一种稀土荧光标记的复合微球标记物及其制备方法

文档序号:9858699阅读:1738来源:国知局
一种稀土荧光标记的复合微球标记物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及功能高分子生物材料技术领域,特别是涉及一种稀土荧光标记的复合微球标记物及其制备方法。作为性能优异的荧光材料,稀土荧光微球标记物可以广泛应用于医学领域。
【背景技术】
[0002]现有技术中,稀土离子或稀土配合物和二氧化硅掺杂的发光材料已有不少报道,如Cannasa (Cannasa.C,et a I ,Mat.Res.Soc.Symp.Proc.676(Y3) 18.1-18.6,2001)描述了一直用溶胶-凝胶法制备直接掺杂铕(Eu3+)的Y203-Si02纳米发光材料;Moran等(C.E.Moranet al ,Langmuir 2001,17,8376-8379)合成了一直掺入Pr3+和Er3+的娃纳米颗粒;程艳玲等(程艳玲等,应用化学2008,25(10) ,1217-1220)以聚乙烯吡咯烷酮作稳定剂,将单体苯乙烯通过超声辐照分散聚合制得直径在SOnm左右的聚苯乙烯纳米微球。
[0003]现有的稀土荧光络合物标记物中,常用的荧光标记物如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明-6_G(R-6-G)等,其荧光寿命普遍都比较短,长期的使用难以克服背景荧光的干扰,在其检测中通常灵敏度都较低;其中的稀土离子主要是Eu3+、Sm3+、Dy3+和Tb3+同一些有机配合物如β-二酮化合物、邻菲咯啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物等所形成络合物,虽然目前已得到不同程度的应用,但是都难以同时满足一下要求:(I)、具有强烈的荧光;(2)、稳定性好:包括热力学稳定和耐光漂白等;(3)、易于与抗体、核酸等生物大分子交联,交联后能同时保持标记物的高荧光强度和被标记物的生物活性;(4)易合成。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是针对现有技术存在的不足,提供一种具有荧光寿命长、稳定性好、易合成、成本较低和易标记的一种稀土荧光标记的复合微球标记物及其制备方法。
[0005]为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:先将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、过硫酸钾(KPS)、苯乙烯(St)加入乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中,在氮气的保护下聚合反应;在一定温度下、且保持恒定的功率和氮气气流速,反应一定时间后得到聚苯乙烯纳米微球分散液;再利用带有活性基团的有机硅烷在二氧化硅微球引入活性基团,再将稀土焚光络合物4,4,-双(1,1,1,2,2,3,3,h氣-4 , 6 , _己二酮基)氯横基-邻-二联苯-铕(BHHCT-Eu3+)或4,7-二氯磺基苯-1,10菲咯啉-2,9二羧酸-铕(BCPDA-Eu3+)通过化学键合的形式固定于二氧化娃微球的表面,
[0006]而后在微球表面以带有活性基团的有机硅烷再次引入活性基团,制成稀土荧光标记的复合微球标记物。
[0007]其制备方法包括以下步骤:
[0008](D、原材料预备:
[0009]按重量预备原材料:15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^过硫酸钾、8-128苯乙烯、80-120ml乙醇或水和4,4,-双(I ,1,1,2,2,3,3t氣_4,6-己—■酬基)氣横基_邻-二联苯;
[0010](2)、制备复合微球:
[0011]I)、制备氨基化纳米微球:
[0012]将15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^过硫酸钾、8-128苯乙烯加入到80-1201111乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中,通氮气排除体系中的氧气,开启超声波发生器进行聚合反应,在反应6-10小时后得到聚苯乙烯纳米微球分散液;
[0013]离心搜集聚苯乙稀纳米微球,以5mL无水乙醇悬浮,加入5yL氨基娃烧,室温搅拌反应I小时,以等体积无水乙醇洗涤后收集;
[0014]2)、制备稀土荧光纳米微球:
[0015]将4,4,-双(I,I,I,2,2,3,3_七氟_4,6-己二酮基)氯磺基-邻-三联苯配制成Img/mL,按等体积加入到氨基化纳米微球悬浮液中,室温避搅拌15min,离心收集,悬浮于50mmol/L、pH值=7.8的磷酸盐缓冲液中,加入等体积0.lmol/L氯化铕溶液,室温避光搅拌反应lOmin,
[0016]离心收集后悬浮于等体积无水乙醇溶液中,加入5yL氨基硅烷,室温搅拌反应I小时,以等体积无水乙醇洗涤后收集,即得到稳定的稀土荧光标记的复合微球标记物。
[0017]其制备方法包括以下步骤:
[0018](D、原材料预备:
