作为生物标记物的电中性金属配合物的制作方法
【专利说明】作为生物标记物的电中性金属配合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年6月18日提交的题目为"作为生物标记物的电中性金属配合物" 美国临时申请No. 61 /956，810的权益，将该申请的内容并入本文作为参考。 发明领域
[0003] 本发明涉及可生物偶联的发光金属配合物，以及它们作为新型标记分子在化学、 生物化学和生物分析领域中的应用，如免疫检测和DNA探针。更具体的说，本发明涉及电中 性的电化学发光标记分子以及它们在电化学发光免疫分析中的应用。
[0004] 发明背景
[0005] 基于生物亲和性（即两种生物活性物质，如抗体/抗原，的选择性结合)的生物分析 方法在很大程度上依赖生物标记分子，标记技术以及对产生于标记分子的信号的检测。生 物标记分子是能够自身，或者在与其它试剂发生物理/化学相互作用时，发出能与被测物质 的量相关的可检测的信号的化学或生物化学物质。生物标记分子包括，但不仅限于:含放射 性原子的分子(放射性），发光化合物(在光激发或化学反应中发光），电活性化合物(通过氧 化还原反应产生电信号），磁性颗粒(磁信号）和酶(通过与底物的反应，生成可检测的物质 或者光信号）。生物标记分子包含一个或多个信号产生单元以及一个或多个反应性基团。后 者与待标记的生物分子易于形成共价键。标记过程是将一个或多个标记分子和生物活性物 质结合形成复合物，该复合物保持对特定待检测物质的生物亲和性。
[0006] 通过一系列的电化学氧化还原反应以及与共反应剂（诸如专利US 6451225和US 6702986中披露的三丙胺)发生的后续化学反应，电化学发光(ECL)已经发展成为一种成熟 的生物分析技术，在此技术中，一种金属配位化合物，如舒（Π )多二亚胺(polydiimine)复 合物，被用作ECL标记分子的信号产生单元。美国专利（5221605,5238808,5310687， 5714089,5731147,6140138,6316607)和许多研究论文披露了ECL标记分子以及它们在免疫 分析和 DNA 探针领域的应用 Η^Ι^η:6·Ρ·Β1α^Λι?Γηθ?Β?·，(：Ηη·αιθπκ1991，37/9，1534-1539;J.H.Kenten et al.，Clin.Chem.l991,37/9,1626-1632·)。
[0007] 对ECL标记分子的改进是一个长期持续的努力方向。一方面，有大量的工作试图通 过在一个或多个与钌（II)离子配位的配体上连接上功能基团而重新设计钌（II)配合物。另 一方面，把ECL发光体从钌（II)配合物扩展到其它金属配合物的努力也进行了很多，其中一 些在专利中有所披露。比如美国专利5858676和6468741分别公开了稀土金属配合物和铼配 合物的 ECL。专利申请 W02012107420，US2013/0323719，US2013/0323857，W02014019707， W02014019708和W02014019711则公开了用作ECL标记分子的基于铱的新型配合物。
[0008] 在基于钌（II)的ECL发光体的改进方面，美国专利US 5981286公开了带有亲水性 双齿配体的钌（II)配合物。W0 99/15694公开了一种分子设计，其中金属配合物发光体通过 共价键与共反应剂（即三丙胺或其类似物)相连接。不过，由于在ECL过程中，共反应剂是要 被消耗的（而不是循环使用），所以它的浓度在实际的生物测定中须比发光体的浓度高很多 倍。这种方案不能帮助提高ECL的强度。为了提高ECL生物检测的灵敏度，美国专利US 5679519公开了一种多标记的探针复合物，它包含有生物素化的牛血清白蛋白分子作为平 台，以及大量被该平台结合的电化学发光标记分子。另外，美国专利申请US 2005/0059834 中也提出了构造担载有多个ECL发光体的树枝状构架从而实现在生物分子的单个位点上进 行多标记（也见M.Zhou et al.，Anal.Chem.2003,75,6708-6717)。
[0009] 进一步地，双齿配体的的选择也已经超越了以2，2 联吡啶和1，10-菲咯啉的基础 类型。美国专利7750157 B2(EP1759204 A1)公开了一种钌（II)标记物设计，其中生物偶联 臂连接在一个既非2，2 联吡啶也非1，10-菲咯啉的双齿配体上。
