专利名称：氧指示器及包装体的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用酶的氧指示器及具备该氧指示器的包装体。
背景技术：
现有的饮食生活方式中，是在超市等购进食品原料，各家庭中将其购进的食品原料进行烹调食用，在这样的生活方式基础上，最近又增加了这样一种生活方式，由于为工作而没有烹调时间、想要多一点自己的娱乐时间等原因，从而想简单地进行家务的意向考虑，就烹调而言，一般购进在超市等的加工厂和中央厨房等烹调过的方便食品，在家食用。
另一方面，在超市和便利店的方便食品中，为了方便食品的销售便利，正在开发各个食品的口味、数量等，适合消费者的喜好的商品，有很多种类的食品正在投放市场。另外，超市和便利店等的调理食品(惣菜)销售商为了响应消费者的强烈要求，提供本身美味及安心·安全·健康的原材料，正在探索提供消减食品防腐剂等的调理食品等。但是，一旦消减食品防腐剂，食品则很快就会开始腐烂，因此必须采取食品的安全对策。另外，从关于食品腐败的研究可知，空气中的氧是重要的影响因素。因此，研究了在使包装体内无氧的状态下进行包装的种种方法。为了防止食品腐败，将包装体内保持在无氧状态的方法例如有使包装体内呈真空状态下包装的真空包装、在包装体内使用氧吸收剂的无氧包装、将包装体内用所希望的气体密封的气体置换包装。
例如，真空包装时，由于包装体内呈真空状态，所以可以防止由氧引起的食品的氧化等腐败，另外，包装体内是否保持真空，可以通过目测包装体内是否有空气流入而比较容易地进行判定。另外，真空包装在保存、陈列放置方面是有利的，多用于必须较长期保存的场合。但是，为了使包装体内形成真空，采取通过大气压将食品密封于薄膜等的包装方式，存在不能赋予丰满感，食品的形态变形等美观性方面的问题。
另一方面，在包装体内使用氧吸收剂，或者用具有氧吸收层的包装材料包装的方法和将包装体内用所希望的气体密封的气体置换包装的方法，可以不用大气压挤碎食品，直接以制作的食品的形状展示。因此，这些方法的优点在于使商品看起来美味、即通过所谓的展示效果达到商品的差别化。因此，对于保质期从数日到一个月以内的较短时间的商品，主要进行用氧吸收的无氧包装和气体置换包装的研究。
但是，在通过吸收氧进行无氧包装，或者将包装体内用所希望的气体密封的方法(气体置换包装)中，难以目测包装体内的气体环境，判断包装体内是否在合适的气氛下保存。因此，正在探索包装体内的气氛是否合适的判别方法。特别希望开发检测有无对食品腐败带来很大影响的氧的氧指示器。
作为这样的氧指示器，在例如特开昭54-138489号公报(专利文献1)中，公开了脱氧指示器，其由亚甲蓝、糖类、碱性物质、水分及抗坏血酸组成，有氧时，利用氧指示器中的水分中溶解的氧氧化亚甲蓝显示蓝色，无氧时，用碱性糖溶液还原亚甲蓝显示无色。另外，在例如特表2001-503358号公报中，公开了氧指示器，其氧化还原着色指示部件通过酶等适当选择的催化剂，与氧反应而变色。这些氧指示器具有密封在包装容器内的结构，或者一部分从容器外侧贴附在由氧气透过性部位构成的包装容器的所述部位上的结构，其优点在于，可以通过亚甲蓝和其它氧化还原着色指示部件的变色，目测确认包装容器内部有无氧。
但是，用专利文献1代表的由亚甲蓝、糖类、碱性物质及水分组成的氧指示器，在包装体内存在二氧化碳的情况下，例如，从食品保存的观点考虑，使用惰性的氮气及有抑菌作用的二氧化碳的混合气体包装的气体置换包装的情况下，由于二氧化碳在水中的溶解性比氧高，其溶解于氧指示器内的水分，使pH发生变化，因此存在失去还原亚甲蓝的作用，色彩变化不明确的问题。另外，根据情况，即使是无氧状态，由于二氧化碳的影响，也会存在亚甲蓝显示蓝色做出有氧的误判断的问题。而且，从抑菌、杀菌效果方面考虑，在气体置换包装中使用醇时，由于该醇的存在的影响，还存在检测氧的能力下降的问题。这样的使用亚甲蓝的氧指示器，只能用于二氧化碳和醇不存在或其浓度非常低的场合，必然受到种种限制。而且，由于有无氧的判断依存于亚甲蓝自身的氧化还原，故灵敏度过于敏感，存在难以将变色的氧浓度阈值的设定和变色速度等进行所希望的设定的问题。另外，亚甲蓝以外的色素，从稳定性和耐候性方面考虑也存在难以使用等的问题。另外，由于含有碱性物质，因此误饮误食时会给人体带来危险，也存在着问题。
