一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO-PSe及其制备方法和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于合成领域，特别涉及一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针 FO-PSe及其制备方法和应用。
【背景技术】：
[0002] 次氯酸在人体内是重要的活性氧之一，它在生物体的生理和病理等方面都起着至 关重要的作用。在生物体中过氧化氢和氯离子在髓过氧化物酶的催化作用下能够发生化学 反应，产物次氯酸根及其质子化的形式即次氯酸在生理条件下存在于生物体内。次氯酸是 一种具有强亲核能力的的氧化性物质，它可以与生物体内的多种分子如RNA，DNA，脂肪酸， 胆固醇及多种蛋白质发生反应。次氯酸最显著的作用是其强抗菌性，它是通过把某种病毒 接触反应中所需的酶氧化掉，从而达到杀菌抗菌的目的。如果次氯酸的浓度出现异常，就会 对生命体系造成极大的破坏，同时引发一些严重的疾病，如关节炎，动脉硬化及一些癌症 等，因此发展用于次氯酸检测的工具是很有意义的。
[0003] 近几年来，已报道了 HC10的荧光探针数种，如DCFH、DHR(参见文献:A.Bizyukin，et al，Bull.Exp .Biol .Med. 1995,119，347 · )、APF(文献：T.Nagano，J.Biol.Chem. 2003，278， 3170.)、]\^切厶1?(文献：1'.似8311〇.1.厶111.〇16111.5〇(3.2007，129，10324.)等，但以上探针除了能 够检测HC10,对其他的活性氧物种亦有不同程度的荧光响应。由于每种活性氧都有其各自 独特的生理或病理作用，因此对专一性强的HC10荧光探针的需求显得尤为迫切。已报道的 另外一些HC10探针中，有的需在pH12的苛刻的操作条件（文献:H.M.Ma，Chem.Eur.J.2008， 14，4719·)，或水溶性差(文献:W·Tan，et al，Chem.Eur · J· 2009，15，2305 ·)，无法真正应用 于生物体系中。目前，能够真正应用于细胞中HC10检测的荧光探针极少，需在繁琐苛刻的条 件下多步骤高成本制备而得（文献：T. Nagano，J. Am. Chem. Soc . 2007，129，7313 .;文献： J · Tae，0rg · Lett · 2009，11，（4)，859 ·;文献：R. Weissleder，P · Libby，Chem.Biol · 2007，14， 1221.)〇
[0004] 荧光法具有高灵敏度、高选择性、简单方便、实时原位检测等优点，使其在生命和 环境科学、分析化学等领域有相当广泛的应用前景。因此设计高灵敏度、高选择性、快速识 别的新型次氯酸荧光探针得到人们越来多的重视，同时也成为一项非常重要的课题。双光 子荧光探针被广泛用于生物成像领域，由于其对生物组织样品较低的光损伤、较深的组织 穿透能力、较低的生物背景荧光干扰等优点。因此，新型的双光子荧光探针的合成和发展是 非常必要的，尤其可逆型的双光子的设计、合成还是非常具有挑战性的。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于弥补目前次氯酸检测中，双光子可逆型荧光探针较少的状况，简 易、高效地合成了一种双光子可逆型荧光探针(FO-PSe)，可逆是指荧光探针(FO-PSe)可与 次氯酸发生氧化反应，荧光增强;之后又可与GSH发生还原反应，荧光减弱，如此循环多次。 将其成功应用于活细胞及活体中次氯酸的成像分析，而且可以实现活体中腹腔部位不同深 度次氯酸的成像分析，基本无背景荧光，效果良好。
[0006] 一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针FO-PSe，其结构式为：
[0008]上述的探针FO-PSe的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 取原料1和2溶于N，N_二甲基甲酰胺溶液，加入适量的二硫苏糖醇和1，8_二氮杂双 环[5.4.0]十一碳-7-烯，于75-100°0反应25-401!，萃取、干燥、二次溶解、过柱分离，即得； [0010]所述原料1的结构式为：
[0012] 所述原料2为二苯基二硒。
[0014] 优选的，上述原料1和2、二硫苏糖醇、1，8_二氮杂双环[5.4.0]^碳-7-烯、N，N-二甲基甲酰胺物质的量之比为1-2:3-6:5-10:10-15。
[0015] 优选的，上述过柱分离所用洗脱剂体积比为石油醚:二氯甲烷5-9:1_2(V/V)。
[0016] 上述的探针FO-PSe可用于检测生物体内或外的次氯酸含量。
[0017]上述的探针FO-PSe可用于定量检测次氯酸。
[0018] 上述的探针FO-PSe可用于活细胞和斑马鱼及小鼠的活体成像。
[0019]上述的探针FO-PSe可用于激光共聚焦成像。
[0020] 本发明还提供了一种用于次氯酸检测的双光子激光检测系统，包括双光子激光共 聚焦显微镜和上述的探针FO-PSe。
[0021 ]本发明还发现:探针FO-PSe检测生物体内或外的次氯酸时，优选的激发光的波长 为425_450nm或800~825nm。
[0022]本发明设计合成了一种用于次氯酸检测的双光子可逆型荧光探针，命名为F0-PSe，它具有双光子性质，并且是可逆型的荧光探针。我们成功地将其应用于活细胞及活体 内次氯酸的研究，取得了良好的效果。其简易、高效的合成步骤及优良的光物理性质属于合 成与技术领域。
