凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒、应用及其制备方法
【专利说明】凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒、应用及其制备方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及一种利用表面引发原子转移自由基聚合法(S1-ATRP)在上转换荧光纳米颗粒表面修饰亲水聚合物，制备新型亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒，并在聚合物层中固定凝集素，应用于体外、体内细胞表面膜糖的原位标记、成像及糖型分析的方法。
【背景技术】
[0003]规模化的蛋白质翻译后修饰研究一直是蛋白质组学研究的重点和热点。在糖基化、磷酸化、甲基化和泛素化等众多的翻译后修饰中，糖基化修饰作为一种重要的修饰方式在细胞的增值、分化、代谢和免疫应答等方面起着重要的作用。美国FDA通过的生物标志物中25%是糖蛋白，目前临床上许多肿瘤诊断分子标志物如CA19-9 (消化道肿瘤)、AFP (肝癌)、CA125(卵巢癌)等均是糖蛋白。在目前已知的糖蛋白中，细胞表面的膜糖蛋白在细胞间的识别、粘附、迁移及癌症转移等过程中都扮演着非常重要的角色。某些关键膜糖蛋白糖基化位点或寡糖链糖型的改变都与一系列重大疾病的发生发展密切相关。通过对膜糖蛋白及其糖链结构与功能的研究，许多糖蛋白或糖链已经成为新药开发的靶点，如目前唯一用于禽流感治疗的药物Tamiflu (达非，罗氏公司产品)就是一种阻止病毒感染宿主细胞膜糖蛋白唾液酸的糖苷酶抑制剂。鉴于膜糖蛋白的糖基化修饰在生理、病理研究中的重要的作用，发展快速、高效的糖蛋白糖型分析技术，实现对不同类型细胞膜糖蛋白糖型的实时、原位、动态分析是十分必要的。然而目前的糖基化修饰研究技术如凝集素芯片、流式细胞仪、生物质谱等均无法实现快速、实时、原位的细胞膜糖糖型分析。基于以上原因我们利用表面引发原子转移自由基聚合反应(Surface Initial Atom Transfer Radical polymerizat1n,S1-ATRP)在上转换荧光纳米颗粒表面修饰亲水聚合物并固定凝集素，制备出新型凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒，应用于细胞表面膜糖糖型的标记、成像及差异分析。分子成像技术作为一种灵敏度高、可靠性强、操作简便的检测手段，被广泛应用于原位、动态、非侵入性的观察体内生物分子或生理过程。上转换(up-convers1n, UC)荧光本质上是一种反斯托克斯发光现象，它是一种发光团通过连续吸收多个低能量光子后激发到电子激发态，继而弛豫发光过程，因此UC材料可以被近红外光(长波长光，通常在1000 nm)激发，发射出可见光(短波长)。这样的光学性质使其具有强大的组织穿透能力，较低的背景荧光，同时对生物样本损伤小，非常适合低丰度生物分子的超灵敏检测。原子转移自由基聚合法(ATRP)是Matyjaszewki K.教授小组于1995年首次提出的一种可控自由基聚合方法。十余年以来得到了国际学术界和工业界的广泛关注。表面引发原子转移自由基聚合法(S1-ATRP)是将ATRP引发剂固定于材料表面后原位引发聚合物生长的一种方法，具有可控性好、分子量分布窄、适用单体范围广、反应条件要求适中等特点，特别适合制备结构规整的聚合物包裹的核壳型纳米颗粒。经S1-ATRP法修饰后，上转换荧光纳米颗粒表面被带有大量功能化位点的亲水聚合物所包裹，在显著提高颗粒生物相容性的同时，可实现三维立体的凝集素固定，有效提高了凝集素的固载量，增强了其对寡聚糖的亲和力和识别特异性，适用于体外、体内不同类型细胞表面膜糖糖型的原位成像和差异分析，为研究糖蛋白糖链改变与疾病发生发展的关系提供了新的技术支持。
【发明内容】
[0004]为克服上述现有技术的不足之处，本发明的目的就是提供一种凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒及其制备方法，以及在体外、体内不同类型细胞表面膜糖的原位标记、成像及糖型识别方法的应用。
[0005]本发明采用的技术方案是:
一种凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤:
1)制备油酸包裹的稀土金属掺杂上转换荧光纳米颗粒；
2)使用一端为羧基，另一端为ATRP引发剂的S1-ATRP引发剂，利用其羧基与油酸的臂交换反应将S1-ATRP引发剂固定在上转换荧光纳米颗粒表面；
3)在单体和催化剂体系存在下，于步骤2)中得到的固定了S1-ATRP引发剂的上转换荧光纳米颗粒表面引发原子转移自由基聚合反应，在其表面原位生成亲水聚合物外壳，其中，所述单体为能用于原子转移自由基聚合的单体，且在所述单体中含有能与待固定的凝集素反应的官能团或在所述单体中含有经化学修饰后能与待固定的凝集素反应的官能团；
4)分为下述a)或b)；
a)步骤3)中所述单体中含有能与待固定的凝集素反应的官能团，使步骤3)中所述聚合物链上的官能团与待固定的凝集素反应，将凝集素连接到所述亲水聚合物侧链上，再将所述亲水聚合物侧链上未与凝集素反应的官能团封闭，得到所述凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒；
b)步骤3)中所述单体中含有经化学修饰后能与待固定的凝集素反应的官能团，将步骤3)中所述聚合物链上的官能团进行化学修饰，使其转变为能与待固定的凝集素反应的官能团，然后再与待固定的凝集素反应，将凝集素连接到所述亲水聚合物链上，再将所述亲水聚合物链上未与凝集素反应的官能团封闭，得到所述凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒。
[0006]进一步，步骤2)中所述的S1-ATRP引发剂是通过羧基的臂交换反应固定在上转换荧光纳米颗粒表面。
[0007]进一步，步骤3)中所述单体为亲水、低毒、非特异性吸附小的单体，为寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(0EGMA)、或其他多羟基化合物、丙烯酸类单体、丁烯酸类单体或戊烯酸类单体。
[0008]进一步，所述步骤4)的b)为将步骤3)中所述聚合物链上的羟基氧化生成醛基，然后与待固定的凝集素反应，将凝集素连接到所述聚合物链上，再将所述聚合物链上剩余的醛基用牛血清白蛋白封闭。
[0009]进一步，步骤3)中所述催化剂体系由催化剂和配体组成；所述催化剂选自下述任意一种金属的齒化物:Cu、Mo ( IV )、Ru、Rh、Fe、Re、N1、Pd和pb,优选氯化亚铜；
所述配体选自下述任意一种:1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺、联吡啶、四甲基乙二胺、1，1，4，7，10，10-六甲基三亚乙基四胺和三(N，N—二甲基氨基乙基)胺；所述单体、催化剂、配体的摩尔比为200: (0.5-5): (0.75-7.5)。
[0010]进一步，所述凝集素具体为刀豆素A (ConA)、麦胚素(WGA)、大豆凝集素(SBA)或花生凝集素(PNA)。
[0011]所述制备方法制备得到的凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒。
[0012]所述的凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒在不同类型细胞表面膜糖的原位标记、成像及糖型识别方法的应用。
[0013]所述的细胞表面膜糖原位标记、成像及糖型识别方法，体外标记及成像包括下述步骤:将凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒加入到培养有不同类型细胞的培养基中，转移至37° C的C02培养箱培养I h后弃去培养基，PBS清洗3次后即可完成膜糖的标记，使用双光子激光共聚焦显微镜对标记的细胞进行观察。
[0014]所述的细胞表面膜糖原位标记、成像及糖型识别方法，体内标记及成像包括下述步骤:准备带有HCCLM3细胞转移瘤的裸鼠，对裸鼠体内转移瘤注射ConA功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒后，在不同时间点对裸鼠使用加装波长980 nm激光系统的小动物成像箱进行观测。
[0015]本发明所提供的凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒可用于体外、体内细胞表面膜糖的原位标记、成像以及糖型分析。以正常肝细胞系(Chang Liver, CL)与具有高转移潜能的肝癌细胞系HCCLM3为例，在体外细胞实验中:将40 μδ/πι1的ConA功能化亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒加入培养有不同类型的肝细胞的培养皿中，在C02培养箱中37°C孵育I h即完成膜糖标记，使用PBS缓冲液清洗非特异性吸附的荧光纳米颗粒后，使用双光子激光共聚焦显微镜对细胞进行成像分析及膜糖糖型差异检测。体内实验中:选取背部接种HCCLM3细胞生成转移瘤的裸鼠作为实验体，使用注射器向瘤内注射40l^g/ml的ConA功能化亲水聚合物包裹上转换突光纳米颗粒50 μ?,对照组注射相同浓度的未连接ConA的亲水聚合物包裹上转换荧光纳米颗粒。采用小动物成像箱对实验动物进行成像分析和转移瘤内细胞表面膜糖糖型的识别。
[0016]以OEGMA为聚合单体，刀豆素A (ConA)为凝集素，采用S1-ATRP法制备凝集素功能化亲水聚合物包裹上转换荧光