利用氧反应的专利文献2记载的氧指示器，即使在包装体内存在二氧化碳的气体置换包装的情况下，通过缓冲液的存在，可以缓冲pH的变化降低对氧检测的影响。但是，由于有时氧检测的灵敏度迟钝，酶自身的稳定性欠缺，因此，随着时间的推移，色彩变化不明确，有时氧检测能力下降，或者根据情况即使有氧侵入也会做出是无氧状态的误判断，存在问题。
特别是近年来，超市和便利店等的调理食品销售商探索提供原材料其本身具有美味，消减食品防腐剂等健康型的调理食品等的提供。但是，一旦消减食品防腐剂，食品很快就会开始腐败，必须采取食品的安全措施，因此，作为在不使用食品防腐剂等添加物的条件下提高食品保存性的手段，研究了气体置换包装。所谓的气体置换包装，是指将包装体内用惰性气体氮气、氩气等密封，以抑制由氧引起的食品氧化劣化的方法。从防止食品的微生物学污染的观点可知，在该气体置换技术的基础上，以抑制微生物等的繁殖、杀菌为目的将其它气体混合到惰性气体中。作为抑制微生物等的繁殖使用的气体和杀菌使用的气体的具体例，从低成本、食品安全方面考虑，例如有二氧化碳和醇等。二氧化碳主要具有抑制微生物繁殖的抑菌作用，醇主要具有微生物的杀菌作用。在近年的气体置换包装中，从食品的安全性方面考虑，多使用惰性气体、二氧化碳等微生物繁殖抑制气体、醇等微生物杀菌气体混合的气体组成。因此，期望即使是这样的惰性气体、二氧化碳等微生物繁殖抑制气体、醇等微生物杀菌气体的混合组成也可以使用的氧指示器。
专利文献1特开昭54-138489号公报专利文献2特表2001-503358号公报发明内容本发明的课题在于，提供氧指示器，即使在二氧化碳和醇存在的环境中，其也可以确定地、且长期稳定地高灵敏度检测判断氧的有无。另外本发明的课题还在于，提供包装体，其容器内或袋子内的气体组成被控制，具有即使在二氧化碳和醇存在的环境中也能确定地检测氧的有无的使用酶的氧指示器。
本发明者为了解决上述课题，专心致志地反复进行研究，结果完成了本发明。
也就是，本发明如下所述。
(1)氧指示器，利用基质在氧的存在下通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应，其含有至少包含显色基质、氧化还原酶和用于还原被氧化的显色基质的还原剂的氧敏感性溶液。
(2)氧指示器，利用基质在氧的存在下通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应，其含有至少包含显色基质、氧化还原酶和酶稳定剂的氧敏感性溶液。
(3)氧指示器，利用基质在氧的存在下通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应，其含有至少包含显色基质、氧化还原酶、酶稳定剂和用于还原被氧化的显色基质的还原剂的氧敏感性溶液。
(4)如上述(1)或(3)记载的氧指示器，其中所述还原剂是一旦被氧化就生成二硫基的含巯基化合物。
(5)如上述(2)或(3)记载的氧指示器，其中所述酶稳定剂是0.2wt％水溶液的表面张力为0.06N/m或其以下的非离子性化合物。
(6)如上述(5)记载的氧指示器，其中所述非离子性化合物是水溶性聚合物。
(7)如上述(6)记载的氧指示器，其中所述水溶性聚合物是水溶性聚乙烯醇类、水溶性聚丙三醇类或水溶性纤维素衍生物。
(8)如上述(5)～(7)任一项记载的氧指示器，其中氧化还原酶是抗坏血酸氧化酶或胆红素氧化酶。
(9)如上述(1)～(8)任一项记载的氧指示器，其中所述氧敏感性溶液含有缓冲剂。
(10)如上述(1)～(9)任一项记载的氧指示器，其中所述氧敏感性溶液还含有与所述光吸收波长变化反应竞争而与氧进行反应的化合物，或吸附氧的化合物。
(11)含有容器或袋的包装体，通过将上述(1)～(10)任一项记载的氧指示器包含在该容器内或袋内，或通过安装上述(1)～(10)任一项记载的氧指示器堵塞该容器或袋的开孔部，可以检验该容器内或袋内的氧浓度。
(12)如上述(11)记载的包装体，其是真空包装的。
(13)如上述(11)记载的包装体，其为所述容器或袋内填充有不含氧的气体的气体置换包装。
本发明的氧指示器，其具有以下效果即使在利用气体置换包装的二氧化碳和醇存在的环境中，也能确定地、且长期稳定地高灵敏度地通过色彩等的变化检测氧的有无，以及容器内或袋子内的气体组成被控制，即使在二氧化碳和醇存在的环境中也能确定地检测包装体内的氧的有无。
图1是表示本发明的氧指示器制造例的示意性透视图和其A-A’剖面图。
图2是表示本发明的氧指示器制造例的示意性透视图和其B-B’剖面图。
图3是表示本发明的氧指示器制造例的示意性透视图和其C-C’剖面图。
图4是表示本发明的氧指示器制造例的示意性透视图和其D-D’剖面图。
图5是表示本发明的氧指示器制造例的示意性透视图和其E-E’剖面图。
图6是表示图5例示的本发明的氧指示器使用例的示意性透视图。
具体实施例方式
关于本发明，特别以其优选形式为中心进行以下具体说明。
本发明的氧指示器，包括含有显色基质和氧化还原酶和特定的还原剂的氧敏感性溶液、或含有显色基质和氧化还原酶和酶稳定剂的氧敏感性溶液、或含有显色基质和氧化还原酶和酶稳定剂和还原剂的氧敏感性溶液。本发明的氧指示器是通过这些成分的组合，以所希望的氧浓度为阈值判别氧的有无，详细地说，通过色彩变化等检测从无氧状态或低氧状态出现的氧增加。需要说明的是，本发明所述的氧敏感性溶液，是指溶解的显色基质通过酶的催化作用被存在于气氛中的氧氧化，光吸收波长发生变化，由此引起色彩等的变化的溶液。
本发明与专利文献1的现有技术的最大不同点在于，包装体内即使有二氧化碳存在时也不影响氧检测。亦即，专利文献1的氧指示器含有亚甲蓝和糖类和碱性物质，糖类和碱性物质通过其还原作用防止显色性物质亚甲蓝由于溶解于溶液中的氧成为氧化型(显色状态)，使亚甲蓝成为无色的还原型。因此，当溶解于水时显示酸性的二氧化碳存在时，其还原作用减弱，给氧检测带来影响。
与此相反，本发明的特征在于，通过溶解于溶液的氧，利用氧化还原酶的催化作用，显色性物质被氧化，光吸收波长发生变化。因此，即使溶液中有二氧化碳溶解时，也不会给判断氧的有无的酶反应，和用还原剂还原被氧化的显色基质的反应带来影响。
本发明与专利文献1的现有技术的其它不同点在于，本发明中，通过对使用的氧化还原酶及显色性物质的组合进行种种选择，可以利用所希望的光吸收波长变化检测氧的有无。而且，由于酶反应的基质选择性高，因此，通过使用的酶和基质的组合，可以在混合状态下使用数种酶及基质。例如对于一种酶，当将在酶反应中反应必须的氧浓度、反应速度及反应时的色彩全部不同的基质数种混合使用时，可能会发生在某种氧浓度下为黄色、在氧浓度更高时为蓝色等，由氧浓度引起颜色的阶段性变化。另外，也可能发生氧的暴露时间少时呈茶色，氧的暴露时间长时呈红色等，由氧暴露时间引起颜色的阶段性变化。
而且，本发明与专利文献1的现有技术的不同点还在于，在使用于还原被氧化的显色基质的还原剂共存时，通过调节其浓度，或通过调整显色基质和氧化还原酶的浓度，可以对要检测的氧浓度的阈值和光吸收波长的变化速度等进行所希望的设定。
