一类小分子荧光探针及其应用
【专利摘要】一类小分子荧光探针及其应用，所述荧光探针基于TICT机理，具有通式I的结构。本发明所述的小分子荧光探针在PBS缓冲液中背景荧光较弱，在进入人血清白蛋白HSA的疏水空腔后，荧光强度表现出明显的增强。其选择性较好，不受其他常见氨基酸及蛋白质分子的干扰。另外，其与HSA作用后响应时间较短，并且可与HSA的FA1位点特异性结合。在PBS缓冲液中，其荧光强度与HSA的浓度表现出良好的线性关系，对人血清白蛋白HAS可领命检出。在真实尿液的测试环境下，其荧光强度与尿液中白蛋白浓度农杨具有良好的线性关系，因此具有良好的生物应用前景。
【专利说明】
一类小分子荧光探针及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及精细化工领域一类荧光探针、其制备方法和用途，尤其涉及一类基于 TICT机理的小分子荧光探针，制备方法及其在白蛋白标记及定量检测方面的应用。
【背景技术】
[0002] 荧光检测技术具有灵敏度高、选择性好、方法简单、原位和实时检测等优点，已成 为现代生物技术和生命科学研究中必不可少的检测手段。在蛋白质标记技术中，荧光标记 法相对于其他传统标记方法具有明显的优势，越来越引起研究者的关注。
[0003] 人血清白蛋白HSA是血清中含量最多的蛋白质，其在血清中的含量在30-50g/L左 右。由于肾脏的透析作用，尿液中白蛋白的含量在30mg/L以下。白蛋白的生理学功能包括维 持血管的渗透压、均衡营养、运送药物和代谢物。同时，尿液中微量白蛋白的含量与肾脏疾 病和糖尿病有关，可以作为肾脏疾病早期治疗和糖尿病强化治疗的关键指标。因此其在尿 液中的精确检测具有非常重要的生物学和医学意义。
[0004] 荧光成像技术为人们提供了一种选择性好、灵敏度高、检测限低的微量分析技术， 其已被广泛应用于生物大分子如蛋白质、DNA和RNA的分析检测中。文献中已有报道方酸类 染料、B0DIPY类染料和极性敏感探针用于水相中白蛋白的检测。但发现具有良好荧光性质 (如高量子产率、长波长和性质稳定等）、合成简便、可在低浓度下检测白蛋白的荧光探针依 然面临挑战。我们合成了一类基于TICT机理的HSA荧光探针，其在PBS缓冲液中可以实现 0FF-0N的荧光响应。该类探针合成简便，只需一步或两步反应即可得到，因此具有良好的经 济效应。另外，该类探针具有TICT结构，在对HSA内部非极性环境敏感的同时，分子内的自由 转动可被蛋白质空腔所抑制，具有较低的检测限和良好的灵敏度。除此之外，通过引入罗丹 宁吸电子基团，实现了探针对HSA FA1位点的特异性结合，为研究染料与蛋白质结合方式提 供了新的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一类基于TICT机理的小分子荧光探针，可用于水相中人血清白蛋 白HSA的定量检测。
[0006] 本发明首先提供一类小分子荧光探针，具有如下结构通式I:
[0007]
[0008] 通式I中：
[0009] Ri-R?各自独立地选自Η、&-8的烷基、取代或未取代苯基；
[0010] 所述取代苯基由以下基团任意取代 氨基、Cl-6酰胺基、卤素或Cl-6卤代烷基；
[0011] X是氧或硫；
[0012] n选自卜8的整数。
[0013] 另一方面，本发明提供上述小分子荧光探针的制备方法，是在甲苯、醋酸铵和冰醋
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[0014] LL Μ 1 u
[0015] 本发明所述的荧光探针在PBS缓冲液中背景荧光较弱，在进入HSA的疏水空腔后， 具有明显的荧光增强，且其荧光强度与蛋白质浓度具有良好的线性关系，同时对其他大分 子蛋白质及各类氨基酸具有良好的选择性，且不受体内常见阴阳离子的干扰。另外，其与 HSA作用后响应时间较短，并且可与HSA的FA1位点特异性结合。在PBS缓冲液中，其荧光强度 与HSA的浓度表现出良好的线性关系，对人血清白蛋白HAS可领命检出。在真实尿液的测试 环境下，其荧光强度与尿液中白蛋白浓度农杨具有良好的线性关系，因此具有良好的生物 应用前景。鉴于此，本发明再一方面的目的在于提供所述的小分子荧光探针在制备蛋白检 测组合物中的应用。并基于此，提供一种用于白蛋白检测的组合物，该组合物包括上述本发 明的小分子荧光探针。所述组合物尤其适用于人血清白蛋白（HSA)和尿液样品中的微量白 蛋白的检测。
[0016] 本发明所述TICT机理小分子荧光探针具有以下显著的特征：
