一种人肠道羧酸酯酶活性检测的荧光探针底物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种人肠道羧酸酯酶活性检测的荧光探针底 物及其应用。
【背景技术】
[0002] 羧酸酯酶（Carboxylesterase，CE)是机体内重要的I相代谢酶，它能够催化多种 内源性和外源性的酯类化合物发生酯键断裂，水解后释放出极性较大的醇分子和羧酸分子 片段，后者进而被体内细胞色素 P450(CYP450)或尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs)等 其他代谢酶所继续催化代谢，使药物分子更有效地被排出体外。多种结构中含有酯键的药 物分子，如盐酸伊立替康（irinotecan，CPT-11)、奥司他韦（达菲）、氯批格雷、贝诺酯等均 被羧酸酯酶催化进行活化或代谢消除。
[0003] 人体内介导药物代谢的羧酸酯酶主要分为两个亚型：羧酸酯酶1 (hCEl)和羧酸酯 酶2 (hCE2)。两种羧酸酯酶具有不同的组织分布特异性及底物选择性，人的肝脏中主要分布 表达hCEl，而小肠中则基本以hCE2为主，只有极少量的hCEl分布。因此，人羧酸酯酶2亦 称为人肠道羧酸酯酶（Human intestine carboxylesterase)。近年来发现多种肿瘤细胞 中hCE2的表达水平上调，可借助此特征设计经hCE2特异性水解的抗肿瘤前体药物实现靶 向选择性杀伤肿瘤细胞的目的。此外，多数口服前药需先经过肠道才能被吸收进入血液循 环，因此肠道中羧酸酯酶2酶对酯类药物的代谢被认为是其首过代谢的重要组成部分，羧 酸酯酶2酶活的差异对于前体药物的生物利用度具有十分重要的影响。此外，有些经静脉 给药的前体药物，如盐酸伊立替康，会经过胆汁排泄被分泌到肠道中，继而被肠道中的hCE2 催化水解释放出毒性代谢产物SN-38,后者被认为是导致伊立替康迟发型腹泻副作用的主 要原因。因而，建立基于荧光探针的高通量技术手段，对于高通量筛选hCE2的强效抑制剂 并将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻，以及hCE2功能的实时定量检测进而预测 潜在的药物-药物相互作用都十分重要。
[0004] 本发明提供了一类（E)-2-(4-(4-羟基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋 喃-2 (5H)-亚基）丙二腈酯类衍生物作为hCE2荧光探针底物的应用，其经hCE2水解后可 生成具有良好荧光属性的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑 制活性评价快速高效等特点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一类可定量检测人肠道羧酸酯酶活性的荧光探针底物及 其应用，该探针底物的水解产物具有良好的荧光属性。利用该探针反应可对多种生物体系 中hCE2的分布和功能进行定量评价。
[0006] -种人肠道羧酸酯酶（hCE2)的特异性荧光探针底物，该底物为（E)-2-(4-(4-羟 基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2(5H)_亚基）丙二腈（简写为TCF)的芳香酯 (简写为TCFE)，其结构通式为：
[0007]
[0008] 其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、 对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基或4-乙氧基苯基取代基中的任意 一种。
[0009] -种人肠道羧酸酯酶（hCE2)的特异性荧光探针底物在生物检测中的应用，所述 荧光探针底物可被人肠道羧酸酯酶特异性催化并生成水解产物TCF，该产物具有荧光发 射属性，可采用荧光检测器实现产物的快速超灵敏检测；TCF荧光检测条件为：激发波长 560nm，在590~675nm进行荧光发射谱的检测；该荧光探针底物可用作人肠道羧酸酯酶活 性快速定量检测，以及人肠道羧酸酯酶抑制剂的快速筛选与评估。
[0010] 人肠道羧酸酯酶活性快速定量检测方法为：以TCFE水解反应作为hCE2的特异性 探针反应，hCE2特异性催化TCFE并生成水解产物TCF，该产物具有良好的荧光属性，可通过 定量检测单位时间内荧光强度的变化测定hCE2的真实活性。
[0011] 人肠道羧酸酯酶抑制剂的快速筛选与评估方法为：以TCFE水解反应作为hCE2的 特异性探针反应，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单位时间内水解产物TCF的生成 量评估该生物体系中hCE2的残余活性，进而实现hCE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定 量评价。
[0012] 人肠道羧酸酯酶活性快速定量检测的具体步骤如下：
[0013] (1)使用常用缓冲液，反应温度为20°C至60°C之间；孵育体系pH介于5. 5~10. 5 之间；
[0014] (2)以（E) -2- (4- (4-羟基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亚基） 丙二腈酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10~lOKm;