[0010] 以上专利和研究论文中所披露的这些钌（II)ECL发光体（没有生物偶联基团）和 ECL标记分子(带有生物偶联基团）的一个共同特点是它们都有一个带正电荷的金属配合物 发光体(见图1A)，和不发光的反离子，如氯离子Cr或六氟磷酸根离子PFf等。用这些发光体 标记的物质的生物活性或者选择性亲和能力会由于带正电的金属配合物的引入而降低。降 低了的生物活性在基于生物亲和性的生物检测中会提升非特异性结合，从而降低生物分析 的灵敏度和重复性。针对带有正电性ECL发光体的标记物的这一缺点，美国专利5958783 (CN1134154，EP0720614 B1)公开了一类ECL标记分子(见图1B)，其特征在于，在带正电的发 光体和反应基团（即生物偶联基团）之间有一个带电荷的连接体。据其披露，由于降低了对 蛋白的非特异性结合，这类标记物改进了ECL免疫分析的性能。不过在这个标记物中，信号 产生单元(ECL发光体)本身还是带正电荷的金属配合物，需要反离子来中和其正电荷。
[0011] 同样为了降低有害的非特异性结合，美国专利6808939B2(CN1612861A)公开了一 类带电荷(尤其是负电荷)功能基团的双齿配体（即联吡啶和菲咯啉）以及含有这些带电荷 配体的钌（II)配合物标记分子(见图1C)。这些结构为M(L'）（L"） 2的二杂配标记分子具有负 电荷以及可离解的阳离子。结果显示，一些带负电荷的发光体标记在抗体上后，非特异性的 ECL信号显著降低。然而，在降低非特异性信号的同时，没有显示对特异性信号水平的改进。
[0012] 这些ECL发光体或含这些发光体的标记分子或者带正电荷（绝大多数情况），或者 带负电荷，都需要有反离子来中和电荷。它们都是离子性化合物，在电解液溶液中均会分开 或电离成阳离子和阴离子。此外，已经合成的这些金属配合物或者是二杂配，或者是均配金 属配合物，即配合物中至少有两个二齿配体是相同的。
[0013] L.Della Ciana等（J.Phys.Chem.C 2010,114,3653-3658)描述了一个二杂配两性 离子钌(II)发光体，其含有两个相同的2,2'_联吡啶配体和一个苯磺酸化的菲咯啉配体，该 发光体在水相中的ECL强度与三联吡啶钌（II)配合物相比要高。不过，和其它一些不具有生 物偶联基团的、报道所称的高强度ECL发光体一样，该发光体用于ECL免疫分析不可行，而且 在该金属配合物上引入反应性生物偶联基团的合成方法也未建立。
[0014] 钌(II)配合物在包含有共反应剂和溶剂的特定电解质溶液中的ECL强度随着配体 的结构和配体的组合方式不同而差别巨大。由于ECL产生过程的复杂性(W.Miao et al， JACS，2002，124，14478-14485)，一般共识是，任何单一的性质，诸如光量子效率，氧化还原 电势，发光波长以及发光体的电荷状态与ECL强度没有相关性（M.Zhou et al， Inorg. Chem. 2005，44，8317-8325)。不过，用电中性的发光体标记一个生物物质不会改变该 物质的电荷状态。因此，在大小相近或分子量类似的标记物中，电中性的标记分子对于待标 记生物物质的生物活性的影响最小。鉴于此，本发明注重设计配体的结合方式，以使金属配 合物(例如钌（II)配合物)成为电中性的ECL标记物，其在水性缓冲溶液或任何其它溶剂中 不解离成阳离子和阴离子。
[0015] 在我们通过使用电中性标记物降低标记物对被标记物活性的影响的同时，我们惊 奇地发现电中性的ECL标记物不仅降低了非特异性信号，一部分电中性ECL标记分子还产生 了更高的ECL强度。
[0016] 过去公开的钌（II)配合物标记分子的合成主要遵循一种方法(见下面反应式）。在 这种方法中，首先合成顺式I了二亚胺二氯化物(cis-ruthenium diimine(L)dicholoride)， 即cis-RU(L)2Cl 2)，然后再将具有生物偶联功能的二亚胺配体与金属离子配位。
[0017] RuCl3\xH2〇+L-cis-Ru(L)2Cl2(l)
[0018] cis-Ru(L)2Cl2+L'-Ru(L)2(L'）C12(2)
[0019] 美国专利US 6808929B2公开了另一种合成方法(专利中的实施例2)。其中，一个具 有生物偶联功能的二亚胺配体，即4-甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_联吡啶，先和氯化钌（II) 发生配位，而后再引入另外两个相同的配体，形成ECL标记物。