[0017] (1)在PBS缓冲溶液中几乎无荧光，进入蛋白质空腔后有明显的荧光增强；
[0018] (2)探针在缓冲液中的荧光强度与蛋白质浓度呈现良好的线性关系，可用于白蛋 白的定量检测；
[0019] (3)选择性好，对其他蛋白质和氨基酸几乎无响应；
[0020] (4)可以与白蛋白的FA1位点特异性结合，为研究染料与蛋白质的作用方式提供了 有力的方法；
[0021] (5)合成简便，产品易得。
【附图说明】
[0022]本发明附图8幅，
[0023]图1是性能测定实验1中荧光探针化合物ESI、ES2、ES3对人血清白蛋白（HSA)荧光 滴定实验测试图。探针分子的浓度为5μΜ，测试体系为ros缓冲溶液中（pH=7.4,10mM)，探针 分子ESI的激发波长为474nm，ES2的激发波长为507nm，ES3的激发波长为430nm。
[0024]图2是性能测定实验2中荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白（HSA)和不同氨基酸 选择性实验柱状图。探针分子ESI浓度为5yM，HSA的浓度为5μΜ，其他氨基酸的浓度为50μΜ。 激发波长为474nm，采集547nm处的荧光强度。
[0025]图3是性能测定实验3中荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白（HSA)和不同蛋白质 的选择性实验柱状图。探针分子ESI浓度为5yM，HSA和其他蛋白质的浓度为均为5μΜ。激发波 长为474nm，记录547nm处的荧光强度。
[0026]图4是性能测定实验4中荧光探针化合物ESI与人血清白蛋白HSA结合比例实验图。 固定探针分子ESI与HSA的总浓度为ΙΟμΜ，不断改变探针与HSA的浓度比，分别为1:9、2:8、3: 7、4:6、5:5、6:4、7:3、8 :2、9:1。激发波长为47411111，记录54711111处的荧光强度。
[0027] 图5是性能测定实验5中荧光探针化合物ESI与人血清白蛋白HSA的定位实验图。探 针分子浓度为1〇μΜ，加入2μΜ HSA使其与探针混合lh。取代药物的浓度分别为5，10，15，20， 30,40,60,80μΜ。
[0028] 图6是性能测定实验6中荧光探针化合物ESI与人血清白蛋白HSA复合体系对温度 的响应图。探针分子与HSA的浓度均为5μΜ，温度分别选取20、25、30、35、40、45、50摄氏度。
[0029] 图7是性能测定实验7中荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白HSA的时间响应图。探 针分子的浓度为5μΜ，加入的HSA的浓度为5μΜ。横坐标为时间(min)，纵坐标为荧光强度。
[0030] 图8是性能测定实验8中荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白HSA的检测灵敏度实 验图。探针分子的浓度为5μΜ。图a为PBS缓冲溶液中（pH=7.4,10mM)中探针分子的荧光强度 与HSA浓度之间的线性关系；图b为真实尿液中探针分子的荧光强度与HSA浓度之间的线性 关系。激发波长为474nm，记录547nm处的荧光强度。
【具体实施方式】
[0031] 除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0032] 除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
[0033] 本文中使用的术语"烷基"包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如"丙基"， 则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如"异丙基"，则只特指支链烷基。例如，"Ch烷基" 包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基等。类似的规则也适用于本说明书中使用 的其它基团。
[0034] 本发明所述的小分子荧光探针，具有如下结构通式I:
[0035]
[0036] 通式I中：Ri-R7各自独立地选自H、&-8的烷基、取代或未取代苯基；
[0037] 所述取代苯基由以下基团任意取代:^0)0!1、順2、勵2、0!1、3!1、(： 1-6烷氧基、(：1-6烷基 氨基、Cl-6酰胺基、卤素或Cl-6卤代烷基；