[0015] (3)反应时间为5~120分钟，在确保水解产物达到定量限且底物转化率在 0. 1 %~20%之间终止反应；
[0016] (4)定量测定单位时间内水解产物生成量代入标准曲线后换算获得hCE2的活性 及酶量。
[0017] 人肠道羧酸酯酶抑制剂的筛选与评估方法具体步骤为：
[0018] (1)使用常用缓冲液，反应温度为20°C至60°C之间；孵育体系pH介于5. 5~10. 5 之间；
[0019] (2)以（E) -2- (4- (4-羟基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亚基） 丙二腈酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/1〇~ι〇Μ尤选&;
[0020] (3)加入不同浓度的抑制剂并设置空白对照组，孵育5~120分钟，并在水解产物 达到定量限且底物转化率在〇. 1 %~20%之间终止反应；
[0021] (4)定量测定单位时间内水解产物的荧光值并计算加入抑制剂组对荧光值减少的 百分数作为抑制活性评估标准。
[0022] 本发明所述特异性检测人肠道羧酸酯酶（hCE2)活性的荧光探针底物的应用领 域，包括但不限于重组表达的hCE2酶、含有hCE2的细胞及组织制备物等生物样品中hCE2 活性的定量测定。
[0023] 本发明提供的特异性检测人肠道羧酸酯酶（hCE2)活性的荧光探针底物的应用， 需注意所述底物消除率或水解产物的生成率应介于〇. 1%~20%之间。
[0024] 本发明提供的特异性检测人肠道羧酸酯酶（hCE2)活性的荧光探针底物的应用， 探针分子的水解产物具有良好的荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏 检测；荧光检测条件为：激发波长560nm，在590~675nm进行荧光发射谱的检测。此外，该 特异性探针底物及相应hCE2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各 种生物体系中hCE2酶活的定量测定。
[0025] 该特异性探针反应可用于重组羧酸酯酶、细胞或组织制备液等多种生物体系中 hCE2酶活的定量测定，还可用于快速筛选hCE2酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。
[0026] 采用hCE2单酶或肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实 验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学等多方面的证据，证明（E)-2-(4-(4-羟基苯乙 烯基）-3-氰基_5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亚基）丙二腈酯类衍生物可特异性的经羧酸酯 酶hCE2代谢生成相应的水解产物（如图5-图8所示）。
[0027] 选用本发明所述hCE2的特异性探针底物检测hCE2酶体外活性具有以下突出优 势：
[0028] (1)高特异性：(E) -2- (4- (4-羟基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋 喃-2 (5H)-亚基）丙二腈酯类衍生物可被hCE2高特异性地代谢成单一代谢产物，其它人体 酯酶或具有水解活性的蛋白不参与其类化合物的水解。
[0029] (2)高灵敏度：产物伍)-2-(4-(4-羟基苯乙烯基）-3-氰基-5,5-二甲基呋 喃-2 (5H)-亚基）丙二腈具有良好的荧光属性，具有较长的荧光发射波长（最大发射波长 在612nm)，可减少生物样本自身背景荧光，增强检测的灵敏度，在生物样本中具有良好的应 用前景。
[0030] (3)高准确性：通过绘制代谢产物荧光强度与酶浓度的标准曲线，以及日内差和 日间差研究发现，产物TCF的荧光强度与hCE2的酶浓度具有良好的线性关系，对不同生物 样品中hCE2活性的定量检测误差小于5%。
[0031] (4)高通量：利用该类荧光探针底物可实现96, 386孔板的快速检测，可实现每日2 万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉（〈0.5元）的优势。
【附图说明】
[0032] 图1. (E)-2-(4-(4-羟基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亚基）丙 二腈酯类衍生物的结构通式；
[0033] 图2. (E)-2-(4-(4-苯甲酰氧基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亚 基）丙二腈的1H-NMR谱图；
[0034] 图3. (E)-2-(4-(4-苯甲酰氧基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亚 基）丙二腈的13c-nmr谱图；
[0035] 图4. (E)-2-(4-(4-苯甲酰氧基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (