荧光探针及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种汞离子(Hg2+)检测剂，具体涉及一种基于基于含双碳硫键结构罗 丹明的Hg2+荧光探针的制备方法。
【背景技术】
[0002] 汞是生物体和环境中常见的污染物之一，汞在常温下以液态的形式存在，具备较 强的挥发性，给生态系统带来较大的危害。汞主要以无机汞和甲基汞的形式进入生物体中， 并在生物体内富集。汞离子具备较强的嗜硫性，过量的汞离子与生物体内含S的蛋白质或者 酶发生反应，从而引起一系列的疾病。对生物体的神经系统和正常代谢活动造成极大的伤 害，如汞离子过量可以导致不可逆的DNA损伤、心肌梗塞、中枢神经紊乱以及多种类型的自 闭症等症状。正是由于汞离子的剧毒性，世界上多个国家和相关组织均对汞离子在饮用水 和食品中的含量做了严格的要求，如美国环保局(EPA)就严格规定在饮用水中的汞离子含 量不得超过2ppb。近年来，实时监测生物体和环境中的汞离子含量成为一个重要的研究领 域。荧光探针由于具有成本较低、操作仪器简单、检测限低、实时监测等优点，荧光探针法检 测金属离子近年来受到广泛关注。
[0003] 基于"turn-on"机理的焚光传感材料可减少检测错误，对复杂体系检测更准确，按 机理它分为焚光化学传感器（fluorescentchemsensor)和焚光化学剂量计 (fluorescentchemodosimeter)两种类型。其中，焚光化学剂量计由于可以和目标分析物发 生不可逆的化学反应，对分析物表现出高选择性，逐渐突显出其在重金属离子检测中的优 势。汞离子荧光化学剂量计主要是利用汞离子与硫羰基发生脱硫反应以及与端基炔或烯烃 发生羟汞化反应实现对汞离子检测。羟汞化反应由于反应活性较低，常常需要较高的反应 温度或较长的反应时间，限制了它的应用。基于脱硫反应的汞离子荧光化学剂量计具有响 应速度快、常伴有比色分析等特点，越来越受到人们的关注。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提出一种基于含双碳硫键结构罗丹明的Hg2+荧光探针的制备方 法。
[0005] 本发明提出的一种基于含双碳硫键结构罗丹明的Hg2+荧光探针的制备方法，首先 由商品化的罗丹明B与半胱胺盐酸盐进行缩合酰化反应，得到一种罗丹明B-半胱胺衍生物 (RhB-SH);该罗丹明B-半胱胺衍生物(RhB-SH)经过劳森试剂硫化得到含碳硫键的中间体 (S-RhB-SH);该含碳硫键的中间体(S-RhB-SH)与间苯二甲酰氯进行酰氯化反应得到一种含 双碳硫键结构罗丹明的化合物，该化合物在甲醇-水溶液中可以用做Hg 2+的高选择性荧光探 针。
[0006] 本发明提出的一种基于含双碳硫键结构罗丹明的Hg2+荧光探针的制备方法，其具 体合成路线如下所示：
[0008] (1)将罗丹明B溶于无水1，2-二氯乙烷中，冰浴条件下滴加入一定量的三氯氧磷， 冰浴下反应1小时，改为回流反应3小时，减压去除溶剂，得到罗丹明酰氯RhB-Cl。将罗丹明 酰氯RhB-Cl溶于无水乙腈中，冰浴条件下过量半胱胺盐酸盐的乙腈溶液滴加入上述体系 中，待反应完全后使反应体系升温至室温，减压除去溶剂，用乙酸乙酯重新溶解，用纯水和 饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，硅胶柱层析分离得 到中间产物RhB-SH。
[0010] ⑵将中间体RhB-SH和劳森试剂溶于无水甲苯，加热回流至反应完全，减压蒸馏浓 缩除去甲苯，浓缩物用CH2C12溶解，饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后 硅胶柱层析分离得到中间体S-RhB-SH。
[0012] (3)将中间体S-RhB-SH与三乙胺混合于二氯甲烷溶液中，冰浴条件下滴加入间苯 二甲酰氯的二氯甲烷溶液，滴加完毕后该为室温反应，反应完全后，饱和氯化钠溶液洗涤， 有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，用二氯甲烷和甲醇作为洗涤剂，经硅胶柱 层析分离得到产物HgPl。
[0014]所述步骤（1)中，罗丹明B与三氯氧磷的物质的量之比为1:3-8,所述冰浴条件温度 为〇°C以下，回流反应温度为80-90°C，反应时间为4-7小时，罗丹明酰氯RhB-Cl与半胱胺盐 酸盐的物质的量之比为1:3-5，反应时间为5-8小时，产率为60-80%。
[0015] 所述步骤⑴中，硅胶柱分离的洗脱液为CH2C12和CH30H，所述CH 2C12与CH30H的体积 比为 20-30:1。
[0016]所述步骤(2)中，中间体RhB-SH与劳森试剂的物质的量之比为1:2-5，所用甲苯需 经无水处理，所述加热回流反应温度为105-120°C，反应时间为10-15小时，硅胶柱分离的洗 脱液为CH2C1 2和CH30H，所述CH2C12与CH30H的体积比为8-20:1，产率为15-30%。