[0023]通常，可以将染料分子溶解在缓冲液或由DMS0等水溶性有机溶剂中，然后加入适 当缓冲液及其他有机试剂进行测试。我们分别研究了探针FO-PSe在pH = 7.4缓冲水溶液及 各种常见的有机试剂中的光物理性质并将其用于活细胞和斑马鱼及小鼠活体成像实验。活 细胞和斑马鱼活体的染色方法是将探针加入培养好的活细胞或斑马鱼培养液中，孵育一定 的时间去除孵育液，并用PBS缓冲液洗涤3次，然后进行激光共聚焦成像）。小鼠活体染色的 方法是用注射器将探针分子注射到老鼠腹腔部位，然后进行激光共聚焦成像。
[0024]本发明利用以前已有的原料中间体1和2,由一步简易、高效合成，最后经过薄层色 谱柱分离得到探针FO-PSe。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] (1)该探针分子具有双光子性质，有效地降低了自吸收，提高了成像准确度。
[0027] (2)该探针对次氯酸具有可逆性，可以动态可逆的检测生物体系中次氯酸的浓度 变化。
[0028] (3)活细胞和斑马鱼及小鼠染色效果良好。染色时间较短（lOmin)，染色效率较高。 [0029] (4)合成步骤相对简单、产率较高、容易纯化。
【附图说明】
[0030]图1是本发明新型荧光探针的激发光谱及发射光谱谱图，其中a为激发光谱，激发 波长为425nm，b为发射光谱，发射波长为530nm;横坐标为波长(nm)，纵坐标为焚光强度。 [0031]图2是本发明新型荧光探针与次氯酸作用前后的双光子荧光发射谱图，其中a为荧 光探针与次氯酸作用前的双光子发射光谱，b为荧光探针与次氯酸作用后的双光子发射光 谱;横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。
[0032]图3是本发明新型荧光探针（ΙΟμΜ)与加入不同浓度的次氯酸(0-100μΜ)，单光子荧 光光谱。Inset:探针的荧光强度与次氯酸浓度的线性相关性。
[0033] 图4是本发明新型荧光探针细胞成像图，即与巨噬细胞单光子荧光成像和双光子 荧光成像图。
[0034] 图5是本发明新型荧光探针在斑马鱼的荧光成像图。
[0035] 图6是本发明新型荧光探针在小鼠腹腔部位的荧光成像图。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合实施例进一步说明本发明。
[0037] 实施例1:荧光探针的合成
[0038] 在氩气保护下，将化合物1 (0.374g，1.2mmol)和二硫苏糖醇(0.308g，2. Ommol)溶 于N，N-二甲基甲酰胺10-15mL中，75-100°C反应30min后加入化合物2(0.135g，0.4mmol)，继 续搅拌20min，加入 1，8_二氮杂双环[5.4.0]^碳-7-烯(0· 75ml，5 ·Ommol)，75_100°C反应 25-40h。反应完毕后，将混合液分别用二氯甲烷和饱和碳酸氢钠萃取，将有机相用无水硫酸 镁干燥。然后重新溶解过柱分离，得橙红色固体(40 % -80 % )。
[0039]核磁及质谱表征：
[0040] 4 NMR(400MHz，CDCl3):S7.594(s，2H;Ar H)，7.528(d，2H;Ar H)，7.456(d，2H;Ar H)，7.180-7.248(m，10H;Ar H).13C NMR(100MHz，CDC13)S191.54，141.72，137.18，132.77， 132.53,130.59,128.60,127.17,127.06,126.69,119.94.77Se 匪R(150MHz，CDC13): δ 431.4.MS data,m/z:492.9619(M+H)
[0041 ]效果实验：
[0042]探针的单光子激发发射实验和双光子荧光发射实验：
[0043] FO-PSe探针测量其单光子激发发射实验，单光子激发和发射谱图显示于图1。图1 横坐标为波长(nm)，纵坐标表不焚光强度。焚光探针与次氯酸作用前后的双光子焚光发射 谱图显示于图2;横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。其中双光子实验的激发为 800nm，可以有效的避免自体荧光，从而提高检测的灵敏度。探针FO-PSe与不同浓度的次氯 酸反应导致的荧光性质变化如图3所示。随着次氯酸浓度的增加，探针的荧光强度逐渐增 强。次氯酸浓度在5.0 X 10_6~1.0 X 10、的范围内，FO-PSe探针的荧光强度与次氯酸浓度 存在良好的线性关系，线性相关系数为〇. 992，检测限为0.35μΜ(η = 1 land S/N=3)。
[0044]探针对活细胞和斑马鱼及小鼠活体染色成像实验：
[0045]巨噬细胞由高糖的DMEM培养液培养，分别加入ΙΟμΜ的探针HEPES水溶液，37°C中孵 育10分钟，然后将细胞进行激光共聚焦荧光成像，可以看出其对活细胞染色效果较好，由于 其在水中基本无荧光，因此细胞背景较低（图3)。
[0046] 将斑马鱼加入20μΜ探针HEPES溶液，孵育0.5小时，然后将斑马鱼进行激光共聚焦 荧光成像，可以看出其对斑马鱼染色效果较好，基本无背景荧光(图4)。
[0047]在小鼠腹腔部位加入20μΜ探针HEPES溶液，然后将小鼠腹腔部位进行激光共聚焦 荧光成像，可以看出其对小鼠腹腔部位成像效果较好，基本无背景荧光(图5)。
[0048]实施例2:荧光探针的合成
[0049] 在氩气保护下，将化合物1 (0.374g，1.2mmol)和二硫苏糖醇(0.308g，2. Ommol)溶 于N，N-二甲基甲酰胺lmL中，75°C反应30min后加入化合物2(0.135g，0.4mmo 1)，继续搅拌 20min，加入 1，8-二氮杂双环[5 · 4 · 0]^^一碳_7_烯(0 · 75ml，5 · Ommo