[0019]按重量预备原材料:15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^过硫酸钾、8-128苯乙烯、80-120ml乙醇或水和4,7-二氯磺基苯-1,10菲咯啉-2,9二羧酸;
[0020](2)、制备复合微球:
[0021]I)、制备氨基化纳米微球:
[0022]将15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^过硫酸钾、8-128苯乙烯加入到80-1201111乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中,通氮气排除体系中的氧气,开启超声波发生器进行聚合反应,在反应6-10小时后得到聚苯乙烯纳米微球分散液;
[0023]离心搜集聚苯乙稀纳米微球,以5mL无水乙醇悬浮,加入5yL氨基娃烧,室温搅拌反应I小时,以等体积无水乙醇洗涤后收集;
[0024]2)、制备稀土荧光纳米微球:
[0025]将4,7_二氯磺基苯-1,10菲咯啉_2,9二羧酸配制成lmg/mL,按等体积加入到氨基化纳米微球悬浮液中,室温避搅拌15min,离心收集,悬浮于50mmol/L、pH值=7.8的磷酸盐缓冲液中,加入等体积0.lmol/L氯化铕溶液,室温避光搅拌反应1min,
[0026]离心收集后悬浮于等体积无水乙醇溶液中,加入5yL氨基硅烷,室温搅拌反应I小时,以等体积无水乙醇洗涤后收集,即得到稳定的稀土荧光标记的复合微球标记物。
[0027]所述4,4,-双(I,I,I,2,2,3,3_七氟_4,6_己二酮基)氯磺基_邻-三联苯或4,7_二氯磺基苯-1,10菲咯啉-2,9二羧酸与乙醇或水的体积比为3:1。
[0028]所述聚合反应过程中通循环水维持的反应温度为60°C,且保持恒定的功率300W和恒定的氮气气流速。
[0029]本发明所述的稀土荧光标记的复合微球标记物中常用稀土离子主要有:铕、钐、镝和铽等,它们能与某些特定的配合物(β二酮类配体配合物,羧酸类配体配合物、邻菲咯啉类配合物等)形成具有强烈荧光的络合物;所形成的稀土荧光络合物具有以下优点:(I)、荧光寿命长:一般的焚光物质及背景焚光的寿命约为I?10纳秒,而稀土焚光络合物的焚光寿命一般为10?1000微秒,两者相差5?6个数量级;因此米用时间分辨焚光检测技术,可以有效克服非特异性的背景荧光的干扰,极大地提高测量灵敏度;(2)、较宽的激发光谱带:这有于增加激发能,提高标记物的比活性;(3)、较窄的发射谱带:半峰宽小于15纳米,有利于提高分辨率;(4)、较大的Stokes位移(相同电子跃迀在吸收光谱和发射光谱中最强波长间的差值):稀土络合物的最大激发光波长通常在300?380纳米的紫外区,最大发射波长在500纳米以上,Stokes位移达250?350纳米,可有效排除各种背景荧光的干扰,增强检测的特异性和灵敏度;(5)、激发波长具有配体(β二酮类配体配合物,羧酸类配体配合物、邻菲咯啉类配合物等)的特性,激发波长随着配体的不同而不同:即随配体的变化而变化;发射波长具有稀土离子(铕、钐、镝和铽)的性质,发射波长不随着配体的变化而变化,而是随着稀土离子的变化而稍有不同。
[0030]本发明中所述的稀土荧光标记的复合微球是标记有稀土荧光络合物的复合微球;复合微球是由苯乙烯聚合而成,并掺杂有机硅烷水解产物;本发明提供的一种稀土荧光标记的复合微球标记物,与常规稀土荧光络合物相比,具有下列优点:(1)、具有更高的荧光强度和更高的稳定性,更易于标记,且制备简单的掺杂有稀土荧光络合物的复合微球标记物;
(2)、其中的稀土荧光络合物是以化学键合的形式掺杂于复合微球的表面。化学键合是在微球形成之后进行的;(3)、能发出稀土离子的特征荧光。标记的稀土荧光络合物可以是4,7_二氯磺基苯-1,10菲咯啉-2,9二羧酸-铕(BCPDA-Eu3+)和4,4,-双(I,I,I,2,2,3,3,-七氟_4,6,-己二酮基)氯磺基-邻-三联苯-铕(BHHCT-Eu3+)的一种或者两种;(4)、其表面带有活性基团,如氨基、羧基、巯基,这些基团是由带有相应基团的有机硅烷引入;(5)、可以用化学键合的作用将生物大分子,如蛋白质、核酸、酶等标记于荧光微球的表面;(6)、可以作为标记物用于免疫检测,核酸探针标记等。
[0031 ]本发明的有益效果:该发明中,所使用的复合微球包含有多个稀土荧光络合物,荧光强度得到极大提高,显著减少了外部条件对荧光的淬灭效应,使稀土荧光络合物的荧光强度得到进一步提高;稀土荧光微球的荧光强度高于单个稀土荧光络合物,这就避免了标记单个稀土荧光络合物时不得不采用多重标记的麻烦。其稳定性高于常规稀土荧光络合物。在其表面引入了活性基团,可以与生物大分子进行方便的交联,合成难度较小,且成本较低。具有常规荧光标记物所不具有的长荧光寿命,又具常规稀土荧光络合物所不具有的尚焚光强度、稳定性和易标记性。
[0032]利用具有长荧光寿命的稀土络合物作为标记物,采用时间分辨检测技术,可以有效克服背景荧光的干扰,可使灵敏度有极大的提高。这种技术被称为时间分辨荧光检测技术,已成为目前生物医学研究和临床生化检测中的常见技术
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