[0017] 所述步骤⑶中，硅胶柱分离的洗脱液为CH2C12和ch3〇h，所述CH 2C12与ch3〇h的体积 比为10-25:1，产率为70-90%。
[0018] 所述步骤(3)中，化合物S-RhB-SH为2-4当量，间苯二甲酰氯为1当量，三乙胺为2-4 当量，所述冰浴条件温度为〇°C以下，室温反应时间为8-15小时。
[0019]含双碳硫键结构罗丹明的Hg2+荧光探针分子在检测Hg2+中的应用。
[0020] 本发明的有益效果是:探针HgPl在CH30H-H20(9/l，v/v)体系中对Hg 2+具有高效灵 敏的专一检测能力。通过以上紫外、荧光光谱研究等实验结果，推测出HgPl识别Hg2+的可能 机理如附图6所示:探针溶液中加入Hg 2+，由于Hg2+的嗜硫性，Hg2+与分子结构中' C = S'中的S 原子结合，生成并脱去两分子的HgS，并导致罗丹明结构中的酰螺内酯环打开，释放出荧光 信号，生成具有荧光的产物HgPl-Hg。通过HR-MS对产物HgPl-Hg的结构进行了确证(附图7)。 实验结果表明，HgPl-Hg理论计算值为484.2417，HR-MS结果显示为484.2298。该数据确证了 附图6所示作用机理。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的荧光探针HgPl紫外选择性图，插图为溶液颜色变化图；
[0022]图2为本发明的荧光探针HgPl荧光选择性图，激发波长520nm;
[0023] 图3为本发明的荧光探针HgPl识别Hg2+的抗金属阳离子干扰性图，激发波长520nm， 发射波长583nm;
[0024] 图4为本发明的荧光探针HgPl识别Hg2+的抗阴离子干扰性图，激发波长520nm，发射 波长583nm;
[0025] 图5为本发明的荧光探针HgPl荧光滴定图，插图为最低检测限图，激发波长520nm;
[0026] 图6为本发明的荧光探针HgPl识别机理图；
[0027]图7为本发明的荧光探针HgPl识别机理验证高分辨图。
【具体实施方式】
[0028]本发明中制备荧光探针HgPl的过程中所使用的化学试剂、溶剂、金属离子等均阿 拉丁试剂公司。在荧光探针HgPl的确证和性能测试过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振 谱仪，溶剂为氘代氯仿，以TMS为内标记录核磁共振氢谱和碳谱。采用Thermo公司的Q-ExactiveHR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据。采用日本日立公司F-7000荧光光谱仪记录荧 光光谱。
[0029] 1、中间体RhB-SH的制备
[0030] 100mL圆底烧瓶中，将2.18g(4.5mmol)罗丹明B溶于30mL无水1，2_二氯乙烷中，冰 浴条件下滴加入1.5mL(16.4mmol)的三氯氧磷，冰浴下(0°C)反应1小时，改为85°C回流反应 3小时，减压去除溶剂，得到罗丹明酰氯RhB-Cl;将罗丹明酰氯RhB-Cl溶于30mL无水乙腈中， 冰浴(〇°C)条件下滴加0 · 51 g(4 · 5mmo 1)半胱胺盐酸盐的无水乙腈溶液（15mL)，冰浴反应6小 时，使反应体系升温至室温，减压除去溶剂，用乙酸乙酯（35mL)重新溶解，用纯水(40mLX2) 和饱和氯化钠溶液(40mLX2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，经硅胶 柱层析分离(洗脱液为CH 2C12: CH30H=20:1，体积比）得到中间产物RhB-SH，产率为69 %。 [0031] 2、中间体S-RhB-SH的制备
[0032] 100mL圆底烧瓶中，将中间体RhB-SH( 50lmg，lmmo 1)和劳森试剂（809mg，2mmo 1)溶 于40mL无水甲苯中，加热回流（110°C)至反应完全（15小时），减压蒸馏浓缩除去甲苯，浓缩 物用50mLCH2Cl2溶解，饱和氯化钠溶液(40mL X 2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩 后经硅胶柱层析分离(洗脱液为CH2C12: CH30H= 18:1，体积比）得到中间体S-RhB-SH，产率为 21%〇
[0033] 3、探针HgPl的制备
[0034] 100mL 圆底烧瓶中，将中间体 S-RhB-SH(l .29g，2.5mmol)与三乙胺（252mg， 2.5mmo 1)混合于无水二氯甲烷（40mL)溶液中，冰浴（0°C)条件下滴加入间苯二甲酰氯 (0.2g，lmmol)的无水二氯甲烷溶液（15mL)，滴加完毕后该为室温反应，反应完全（10小时） 后，饱和氯化钠溶液(40mLX 2)洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压