合成法包括化学氧化法[4]、模板法[5]、微波法[6]和热分解法[7]等。以多种材料为碳源，如以碳水化合物为原材料，先用浓硫酸脱水，再加入硝酸进行氧化，最终得到具有微弱荧光的CQD[8];在高温下碳化处理西瓜皮，得到粒径为2 ml的具有荧光效应的CQD [9]。
[0003]
【发明内容】
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本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种由苯二胺及柠檬酸制备两溶性碳量子点材料的方法。
[0004]一种苯二胺与柠檬酸制备细胞显影用碳量子点标记探针的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)苯二胺-柠檬酸碳量子点的制备:将不同结构的苯二胺包括邻苯二胺、间苯二胺与对苯二胺分别加入无水乙醇中，在室温条件下避光搅拌，直至得到均匀的乙醇-苯二胺溶液，浓度为0.05-0.1Mol/L ;将柠檬酸加入超纯水中搅拌，直至获得确定浓度透明均匀溶液，浓度为0.05-0.1Mol/L ;将苯二胺乙醇溶液及柠檬酸溶液以3:1-1:1比例混合，待溶液充分混合均匀后，分别得到无色、灰蓝色、浅粉色的溶液，将混合溶液置于四氟乙烯水热反应釜中，溶液体积不超过反应釜的2/3，在密闭条件下高温静置反应；待反应充分后，缓慢冷却至室温，最终得到色、色和色的苯二胺-柠檬酸碳量子点乙醇溶液；
(2)苯二胺-朽1檬酸碳量子点的提纯:
将不同苯二胺-柠檬酸碳量子点乙醇溶液置于旋蒸仪器中，于45摄氏度旋蒸至乙醇及水完全挥发，得到苯二胺碳量子点粗产，向得到的油状粘稠液体中加入层析溶液，搅拌至油状液体均匀分散在层析溶剂之中，将所得溶液缓慢转移入硅胶层析柱之中，静置等待碳量子点粗产由于溶液极性逐渐分层，通过紫外光检测确定碳点层所在位置，并采集碳点溶液，待采集完毕后，将所得到的碳量子点有机溶液通过旋蒸的方法去除其中的层析有机溶剂，随后向所得固体产物中加入1%的乙醇溶液，将所得溶液冷冻干燥，得到最后所需的苯二胺_朽1檬酸碳量子点。
[0005]所述的细胞及组织显影用碳量子点，此种碳点结构可以克服荧光效率低，易淬灭等问题，同时具有良好的生物相容性。
[0006]本发明提供的碳量子点的荧光量子产率采用常规的参比法测定，即在相同激发条件下，分别测定待测焚光试样、已知量子产率的参比焚光标准物质的积分焚光强度和同一激发波长的入射光的吸收度，再将这些值代人下列公式:
Q= Qr x i/iR x Ar/A x η2/ n 2R
其中，Q和％分别为待测物质和参比物质的荧光量子产率和IR分别为待测物质和参比物质的荧光积分强度4和AR为待测物质和参比物质在该激发波长的入射光的吸收度；η和nR分别为待测样品和标准样品的折射率。以硫酸奎宁作为参比物，经测定本发明提供的碳量子点荧光为15°/『30%，可满足于生物监测用途。
[0007]本发明解决的技术问题是显影用碳量子点的合成制备问题，提供一种具有光学稳定性好、生物相容性高、荧光效率高的制备方法，同时工艺简单、材料转化率高、易重复的优点。
[0008]本发明有如下优势:
1、柠檬酸的存在使得反应能够更加完全，提高了能源的利用效率，得到了更高的碳量子点产率。
[0009]2、该方法使用苯二胺及柠檬酸为碳量子点原料，原料简单易得，以水热法为高温碳化方法制备水溶性的碳点荧光材料，操作简单，易于商业化。
[0010]3、该碳点的生物相容性良好，在体内使用的安全性好，可以应用于细胞及组织荧光成像。
【附图说明】
[0011 ]图1为实施例的制备方法流程。
[0012]图2为实施例制备所得碳量子点的TEM照片。
[0013]图3为实施例1所得碳量子的荧光光谱。
[0014]图4为实施例2所得碳量子的荧光光谱。
[0015]图5为实施例3所得碳量子的焚光光谱。
[0016]图6为碳量子点的HEK293细胞毒性曲线。
[0017]图7为碳量子点的U87mg细胞毒性曲线。
【具体实施方式】
[0018]苯二胺-柠檬酸碳点的制备过程如图1所示，以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
[0019]实施例1:
将邻苯二胺0.lg溶于10ml乙醇中避光于常温下搅拌，直至苯二胺固体全部溶解，得到均匀的溶液；将0.lg柠檬酸溶于10ml纯水中，于室温下搅拌，直至柠檬酸完全溶解，将苯二胺溶液及柠檬酸溶液混合，置于100ml