[0038]【具体实施方式】中，所述的心-1?4各自独立地选自!1或(^4的烷基，优选Η或甲基，最优 选Η。
[0039]【具体实施方式】中，所述的R#PR6各自独立地选自&-4的烷基，优选甲基或乙基，最优 选甲基。
[0040]【具体实施方式】中，所述的R7选自!1或&-4的烷基，优选Η或甲基，最优选H。
[0041 ]通式I中，所述的X是氧或硫，优选S。
[0042]通式I中，所述的η选自1-8的整数，优选1-3的整数，尤其优选1或2,最优选1。
[0043]以上所描述的各优选技术特征可以相互组合，所得技术方案应当完全包括于本发 明所述及的范围。
[0044]优选技术特征的组合之实例，为本发明具体的实施方案是之一，本发明所述的小 分子荧光探针，选自如下化合物：
[0045]
[0046] 另一方面，本发明提供所述的小分子荧光探针的制备方法，是在甲苯、醋酸铵和冰 醋酸的混合体系中，通式II的化合物与通式III的化合物反应所得：
[0047]
【具体实施方式】 [0048] 中，所述的化合物II与化合物III的投料摩尔比为0.1-1000:1，优选 为0.5-100:1，更优选0.5-10:1，再优选1-5:1，最佳为1.5:1，二者发生缩合反应，生成结构 通式为I的目标化合物。
[0049] 以上反应可在含水的有机溶剂或无水的有机溶剂中进行。优选为无水的有机溶 剂。有机溶剂包括但不仅限于甲苯、苯、二氯甲烷、四氢呋喃或乙腈等，优选反应溶剂为甲 苯。反应过程通过薄层色谱(TLC)判断反应的终点。
[0050] 上述反应温度为-10°C-150°C，优选lll°c-130°c;反应可选酸性或碱性催化剂为 三乙胺、哌啶、醋酸铵、醋酸钠和冰乙酸，优选催化剂为醋酸铵和冰乙酸混合体系。
[0051] 本发明的小分子荧光染料的提纯方法采用常规方法，没有特别限制。通常，反应结 束后，直接过滤或蒸去溶剂后利用色谱柱分离提纯产物。
[0052] 所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
[0053] 本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法 或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
[0054] 应认识到，本发明化合物中的各种环取代基有一些可在上述步骤进行之前或刚完 成后，通过标准的芳族取代反应来引入或通过常规的官能团修饰来产生，这包括在本发明 的方法步骤方面。这种反应和修饰包括例如取代基通过芳族取代反应的引入、取代基的还 原、取代基的烷基化和取代基的氧化。用于这些过程的试剂和反应条件是化学领域公知的。 芳族取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝基，用例如酰卤和路易斯酸(如三氯化铝)在 Friedel Crafts条件下引入酰基，用烷基齒和路易斯酸(如三氯化错)在Friedel Crafts条 件下引入烷基，和引入卤素基团。修饰的具体实例包括通过例如用镍催化剂进行催化氢化 或者用铁在盐酸存在下进行加热处理，将硝基还原成氨基;将烷硫基氧化成烷基亚磺酰基 或烷基横醜基。
[0055] 本文所述的基于TICT机理的小分子荧光探针在进入白蛋白空腔后有明显的荧光 恢复，可用于尿液中微量白蛋白的定量检测。
[0056]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。
[0057] 实施例1
[0058] 荧光探针化合物ESI的合成：
[0059]
[0060] 将对二甲胺基苯甲醛（1.49g，10mmol)与罗丹宁（1.33g，10mmol)加入装有10mL甲 苯的圆底烧瓶中，再加入200mg醋酸铵和lmL冰乙酸作为催化剂，升温至lj 115 °C回流反应。反 应24h，减压蒸除溶剂，色谱柱分离得到红色固体ESI (78.25% )。咕NMR(500MHz，DMS0-D6)， 5：3.04(s,6H) ,4.27(s,1H) ,6.82(t,J=10Hz,2H),7.42(t,J=10Hz,2H) ,7.53(s,1H)；13C 匪R(500MHz，DMS0-D6)，δ:112.172,117.313,119.757,132.872,133.253,151.759， 169.371,176.645,194.973,105.280ppm；T0F MS:m/z calcd for[M+H]+:265.0469,found: 265.0458.