[0020] 这些合成方法产生二杂配配合物标记分子，它们具有两个不具有生物偶联功能的 相同配体和一个具有生物偶联功能的配体。合成三杂配金属配合物ECL标记分子的工作在 现有技术中还未见报道。
[0021] 不同于图1A-C中那些具有带正电荷或者带负电荷的钌（II)发光体，图1D所示的电 中性ECL标记分子具有三个不同的配体，不能套用二杂配配合物标记分子的合成方法来进 行合成。所以，本发明中除了披露配体组合模式外，该发明也涉及一种将三个不同的二亚胺 配体依次与金属离子配位形成三杂配ECL标记分子的合成方法。
[0022]本发明进一步公开了用这类中性ECL发光体标记的生物物质以及它们在ECL免疫 分析中的应用。
[0023] 本发明的一个目的是提供具有电中性金属配合物发光体的发光生物标记物。
[0024] 本发明的另一个目的是提供导致金属配合物发光体呈电中性的不同的配体组合 模式。
[0025] 本发明的又一个目的是提供具有电中性金属配合物发光体的三杂配标记物的合 成方法。
[0026] 本发明的再一个目的是提供标记有电中性金属配合物发光体的物质。
[0027] 本发明还有一个目的是提供用于开展化学物质、生物化学物质和生物活性物质的 ECL定量分析的生物标记分子。
[0028] 发明概述
[0029]本发明涉及生物分析方法的改进，具体来说是利用金属配合物的电产生化学发光 或电化学发光(ECL)的免疫分析和核酸检测。本发明所描述的金属配合物以钌（II)配合物 作为实例。但是，能生成与金属钌(II)多二亚胺配合物类似的金属螯合物的其它过渡金属， 如金属锇、铂、铼、铱等，也在本发明的涵盖范围内。
【附图说明】
[0030]图1展不现有技术公开的(A-C)和本发明披露的(D)ECL标记分子。
[0031] 图2是化合物3的1H NMR图谱。
[0032] 图3是化合物6的1H NMR图谱。
[0033] 图4是化合物10的1H NMR图谱。
[0034] 图5是化合物15的1H NMR图谱。
[0035] 图6是化合物16的1H NMR图谱。
[0036] 图7是标记分子17的1H NMR图谱（图谱左边:芳香环区；图谱右边:脂肪链区）。
[0037] 图8是标记分子18的1H NMR图谱。
[0038] 图9是标记分子19的1H NMR图谱。
[0039] 图10是标记分子20的1H NMR图谱。
[0040] 图11是标记分子16，19,27和Ru(2,2'_联吡啶)2[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (标识为Ru-Ref)的吸收光谱。
[0041 ] 图12是标记分子16，19,27和Ru(2,2'_联吡啶)2[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (标识为Ru-Ref)的光致发光光谱。
[0042]图13比较不同标记分子在含有三丙胺的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中以1.4V vs.Ag/AgCl阶跃电势激发所得到的电化学发光强度。钌（II)配合物的浓度均为:0.1μπι〇1 L-、
[0043] 图14比较标记分子16和Ru-Ref在含有三丙胺的pH值为6.8的磷酸缓冲溶液中以 1.4V vs.Ag/AgCl电阶跃电势激发所得到的电化学发光强度。钌(II)配合物的浓度分别为： 10-7，10- 8，10-9mol L-、
[0044] 图15比较使用标记分子16和Ru-Ref在免疫分析测试中的ECL信号强度。
[0045] 发明详述
[0046] 本文中所用到的术语"金属配合物"，"配位金属配合物"，"发光金属配合物"，"ECL 金属配合物"，"钌（II)配合物"，"金属钌（II)配合物"和"金属螯合物"有时可交替使用。在 本发明的范围里，金属配合物或者ECL金属配合物包含"发光体"或"ECL发光体"以及"标记 分子"或"ECL标记分子"。前者是没有生物偶联基团的金属配合物，而后者则指的是具有生 物偶联基团的金属配合物。生物偶联基团是一类功能化的或能进行反应的反应性基团，它 可以在温和的条件下，如处于室温的生理缓冲溶液中，和其它化学、生物化学和生物物质发 生反应，形成高度稳定的共价键。
[0047] 在本发明的范围内，被称作"标记物"，"标记物分子"，"钌(II)标记物"和"ECL标记 物"的物质可与其它物质形成共价键，这些其它物质诸如，具有生物活性的被测物或其类似 物，基于亲和性的被测物的识别性配对物或