一种具有霉菌毒素靶向作用的磁性-荧光功能纳米生物复合物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明材料学、光谱化学、纳米生物传感等领域，特指一种具有霉菌毒素靶向作用的磁性-荧光功能纳米生物复合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]农产品在生长、收割、贮运及加工过程中都易滋生或接触到产毒霉菌，从而导致霉菌毒素(mycotoxins)进入食物链。摄入被霉菌毒素污染严重的农产品和由其加工的食品会产生多种急性中毒症状，如急性呕吐、出血症、多发性神经炎、雌激素亢进等，死亡率极高。需要指出的是，与被细菌毒素污染的食物颜色会变深或散发出难闻的气味不同，被霉菌毒素污染的农产品，在外观及气味上往往没有明显异样，不易被察觉。同时，霉菌毒素是小分子物质，极耐热，毒性不因通常的加热而被破坏，因此可以通过每餐的进食在人体内不断累积而产生慢性中毒，直接促发胆管、食管、胃、肠、肺、肾、肝等脏器肿瘤的发生。研究发现，人类癌症的65%以上是因食物被污染引起的，而霉菌毒素正是推高这一比例的“始作俑者”，其中黄曲霉毒素是世界公认的三大强致癌物质之一，毒性是氰化钾的10倍。因此，研制对霉菌毒素具有靶向识别作用的多功能探针，并探索其在复杂实际样品高灵敏靶向富集检测中的优势，在食品安全与食品质量监测等方面具有十分重要的意义。核酸适配体(Aptamer)是一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，具有与单克隆抗体相媲美的亲和力与特异性。与单克隆抗体相比，apt还具有以下优点:可在体外筛选，分子量较低，靶分子范围广，没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、改造与标记，化学稳定性好，能可逆变性与复性，具有较高的纯度和加工精确性。近年来，一些典型的霉菌毒素，如郝曲霉毒素A(OTA)，黄曲霉毒素BI (AFBI)，黄曲霉毒素Ml (AFM1)，伏马毒素BI (FBI)已经成功筛选出了可以对其高特异识别的Aptamer ο
[0003]量子点(QDs)又称半导体纳米晶，粒径一般在1nm以下，由于其电子和空穴被量子限域，受激后可以发射荧光。同荧光染料相比，量子点的激发光谱宽且连续分布、发射光谱窄而对称，光化学稳定性强，是一类理想的荧光探针。更重要的是，单一种类的量子点就能够按照尺寸变化，产生一个发光波长不同的、颜色分明的标记物家族，已被应用于DNA、疾病标志物、肿瘤细胞等的多组分联合检测。当然，我们也注意到，由于生物样品的复杂性以及待测样品所涉及物质的多样性，量子点荧光探针在实际应用中还受到功能单一性的限制，无法满足目前生物传感体系多任务化的要求。因此，无论是纳米材料基础研究，还是食品安全监管、临床诊断、药物筛选等实际应用领域，都迫切需要将量子点的出色荧光性能与其他功能元素进行有效耦合，发展新型多功能纳米生物探针来打破束缚，拓展和深化纳米科技在适配体传感领域的应用和发展。通常多组分是实现多功能的有效途径，将具有各自功能的不同的单一组分通过某种方式集成在一起，新构建的多组分纳米结构不但可以表现出其各个组分的性质和功能，而且往往可以由于其性质相互作用而表现出单一组分材料所不具备的新功能。磁性-荧光多功能纳米探针在复杂生物样品中特定组分的快速识别、富集、分离及高灵敏检测等领域具有巨大的潜在优势。
[0004]目前已报道的荧光-磁性多功能纳米材料，大多存在稳定性差、不易于修饰、生物相容性差等问题，并且很少用于构建多功能探针并实现食源性霉菌毒素靶向识别。本发明旨在发明一种稳定性好、容易修饰、生物相容性好的磁性-荧光-分子靶向多功能纳米生物复合物，为复杂食品样品中霉菌毒素的高灵敏靶向富集检测提供简便、快捷、可靠的侦检工具。
【发明内容】
[0005]本发明已经考虑到现有技术中出现的问题，旨在发明一种稳定性好、容易修饰、生物相容性好的磁性-荧光-分子靶向多功能纳米生物复合物，为复杂食品样品中霉菌毒素的高灵敏靶向富集检测提供简便、快捷、可靠的侦检工具。解决现有多功能探针所存在的稳定性差、不易于修饰、生物相容性差、不具有霉菌毒素靶向识别作用等难题。
[0006]所采用的方案概括为:首先制备了S12包覆的Fe3O4磁性纳米球，提高Fe3O4纳米球的稳定性和生物相容性；再在S12壳层表面吸附阳离子聚合物，将荷负电的的组装CdTeQDs组装在S12壳层表面制备磁性-荧光双功能纳米球;进一步，将氨基末端的霉菌毒素的aptamer在偶联剂的作用下连接在纳米球制备具有霉菌毒素靶向作用的磁性-荧光功能纳米生物复合物。
[0007]本发明是通过如下具体技术方案实现的:
[0008]一种具有霉菌毒素靶向作用的磁性-荧光功能纳米生物复合物的制备方法，包括如下步骤:
[0009]步骤1、水溶性CdTe量子点(简称为CdTeQDs)水溶液的制备；
[0010]步骤2、Fe304磁性纳米球分散液的制备；
[0011 ] 步骤3、S12包覆Fe304(简称为Fe3O4OS12)磁性纳米球分散液的制备；
[0012]步骤4、CdTe QDs包覆Fe3O4OS12双功能纳米球Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液的制备:取用步骤3中制备的Fe3O4OS12磁性纳米球，向其中加入0.02M NaCl溶解的聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA溶液，进行机械搅拌反应A;将产物磁性分离，水洗，避光自然干燥，将干燥后的产物重新分散在水中，制得I3DDA修饰的Fe3O4OS12纳米球Fe3O4OS12-PDDA分散液;最后，向I3DDA修饰的Fe3O4OS12纳米球Fe3O4OS12-PDDA分散液中加入CdTe QDs水溶液，进行机械搅拌反应B，经磁性分离，二次水洗后，避光自然干燥，将干燥后制得的Fe304@Si02@CdTeQDs重新分散在水中，得到Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液，备用；
[0013]步骤5、Fe304@Si02@CdTe QDs标记的具有霉菌毒素靶向功能的纳米生物复合物分散液的制备:取步骤4制备的Fe3O4OS12OCdTe QDs水分散液，加入1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐EDC水溶液和N-羟基丁二酰亚胺NHS水溶液，振荡反应，随后加入Aptamer储备液，振荡孵育过夜，反应完毕后，离心洗涤，将产物重新分散在Tris-HCl溶液中，制得具有霉菌毒素靶向功能的磁性-荧光功能纳米生物复合物Fe304@Si02@CdTe QDs-Aptamer分散液，备用。
[0014]所述步骤I中，水溶性CdTe QDs水溶液的制备方法为:称取0.0638g碲粉和0.0449g硼氢化钠置入1mL比色管中，加入4mL超纯水，通N2除氧15min后置于4°C冰箱中反应得到碲氢化钠(NaHTe)溶液;将0.1142g CdCl2.2.5H20和75yL巯基丙酸加入到含50mL二次水的三颈烧瓶中，氮气保护下磁力搅拌5min，用2M NaOH调节溶液pH至8.5，迅速加入上述制备的NaHTe溶液2mL，继续搅拌30min，100°C下回流0.5?12h，可分别得到不同粒径的CdTe QDs ；停止反应恢复至室温，加入10mL乙醇搅拌然后静置15min，离心后，避光自然干燥，将沉淀物重新分散得到1mg mL—M^CdTe QDs水溶液，4°C避光保存，备用。
[0015]所述步骤2中，Fe304磁性纳米球分散液的制备方法为:将1mL乙二醇，1mL—缩乙二醇，和0.5536g FeCl3.6H20加入到烧杯中，搅拌30min后，向其中加入1.5g醋酸钠和Ig聚乙二醇并使其分散均匀，随后将其转移至25mL的反应釜中，200 °C下反应2h;冷却后，将混合物移至小烧杯中，磁性分离、乙醇洗涤5次，避光自然干燥，制得浓度为20mg mL—
米球分散液。
[0016]所述步骤3中，Fe3O4OS12磁性纳米球分散液的制备方法为:取步骤2制备的5mLFe3O4纳米球分散液加入到10mL的柠檬酸钠溶液(1M)中，室温下搅拌反应3h，随后70°C下回流2h，磁分离去除清液，得到柠檬酸根修饰的Fe304(C-Fe3O4)；向制得的C-Fe3O4加入0.5mL3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，搅拌反应3h，磁分离去除清液后，加入0.15mL正硅酸四乙酯(TEOS)，1mL氨水(28wt % )和80mL乙醇，机械搅拌12h，磁性分离、水洗，避光自然干燥，将制得的Fe3O4OS12重新分散在二次水中，其质量浓度为1mg mL一、
[0017]所述步骤4中，制备Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液时，所用的Fe3O4OS12分散液、PDDA溶液、CdTe QDs水溶液的体积比为5:50:2;所用的I3DDA溶液的质量浓度为0.4wt%,所制得的Fe3O4OS12OCdTe QDs分散液的浓度为1mg mL—S所述机械搅拌反应A的时间为lh，机械搅拌反应B的时间为3h。
[0018]所述