[0061 ] 实施例2
[0062] 荧光探针化合物ES2的合成：
[0063] j
[0064] 将4-二甲基氨基肉桂醛（1 · 75g，lOmmo 1)与罗丹宁（1.33g，lOmmol)加入装有12mL 甲苯的圆底烧瓶中，再加入200mg醋酸铵和lmL冰乙酸作为催化剂，升温到115°C回流反应。 反应24h，减压蒸除溶剂，色谱柱分离得到深褐色固体ES2(65.46%)。1HNMR(500MHz，DMS0- D6),5：2.99(s,6H),3.10(q,J = 25Hz,lH),6.72(d,J = 5Hz,3H),7.21(q,J = 45Hz,2H) ,7.51 (d，J=10Hz，2H) ;13C 匪R(500MHz，DMS0-D6)，δ:45·75，111·89，112·10，118·48，123·31, 129.41,129.73,130.97,145.41,151.45ppm；T0F MS:m/z calcd for[M+H] +: 291.0626, found :291.0618.
[0065] 实施例3
[0066] 荧光探针化合物ES3的合成：
[0067]
[0068] 将对二甲胺基苯甲醛（1.49g，lOmmol)与2,4-噻唑烧二酮（1.17g，lOmmol)加入装 有10mL甲苯的圆底烧瓶中，再加入200mg醋酸铵和lmL冰乙酸作为催化剂，升温到115°C回流 反应。反应24h，减压蒸除溶剂，色谱柱分离得到黄色固体ES3 (85.60 % )。咕500MHz， DMS0-D6) ,5：3.01(s,6H),6.83(d,J=10Hz,2H) ,7.42(d,J = 5Hz,2H),7.67(s,lH) ,12.31 (s,1H)；13C NMR(500MHz,DMS0-D6),5：110.79,110.91,111.95,120.02,115.63,119.79, 132.10,132.91,133.82,139.29,151.44,167.48,168.llppm；T0F MS:m/z calcd for[M- H] -:247.0541, found:247.0545.
