一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用。所述的荧光探针是在药物苏尼替尼上连接荧光分子CY5，保留了原功能分子对肿瘤细胞增殖的抑制作用。该探针对EphrinB2靶蛋白具有高选择识别作用，在647±5nm吸收光照射下，可对EphrinB2受体蛋白细胞高效标记，发出红色荧光信号。作为一种靶向工具分子，可与肿瘤细胞直接作用，在靶向识别领域以及分析药物相互作用，研究药物作用机制方面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。
【专利说明】
一种靶向Ephr i nB2荧光标记分子探针及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的发病率在全世界呈逐年上升的趋势，目前已成为严重威胁人类健康的杀 手。抗肿瘤药物研究是当今生命科学中极富挑战性且意义重大的领域。酪氨酸激酶受体 (RTK)是一个庞大的家族，在生物体的生命活动中担当着非常重要的作用。Eph是属于目前 已知最大的蛋白酪氨酸激酶受体家族(RTKs)亚族，包括Eph受体及其Ephr in配体。EphB4与 EphrinB2在信号传递时表现出独特的方式，可互被对方激活，产生"正向信号"和"反向信 号"，以EphrinB2激活EphB4等信号通路为正向信号，而EphB4激活EphrinB2为反向信号。 EphrinB2可能在VEGF信号通路中扮演一个总调控者的角色，并在血管生长中发挥核心作 用。抗肿瘤药物靶向筛选是新药筛选的一个重要方向和领域。目前，寻找靶标开发抗肿瘤药 物己成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。分子荧光探针广泛用于荧光成像分 析，可用于实时在线检测活细胞受体相互作用，小动物活体成像以及生物大分子结构变化 过程。
[0003] 在肿瘤细胞抑制剂的研发中，尚没有对EphrinB2有一定的抑制作用药物。以 EphrinB2为革E1点，寻找革E1向于肿瘤中EphrinB2的药物会成为研发抗肿瘤药物的重要途径之 一。但是目前没有靶向于肿瘤EphrinB2的对照化合物和药物，亦没有可用于EphrinB2示踪 分析和药物受体相互作用的荧光探针，因此合成制备靶向EphrinB2荧光探针可以广泛应用 于靶向识别领域，在药物受体相互作用分析，药物作用机制方面具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针及其制备方法和应 用，以解决目前没有可用于EphrinB2示踪分析和药物受体相互作用的荧光探针的问题。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一种祀向EphrinB2焚光标记分
子探针，其分子式为C55H67FN7O9S2%结构式如下：
[0008] 所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)N-乙基乙二胺与苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺反应得到中间体1;
[0010] 2)N-B〇C-溴乙胺与中间体1反应得到中间体2;
[0011] 3)中间体2经脱保护反应得到中间体3;
[0012] 4) 5-氟吲哚-2-酮与2，4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸反应得到中间体4;
[0013] 5)中间体4与中间体3经缩合反应得到中间体5;
[0014] 6)中间体5经脱保护反应得到中间体6;
[0015] 7)中间体6与CY5琥拍酰亚胺酯(CY5-SE)缩合得到目标化合物靶向EphrinB2荧光 标记分子探针(记为CY5-SU);
[0016] 其中，中间体1的结构式爻
[0017] 中间体2的结构式为
[0018] 中间体3的结构式为
[0019] 中间体4的结构式为
[0020] 中间体5的结构式为
[0021]中间体6的结构式为
[0022] CY5琥珀酰亚胺酯的结构式为
[0023]所述步骤1)的具体步骤为:氮气保护下，在-40°C的温度下，将苯甲氧羰酰琥珀酰 亚胺的无水二氯甲烷溶液滴加至N-乙基乙二胺的无水二氯甲烷溶液中进行反应，再升至室 温并搅拌反应过夜;反应结束后，将反应液减压浓缩并倒入乙醚和磷酸盐缓冲溶液中，搅拌 后对有机相进行洗涤，合并水相并调节其pH值后进行萃取，将萃取的有机相浓缩至干，得到 中间体1;
[0024]所述步骤2)的具体步骤为：氮气保护下，将N-Boc-溴乙胺加入到含有中间体1、 K2C〇3以及Nal的无水DMF溶液中，室温下搅拌反应，然后将反应液稀释，分出有机相，有机相 经洗涤、干燥后抽滤，滤液减压浓缩至干，残余液经硅胶柱层析分离得到中间体2。
[0025]所述步骤3)的具体步骤为:将Pd/C催化剂加入到中间体2的甲醇溶液中，在室温及 常压下进行氢化反应，反应结束后，对反应液进行抽滤，洗涤滤饼，合并滤液并减压浓缩至 干，得到中间体3;
[0026] 所述步骤4)的具体步骤为:将5-氟吲哚-2-酮、2，4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧 酸和四氢吡咯的乙醇溶液加热回流反应，反应结束后冷却至室温，加入盐酸溶液搅拌并抽 滤，滤饼洗涤、干燥后得中间体4。
[0027]所述步骤5)的具体步骤为:氮气保护下，将中间体4、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和三乙胺加入到无水DMF中，室温下搅拌反应，然后加 入中间体3的无水DMF溶液并继续在室温下反应，反应结束后对反应液进行减压浓缩，残余 液经硅胶柱层析分离纯化后得中间体5;
[0028]所述步骤6)的具体步骤为:氮气保护下，将中间体5悬浮于无水二氯甲烷中，冰浴 下加入三氟乙酸，随后撤去冰浴于室温下搅拌反应，反应结束后将反应液减压浓缩至干，得 到中间体6。
[0029]所述步骤7)的具体步骤为:氮气保护下，将中间体6、CY5琥珀酰亚胺酯(记为CY5-SE，通过购买得到)和N，N-二异丙基乙胺依次加入到无水DMF中，室温下黑暗避光反应，反应 结束后，反应液经C18反相柱分离纯化，收集的产物组分经冷冻干燥后得到目标化合物靶向 EphrinB2荧光标记分子探针(记为CY5-SU)。
[0030] 所述的革E1向EphrinB2焚光标记分子探针在筛选革E1向EphrinB2的药物方面的应用。
[0031 ] 所述的革E向EphrinB2焚光标记分子探针在药物与EphrinB2或EphB4受体相互作用 研究以及药物调控EphrinB2/EphB4信号通路分析检测方面的应用。
[0032]所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在动物模型活体成像、实时检测活细胞受 体相互作用以及生物大分子结构变化过程方面的应用。
[0033] 所述的革E1向EphrinB2焚光标记分子探针在抑制高表达EphrinB2受体的细胞增殖 方面的应用。
[0034]相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0035] 本发明通过分子设计，提供了一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针，记为CY5-SU， 并分析考察了该探针对肿瘤细胞的直接作用，通过其荧光性能的变化，综合分析了该探针 和EphrinB2受体相互作用以及对EphrinB2信号通路调控作用。本发明提供的革E1向EphrinB2 荧光标记分子探针是在药物苏尼替尼上连接荧光分子CY5,保留了原功能分子对肿瘤细胞 增殖的抑制作用。该探针对EphrinB2革巴蛋白具有高选择识别作用，在647±5nm吸收光照射 下，可对EphrinB2受体蛋白细胞高效标记，发出红色荧光信号。该探针作为一种靶向工具分 子，可与肿瘤细胞直接作用，在靶向识别领域以及分析药物相互作用、研究药物作用机制方 面具有重要的应用价值和广阔的应用前景。本发明解决了目前没有可用于EphrinB2示踪分 析和药物受体相互作用的荧光探针的市场空缺问题，具有重要的应用价值和市场前景。 [0036]本发明提供的靶向EphrinB2荧光标记分子探针可以在药物靶向识别和体内及体 外药物受体相互作用检测等多方个面进行应用，可以用于筛选靶向EphrinB2的药物，可以 用于动物模型活体成像，可以用于药物与EphrinB2或EphB4受体相互作用以及药物调控 EphrinB2/EphB4信号通路方面的分析检测，也可以用于实时在线检测活细胞受体相互作 用、小动物活体成像以及生物大分子结构变化过程。
[0037]本发明经过多次探索，最终确定了靶向EphrinB2荧光标记分子探针的合成路线及 其制备方法，该方法的制备过程及后处理过程简单，收率高，总收率能够达到20%。并且该 方法在制备靶向EphrinB2荧光标记分子探针的过程中得到的中间体5和中间体6具有靶向 EphrinB2作用，能够特异性作用于EphrinB2,可以作为具有新的作用功能的革E1向EphrinB2 候选药物。
【附图说明】
[0038]图1为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)的合成路线图；
[0039] 图2为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)的1H NMR图谱；
[0040] 图3为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)的13C NMR图谱；
[0041 ] 图4为靶向EphrinB2荧光标记分子探针(CY5-SU)与EphrinB2受体相互作用的荧光 图，其中A为荧光分子CY5与EphrinB2受体相互作用的荧光图，B为探针CY5-SU与EphrinB2受 体相互作用的荧光图；
【具体实施方式】
[0042] 本发明提供了一种靶向EphrinB2荧光标记分子探针，记为CY5-SU，该探针具有特 异性靶向EphrinB2的作用，能够与EphB4竞争性结合EphrinB2以及抑制肿瘤细胞的活性，可 以广泛用于药物受体相互作用分析和药物作用机制研究。下面结合具体实施例和附图对本 发明做进一步的详细说明。
[0043]本发明提供的祀向EphrinB2荧光标记分子探针的合成路线如图1所示，具体包括 以下步骤：
[0044] (1)中间体1的合成：
[0045] 氮气保护下，将苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺(2.428,9.71!11111〇1)的-40 1€601^无水二氯 甲烷溶液缓慢滴加至-40 °C的N-乙基乙二胺(0.88g或1.05mL，10.0 mmol)的60mL无水二氯甲 烷溶液中，滴毕，维持-40°C继续反应3小时，随后使反应溶液缓慢升至室温并搅拌过夜。将 反应液减压浓缩至约20mL，将残余液缓慢倾入200mL的乙醚和300mL的pH~3的磷酸盐缓冲 溶液中，搅拌片刻后，有机相再经100mL的pH~3的100mM磷酸盐缓冲溶液分别洗涤三次，合 并水相，用1M的氢氧化钠水溶液调pH值至11，随后由200mL乙酸乙酯分别萃取三次，合并有 机相，经无水硫酸钠干燥后抽滤，滤液减压浓缩至干，得到无色油状的液体，即中间体1 (1.56g,72.4%)〇
[0046] 4^^(40010^,00(:13)3:7.32-7.15(111,510,5.83(1^8,110,5.00(8,210,3.24-3.06(m,2H),2.63(t,J = 5.7Hz,2H),2.53(q,J = 7.0Hz,2H),0.99(t,J = 7.0Hz,3H)；13C NMR (100MHz , αχη3)δ:156.54,136.58,128.29,128.03,127.89,127.83,66.33,48.57,43.48， 40.50,14.8〇
[0047] (2)中间体2的合成：
[0048] 氮气保护下，将N-Boc-溴乙胺（10 lmg，0· 45mmo 1)加入到含有中间体1 (1 OOmg， 0 · 45mmo 1)，K2CO3 (93 · 3mg，0 · 68mmo 1)以及催化量的Nal (1 Omg)的 1 · 5mL无水DMF溶液中。室温 搅拌12小时后，将反应液用20mL的乙酸乙酯和15mL的水稀释，搅拌片刻后，分出有机相，并 先后由15mL的饱和碳酸氢钠水溶液和20mL的食盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥后抽滤， 滤液减压浓缩至干。残余液经硅胶柱层析（10 X2cm，洗脱液:石油醚/乙酸乙酯1:1)分离纯 化后得到无色油状液体，即中间体2 (93mg，56.6 % )。
[0049] 4 NMR(400MHz，CDCl3)S:7.36-7.21(m，5H)，5.34(br s，lH)，5.05(s，2H)，4.89(br s，1Η)，3·24-3.14(m，2H)，3.13-3.02(m，2H),2.54-2.39(m，6H)，1.36(s，9H)，0.93(t，J= 7.0Hz,3H)；
[0050] 13C 匪R(100MHz，CDC13)δ:156.61,156.19,136.74,128.49,128.16,128.05， 79.14，66.61，52.98，52.89，47.47，38.88，38.51，28.43，11.64。
[0051] (3)中间体3的合成：
[0052] 将10 · Omg的10 % Pd/C加入到中间体2 (90 · Omg，0 · 25mmo 1)的5mL甲醇溶液中，室温 常压氢化反应12小时后，反应液经硅藻土抽滤，5mL甲醇洗涤滤饼，合并滤液并减压浓缩至 干得无色油状液体，即中间体3 (56.3mg，99.0 % );
[0053] 4 Mffi(400MHz，CDCl3)S:5.14(br s，lH)，3.13-3.02(m，2H)，2.90-2.75(m，2H)， 2.69(t ,J = 5.9Hz,2H),2.50-2.40(m,6H),1.36(s,9H),0.93(t ,J = 7.1Hz,3H)；
[0054] 13C 匪R(100MHz，CDC13)S:156.13,78.92,52.94,47.59,39.42,38.53,28.36, 22.18,11.55.
[0055] (4)中间体4的合成：
[0056] 将5-氟吲哚-2-酮（1 · 51g，10 · Ommol)，2，4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸 (1 · 67g，10 · Ommol)和四氢吡咯（1 · 42g，1 · 66mL，20 · Ommol)的120mL乙醇溶液加热回流反应3 小时，冷却至室温后，加入36mL的1M盐酸溶液，搅拌片刻后抽滤，先后经20mL乙醇和20mL的 石油醚洗涤滤饼，滤饼干燥后得黄色粉末状固体，即中间体4(2.95g，98.2% )。
[0057] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0-d6)5： 13.78(br s , 1H) , 10.85 (br s , 1H), 7.66 (d , J = ΙΙ.0Hz,ΙΗ) ,7.64(s,lH) ,6.86(t ,J = 8.0Hz,lH) ,6.78(dd ,J = 8.3,4.5Hz,lH) ,2.47(s, 3H),2.45(s,3H)；
[0058] 13C 匪R(100MHz,DMS〇-d6)S:169.60(s), 166.00(s), 158.27((1,\Κ(：，Ρ) = 233Ηζ)， 140.86(s)，134.74(s)，133.42(s)，127.03(d，3J(C，F)=9.6Hz)，126.09(s)，124.66(s)， 115.65(d，4J(C，F) = 3.1Hz)，114.41(s)，112.64(d，2J(C，F) = 24.6Hz)，110.05(d，3J(C，F) = 8.2Hz),106.11(d,2J(C,F) = 25.4Hz),14.52(s),11.49(s)〇
[0059] (5)中间体5的合成：
[0060] 氮气保护下，将中间体4(71.4mg,0 · 24mmol)，1-羟基苯并三唑（48.2mg, 0 · 36mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（91 · 2mg，0 · 48mmol)和三乙胺 (48 · 2mg，66 · OyL，0 · 48mmol)加入到2 · 5mL的无水DMF中，室温搅拌反应2小时后，将中间体3 (55. Omg，0.24mmol)的0.5mL无水DMF溶液加入并继续室温反应24小时，减压浓缩后，残余液 经硅胶柱层析（10 X 2cm，洗脱液:DCM/MeOH 30:1，随后，DCM/Me0H/Et3N 30:1:0.3)分离纯 化后得黄色粉末状固体，即中间体5( 100mg，81.8% )。
[0061] 4 NMR(400MHz，DMS0-d6)S:13.62(s，lH)，10.83(s，lH)，7.68(dd，J = 9.4,2.4Hz， 1H) ,7.65(s,lH),7.39(t,J = 5.4Hz,lH),6.91-6.83(m,lH),6.79(dd,J = 8.4,4.6Hz,lH), 6.60(tJ = 5.2Hz,lH),3.22(dd,J=12.2,6.2Hz,2H),2.93(ddJ=12.5,6.2Hz,2H),2.49-2.39(m,6H),2.38(s,3H),2.36(s,3H),1.29(s,9H),0.91(t,J=7.0Hz,3H)；
[0062] 13C 匪R(100MHz,DMS〇-d6)S:169.60(s), 164.65(s), 158.26((1,\Κ(：，Ρ) = 233Ηζ)， 155.66(s) ,136.59(s) ,134.52(s) ,130.31 (s)，127.19((1,3J(C，F) = 9.5Hz)，125.82(s)， 124.91(s)，120.81(s)，114.56(d，4J(C，F) = 3.0Hz)，112.39(d，2J(C，F) = 24.0Hz)，110.05 (d,3J(C,F)=8.7Hz),105.91(d,2J(C,F) = 25.6Hz),77.50(s),52.67(s), 47.29(s) ,38.38 (s),37.11(s),28.24(s),13.37(s),11.87(s),10.62(s)〇
[0063] (6)中间体6的合成：
[0064] 氮气保护下，将中间体5(50mg，97.4μπι〇1)悬浮于2mL的无水二氯甲烷中，冰浴下加 入1. OmL三氟乙酸，随后撤去冰浴于室温搅拌反应2小时，反应液减压浓缩至干，并分别经 2mL的甲苯和2mL的二氯甲烷减压蒸馏至干得到黄色粉末状固体，即中间体6(49.7mg， 100%)〇
[0065] ΧΗ NMR(CD30D)5：13.12(s,1H) ,6.89(s , lH), 6.82(dd ,J = 8.8,1.9Hz , lH) ,6.50-6.35(m,2H),3.56-3.46(m,2H),3.45-3.36(m,2H),3.31-3.13(m,6H),2.09(s,3H),2.06(s, 3H),1.16(t ,J = 7.0Hz,3H)；
[0066] 13C NMR(100MHz,CD30D)S :171.19(s), 169.65(s), 160.22((1, J = 236.4Hz) ,138.94 (s),135.68(s),131.27(s),128.34(d,J = 9.1Hz),127.47(s),124.49(s),l18.70(s), 117.07(d, J = 3.3Hz) , 113.64(d, J = 24.3Hz) , 111 .04(d, J = 8.1Hz) , 106.09(d, J = 25.6Hz)，54.38(s)，50.60(s)，36.14(s)，35.20(s)，13.79(s)，11.00(s)，9.13(s)。
[0067] (7)荧光探针CY5-SU的合成：
[0068] 氮气保护下，将中间体6 (20mg，39 · Ομπιο 1)，CY5-SE (29 · 4mg，39 · Ομπιο 1)和N，N-二异 丙基乙胺(20.2mg或25.8yL，156. Ομπιο?)依次加入到1.5mL的无水DMF中，室温黑暗避光反应 24小时，反应液经C18反相柱（250 X 10mm)分离纯化，分离条件:0~45min下，经梯度1 % - 65 %乙腈的0.1 % TFA水溶液为流动相，吸收波长260nm，流速3.5mL/min，收集33.7min吸收 峰，收集液经冷冻干燥后得到紫色粉末状固体，即为靶向EphrinB2荧光标记分子探针0￥5_ SU(25 · Omg，60 · 9% )，其1Η和13C谱见图2和图3。
[0069] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0-d6)5：13.75(s,lH),10.91(s,lH),9.43(br s,1H),8.32(t,J = 12.0Hz,2H) ,8.15(t,J = 5.1Hz,lH) ,7.84(s,3H),7.75(dd,J = 9.3,2.3Hz,lH) ,7.71(s, lH),7.66(d ,J = 8.1Hz,2H),7.30(t ,J = 8.4Hz,2H),6.96-6.88(m,lH),6.87-6.82(m,lH), 6.54(t,J=12.2Hz,1H),6.26(t,J=12.6Hz,2H),4.46-4.26(m,4H),4.18-4.00(m,4H), 3.68-3.50(m,2H),3.44-3.34(m,2H),3.23-3.12(m,2H),2.46(s,3H),2.44(s,3H),2.08(t, J = 6.4Hz,2H),l. 73-1.59(m,14H),l. 55-1.45(m,2H),l. 34-1.17(m,9H)；
[0070] 13C NMR(100MHz,DMS0-d6)5： 173.18(s),172.84(s),172.71(s),172.05(s), 169.58(s),165.85(s),158.26(d,J=234.4Hz),154.49(s),154.22(s),144.99(s),144.66 (s),142.27(s),141.62(s),140.74(s),140.56(s),137.14(s),134.64(s),130.41(s), 127.06(d,J=9.5Hz),126.16(s),125.91(s),124.83(s),120.00(s),119.95(s),119.36 (s) ,115.17(d,J = 3.1Hz) ,112.59(d,J = 23.4Hz) ,110.22(s) ,110.09(d,J=10.5Hz), 106.07(d,J=25.3Hz),103.48(s),103.44(s),103.31(s),103.28(s),51.51(s),51.34 (s),48.98(s),48.87(s),47.79(s),45.78(s),34.88(s),34.19(s),33.64(s),27.10(s), 26.97(s),26.67(s),25.62(s),24.59(s),21.10(s),18.07(s),16.73(s),13.60(s),12.13 (s)，10.75(s)，8.55(s)。
[0071 ] 下面对本发明制得的革El向EphrinB2焚光标记分子探针CY5-SU对EphrinB2受体革巴 向性和荧光可视化检测的实验过程及实验结果进行说明。
[0072] (1)荧光探针CY5-SU与EphrinB2受体的相互作用
[0073] 将对数生长期的高表达EphrinB2受体的EphrinB2/HEK293细胞，用0.25%胰蛋白 酶溶液消化得到细胞悬液，细胞计数后，接种于Gass bottom microwell disks中，细胞悬 液体积为KOyL/disk。每组设3个平行孔，于37°C，5%C02培养箱培养24h。待细胞贴壁后，吸 弃孔内培养基，PBS缓冲溶液洗3次，加入25uM的CY5和CY5-SU，于37 °C恒温培养箱共孵育lh， 2h，4h IBS缓冲液洗3次，同时加入2.5uM Hoechst33258染色液，染色20min，荧光显微镜拍 照。结果如图4所示，其中图4A表明CY5和EphrinB2/HEK293细胞没有结合，仅能观察到高表 达EphrinB2/HEK293细胞的绿色荧光，而从图4B中可以看出CY5-SU能够明显的结合于 EphrinB2/HEK293,呈现红色的荧光。说明CY5-SU能够与EphrinB2/HEK293细胞膜受体 EphrinB2 结合。
[0074] (2)CY5-SU对EphrinB2受体亲和作用分析
[0075] 将对数生长期的高表达EphrinB2受体的EphrinB2/HEK293细胞，用0.25%胰蛋白 酶溶液消化得到细胞悬液EphrinB2/HEK293,制备EphrinB2/HEK293细胞膜Seoul固定相，同 时制备HEK293细胞膜色谱固定相。然后制备EphrinB2/HEK293，HEK293细胞膜色谱柱:将静 置过夜的细胞膜固定相悬液祸旋混勾，转移至10mL eppendorf管中，4°C条件下2000rpm离 心lOmin，弃上清，沉淀加入约5mL生理盐水祸旋混勾，重复上述操作2次，去除未包裹在硅胶 上的细胞膜，向沉淀中加入约5mL生理盐水涡旋混匀，将其倒入事先冲洗过的装柱机中，流 动相为水，流速为2. OmL/min，装柱时压力不超过lOMPa，装柱时间5min，将装填好的细胞膜 色谱柱装入液相色谱仪中使用，或置于生理盐水中4°C冰箱保存备用。色谱条件:EphrinB2/ HEK293、HEK293细胞膜色谱柱（10 X 2. Omm I. D. 5μπι);流动相：5mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PH =7.4);柱温:37°C ;流速:0.2mL/min;检测器:SPD-M20A二极管阵列检测器;进样5yL。分析 前先进行系统平衡，再进样分析。实验结果表明CY5-SU与HEK293细胞膜色谱柱中的保留相 比，能够在EphrinB2/HEK292细胞膜色谱柱中有更好的保留特性，说明CY5-SU与EphrinB2具 有更好的亲和性。
[0076] (3)CY5-SU 对 EphrinB2/HEK292细胞生长抑制作用
[0077] 将对数生长期的肝癌细胞SMMC7721，knockdown EphrinB2的肝癌细胞SMMC7721， EphrinB2/HEK29，HEK293细胞，用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，接种于96孔板中（4 X 104个/ 孔），细胞悬液体积为180yL/孔。每组设5个平行孔，于37 °C，5 %⑶2培养箱中培养。24h细胞 贴壁后，实验组加入CY5-SU 20yL/孔，阴性对照组加入无血清培养基20yL/孔，作用48K200 yL移液枪小心吸弃孔板内培养基，加入200yL 0.5mg/mL ΜΤΤ/孔，37 °C孵育4h。吸弃孔板内 液体，加入DMS0 150μ!7孔，将孔板置于脱色摇床上充分振荡15min，用酶联免疫检测仪于 490nm波长下测定各孔吸光度值，计算细胞活力。实验结果表明，相比较EK293细胞，CY5-SU 对高表达EphrinB2受体的EphrinB2/HEK29细胞活性具有较好的抑制作用；同时对于肝癌细 胞SMMC7721，CY5-SU呈现出较好的抑制作用，同时CY5-SU对knockdown EphrinB2的肝癌细 胞SMMC7721抑制作用明显低于野生型SMMC7721。
[0078]以上实验说明本发明制得的靶向EphrinB2荧光标记分子探针CY5-SU能够靶向于 EphrinB2受体，具有较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用。因此本发明制得的靶向EphrinB2荧 光标记分子探针在靶向识别领域以及分析药物相互作用、研究药物作用机制方面具有重要 的应用价值和广阔的应用前景。
【主权项】
1. 一种革E向Ephr inB2焚光标记分子探针，其特征在于:其分子式为C55H67FN7〇9S2+，结构 式如下： .1~2. 权利要求1所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： 1. N-乙基乙二胺与苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺反应得到中间体1; 2. N-Boc-溴乙胺与中间体1反应得到中间体2; 3) 中间体2经脱保护反应得到中间体3; 4) 5-氟吲哚-2-酮与2，4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸反应得到中间体4; 5) 中间体4与中间体3经缩合反应得到中间体5; 6) 中间体5经脱保护反应得到中间体6; 7) 中间体6与CY5琥珀酰亚胺酯缩合得到目标化合物靶向EphrinB2荧光标记分子探针；3. 根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征 在于:所述步骤1)的具体步骤为:氮气保护下，在-40°C的温度下，将苯甲氧羰酰琥珀酰亚胺 的无水二氯甲烷溶液滴加至N-乙基乙二胺的无水二氯甲烷溶液中进行反应，再升至室温并 搅拌反应过夜;反应结束后，将反应液减压浓缩并倒入乙醚和磷酸盐缓冲溶液中，搅拌后对 有机相进行洗涤，合并水相并调节其pH值后进行萃取，将萃取的有机相浓缩至干，得到中间 体1; 所述步骤2)的具体步骤为:氮气保护下，将N-Boc-溴乙胺加入到含有中间体1、K2C03以 及Nal的无水DMF溶液中，室温下搅拌反应，然后将反应液稀释，分出有机相，有机相经洗涤、 干燥后抽滤，滤液减压浓缩至干，残余液经硅胶柱层析分离得到中间体2。4. 根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征 在于:所述步骤3)的具体步骤为:将Pd/C催化剂加入到中间体2的甲醇溶液中，在室温及常 压下进行氢化反应，反应结束后，对反应液进行抽滤，洗涤滤饼，合并滤液并减压浓缩至干， 得到中间体3; 所述步骤4)的具体步骤为:将5-氟吲哚-2-酮、2，4-二甲基-5-醛基-1H-吡咯-3-羧酸和 四氢吡咯的乙醇溶液加热回流反应，反应结束后冷却至室温，加入盐酸溶液搅拌并抽滤，滤 饼洗涤、干燥后得中间体4。5. 根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征 在于:所述步骤5)的具体步骤为:氮气保护下，将中间体4、1_羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和三乙胺加入到无水DMF中，室温下搅拌反应，然后加入 中间体3的无水DMF溶液并继续在室温下反应，反应结束后对反应液进行减压浓缩，残余液 经硅胶柱层析分离纯化后得中间体5; 所述步骤6)的具体步骤为：氮气保护下，将中间体5悬浮于无水二氯甲烷中，冰浴下加 入三氟乙酸，随后撤去冰浴于室温下搅拌反应，反应结束后将反应液减压浓缩至干，得到中 间体6。6. 根据权利要求2所述的所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针的制备方法，其特征 在于:所述步骤7)的具体步骤为:氮气保护下，将中间体6、CY5琥珀酰亚胺酯和N，N-二异丙 基乙胺依次加入到无水DMF中，室温下黑暗避光反应，反应结束后，反应液经C18反相柱分离 纯化，收集的产物组分经冷冻干燥后得到目标化合物靶向EphrinB2荧光标记分子探针。7. 权利要求1所述的革向EphrinB2焚光标记分子探针在筛选革E1向EphrinB2的药物方面 的应用。8. 权利要求1所述的祀向EphrinB2焚光标记分子探针在药物与EphrinB2或EphB4受体 相互作用研究以及药物调控EphrinB2/EphB4信号通路分析检测方面的应用。9. 权利要求1所述的靶向EphrinB2荧光标记分子探针在动物模型活体成像、实时检测 活细胞受体相互作用以及生物大分子结构变化过程方面的应用。10. 权利要求1所述的祀向EphrinB2焚光标记分子探针在抑制高表达EphrinB2受体的 细胞增殖方面的应用。
【文档编号】G01N21/64GK106047338SQ201610454368
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】张彦民, 陈胜昔, 白晓光, 马维娜, 代秉玲, 张东东, 展颖转
【申请人】西安交通大学