[0069] 实施例4
[0070] 荧光探针化合物ES1、ES2和ES3对人血清白蛋白（HSA)荧光滴定实验
[0071] 将5μΜ小分子荧光探针ES1、ES2和ES3加入到PBS缓冲溶液中（pH=7.4，10mM)，逐渐 加入不同浓度的HSA，如图1所示，la、lb和lc分别为染料ES1、ES2和ES3对血清蛋白HSA的荧 光响应图。三例染料的激发波长分别为474nm、507nm和430nm。随着HSA浓度的增加，探针分 子最大发射峰处的荧光强度逐渐增强。
[0072] 实施例5
[0073]荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白（HSA)和不同氨基酸的选择性实验 [0074]使用上述合成的化合物ESI评价对不同氨基酸的选择性:将5μΜ探针化合物ESI与5 μΜ HSA和50μΜ不同种类氨基酸(谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸、酪氨酸、天门冬氨 酸、天冬酰胺、半胱氨酸和赖氨酸)加入至_S缓冲液中（pH=7.4，10mM)，探针的激发波长为 474nm，选取发射波长为547nm，记录相应的荧光强度变化。测试结果如图2所示，在加入5μΜ 人血清白蛋白HSA后，探针的荧光强度增大72倍，而50μΜ不同种类氨基酸的加入并不会影响 探针的荧光强度。
[0075] 实施例6
[0076] 荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白（HSA)和不同蛋白质的选择性实验
[0077]使用上述合成的化合物ES1评价对不同蛋白质的选择性:将5μΜ探针化合物ES1与5 μΜ HSA和不同种类蛋白质（牛血清白蛋白BSA、糜蛋白酶、蛋白酶、溶菌酶、胰凝乳蛋白酶原 A、血红蛋白和组蛋白）加入到roS缓冲液中（pH= 7.4，10mM)，探针的激发波长为474nm，选取 发射波长为547nm，记录相应的荧光强度变化。测试结果如图3所示，由于具有类似的结构与 生物性质，探针表现出对HSA和BSA的高度选择性，即只有加入HSA和BSA时探针化合物才有 明显的荧光增强。另外，通过比较探针化合物ESI对HSA和BSA不同的荧光响应，我们发现加 入5μΜ HSA后，探针的荧光强度增大60倍，而5μΜ BSA仅能使探针的荧光强度增大6倍，说明 探针化合物ESI对HSA具有更好的选择性。
[0078] 实施例7
[0079]荧光探针化合物ESI与人血清白蛋白HSA结合比例实验
[0080]使用上述合成的化合物ESI验证探针分子与人血清白蛋白的结合比例：Job's plot实验是用于确定两种物质化学计量比的一种方法。在PBS缓冲液(pH = 7.4,10mM)的测 试体系中，固定探针分子ESI与HSA的总浓度为ΙΟμΜ，不断改变探针与HSA的浓度比，分别为 1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6 :4、7:3、8:2、9:1，测试其相应的荧光光谱的变化。如图所示，当探 针分子与HSA的浓度比为5:5时，荧光强度最强，这说明探针分子ESI与HSA是以1:1的比例结 合的。
[0081 ] 实施例8
[0082]荧光探针化合物ESI与人血清白蛋白HSA的定位实验
[0083]使用上述合成的化合物ESI验证探针分子与人血清白蛋白的结合位点：选择四种 不同药物，即华法林、布洛芬、丙泊酚和血晶素作为药物取代实验药物，它们分别可与人血 清白蛋白HSA的FA7、FA3/4和FA6、FA3/4和FA5以及FA1位点结合。在PBS缓冲液(ρΗ=7·4， 10mM)的测试体系中，探针分子浓度为1〇μΜ，加入2μΜ HSA使其与探针混合lh，保证两者的完 全作用。随后向上述超分子体系内加入不同浓度（5，10，15，20，30，40，60，80μΜ)的四种药 物，记录响应的荧光强度的变化。如图5所示，向探针分子与HSA的混合体系内加入不同浓度 的华法林、布洛芬和丙泊酚对混合体系的荧光强度几乎没有影响，而血晶素可明显淬灭体 系的荧光，说明探针化合物ESI与人血清白蛋白HSA是在FA1位点结合的，为研究染料分子与 蛋白质的相互作用提供了新的方法。
[0084] 实施例9
[0085] 荧光探针化合物ESI与人血清白蛋白HSA作用后对温度响应实验
[0086] 使用上述合成的化合物ESI评价探针分子与人血清白蛋白作用后对温度响应实 验。据文献报道，具有TICT性质的分子的荧光强度往往会表现出对温度的敏感性。在PBS缓 冲液(pH=7.4，10mM)的测试体系中，探针分子与人血清白蛋白的浓度均为5μΜ，分别从高到 低和从低到高调整测试体系的温度，选择的温度分别为20、25、30、35、40、45和50摄氏度。由 图6a可知，当温度逐渐升高时，探针分子与蛋白质复合体系的荧光强度逐渐降低，由图6b， 当温度逐渐降低时，探针分子与蛋白质复合体系的荧光强度逐渐升高。
[0087] 实施例10
[0088] 荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白HSA的响应时间测试
[0089]使用上述合成的化合物ESI评价探针分子与HSA作用的响应时间：在roS缓冲液(pH = 7.4，10mM)的测试体系中，探针分子浓度为5μΜ，激发波长为474nm，记录547nm处荧光强度 的变化。由图7可知，在加入5μΜ蛋白质后，探针分子对人血清白蛋白HSA的响应相当迅速，在 10s左右荧光强度即可达到平衡，并在随后的至少60min内保持不变。
[0090] 实施例11
[0091 ]荧光探针化合物ESI对人血清白蛋白HSA的检测灵敏度
[0092]使用上述合成的化合物ESI评价探针分子对HSA的检测灵敏度:首先在PBS缓冲液 (pH = 7.4，10mM)的测试体系中，染料的浓度为1 ΟμΜ，向上述体系分别加入浓度为0.002， 0.004,0.006,0.008,0.013,0.018,0.023,0.028和0.03311^/11^，激发波长为474腦，记录 547nm处的荧光强度变化。如图8a所示，探针的荧光强度随着HSA浓度的增大逐渐增强，且其 荧光强度与人血清白蛋白HSA在0-0.033mg/mL的范围内具有良好的线性关系(R2 = 0.997)。 同时通过3〇/k计算得检测限为0.132mg/L，因此探针分子ESI可用于低浓度HSA的定量检测。 另外，我们也考察了化合物ESI在真实尿液测试体系对HSA的响应情况。我们选用健康男性 志愿者提供的尿液样本，采用临床方法测得该尿液样本中微量白蛋白的含量为〇.〇〇35mg/ mL，并以此为基准，向上述体系中加入ΙΟμΜ探针分子ES1，随后加入不同浓度(0.005，0.01， 0.015,0.025,0.035,0.045 和0.055mg/mL)的 HSA，激发波长为474nm，记录547nm 处的荧光强 度变化。如图8b所示，在真实尿液的测试体系中方，探针分子ESI的荧光强度与人血清白蛋 白HSA的浓度同样具有良好的线性关系(R2 = 0.999 )，说明探针化合物ES 1具有良好的生物 应用。
【主权项】
1. 一类小分子巧光探针，具有如下结构通式I:通式I中： 化-R?各自独立地选自H、打-8的烷基、取代或未取代苯基； 所述取代苯基由W下基团任意取代：CN、COOH、N此、N02、0H、SH、Cl-6烷氧基、Cl-6烷基氨 基、Cl-6酷胺基、面素或Cl-6面代烷基； X是氧或硫； η选自1-8的整数。2. 根据权利要求1所述的小分子巧光探针，其特征在于，所述的Ri-R?各自独立地选自Η 或Cl-4的烷基。3. 根据权利要求2所述的小分子巧光探针，其特征在于，所述的Ri-R4、R7各自独立地选 自Η或甲基。4. 根据权利要求2所述的小分子巧光探针，其特征在于，所述的Rs和R6各自独立地选自 Cl-4的烷基。5. 根据权利要求1所述的小分子巧光探针，其特征在于，所述的η选自1-3的整数。6. 根据权利要求1所述的小分子巧光探针，选自如下化合物：7. 权利要求1所述的小分子巧光探针的制备方法，其特征在于，是在甲苯、醋酸锭和冰 醋酸的混合体系中，通式II的化合物与通式ΠI的化合物反应所得：8. 权利要求1所述的小分子巧光探针在制备蛋白检测组合物中的应用。9. 用于白蛋白检测的组合物，包括权利要求1所述的小分子巧光探针。
【文档编号】C07D277/32GK105838355SQ201610285502
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】杜健军, 朱涛, 彭孝军, 樊江莉
【申请人】大连理工大学