本发明与专利文献2的现有技术的最大不同点在于，该现有技术完全没有考虑酶自身的稳定性，随着时间推移氧检测性能容易降低，与此相对，本发明的特征在于，为了使酶自身稳定化，使特定的还原剂共存，或者使酶稳定剂共存，其效果是酶不迅速失活，可以长期稳定地引起显色基质的光吸收波长变化反应，检测氧。在此所述的特定的还原剂，是指通过氧化生成二硫基的含巯基化合物。该化合物即使在后述的一般还原剂中，也特别具有作为酶稳定剂、或根据酶的不同作为活化剂的作用，在本发明中，作为氧指示器用于长期稳定地保持氧检测能力。
本发明中使用的氧化还原酶，是指从EC1族中选择，在氧分子的存在下对于使和氧不同的基质发生化学变化的反应显示催化作用的酶，或指在酶反应或非酶反应的在生成物和显色基质的反应中显示催化作用的酶。
前者的氧化还原酶，在作为和氧不同的基质使用的显色基质被氧化的反应体系，以及不用那样的显色基质使氧在过氧化氢等的生成物中发生化学变化的反应体系中，使用显示催化作用的酶。
前者的氧化还原酶的例子例如可以举出氧化酶类、黄素单加氧酶类、铜氢化单加氧酶(銅ヒドロモノォキシゲナ一ゼ)类、铁单加氧酶类、二磷酸核酮糖加氧酶类、双加氧酶类等，具体优选例如有儿茶酚氧化酶(ECl.10.3.1)、漆酶(ECl.10.3.2)、胆红素氧化酶(ECl.3.3.5)、抗坏血酸氧化酶(ECl.10.3.3)、3-羟基氨基苯甲酸氧化酶(ECl.10.3.5)、醇氧化酶(ECl.1.3.13)、胆甾醇氧化酶(ECl.1.3.6)、葡糖氧化酶(ECl.1.3.4)等。
作为后者的氧化还原酶，例如可以举出过氧化物酶类等。将该情况下的反应具体例示，例如可以举出，使用由酶反应或非酶反应生成的过氧化氢，通过过氧化物酶(ECl.11.1.7)的催化作用，使显色基质发生呈色反应，或者将作为显色基质的氢供体和色原体组合使用进行偶联，发生呈色反应等。需要说明的是，这些呈色反应没有特别限定，例如使用“高阪著，酶的测定法，p.49～55，医学书院(1982)”中记载的过氧化物酶共轭呈色反应。
在本发明中，通过与使用的显色基质等的组合，可以将从这些氧化还原酶中适当选择的酶单独使用，也可以多种组合使用。上述氧化还原酶中，从通用性和成本方面考虑，更优选胆红素氧化酶(ECl.3.3.5)和抗坏血酸氧化酶(ECl.10.3.3)，从酶的稳定性方面考虑，最优选枝顶孢属(Acremonium spccies)由来的抗坏血酸氧化酶。
氧敏感性溶液中的氧化还原酶的浓度，与单独使用的情况或多种组合使用的情况无关，优选为0.01μg/ml～100mg/ml的范围。一般地，当氧化还原酶溶解于水时，溶液越稀，酶活性越容易下降，而且和其它原料相比其价格昂贵。因此，在本发明中，该浓度如果在该范围，尽管根据使用的氧化还原酶的不同而不同，但是在可以确保比较稳定的保存稳定性的同时，不会出现成本负担的问题。为了调整使用的氧化还原酶的种类和性质、与使用的显色基质等其它原料的浓度的组合、作为原料使用的氧化还原酶的活性、或作为氧指示器时检测的氧浓度阈值和检测所必要的时间等，该浓度可以从上述范围适当选定。从酶自身的保存稳定性和成本方面考虑，该浓度更优选为1～1000μg/ml的范围。
本发明中所述的显色基质，是指在受到酶的催化作用的基质中，作为和氧不同的基质，通过该酶的反应，光吸收波长发生变化，用于氧的检测的化合物。
本发明中所谓的显色，是指物质的光吸收波长的变化，通过氧化还原酶的催化作用显色基质被氧化，化学结构或性质发生变化，由此光学的吸收波长区域发生变化。可以利用的光吸收波长的波长区域，只要是能测定或检出变化了的波长，不管是哪个区域的波长都可以利用。例如，如果在UV区域有变化域，用UV测定装置等检出光吸收波长的变化即可，如果是可见光域(400nm～600nm)，则不用测定波长的机械，目测就能识别色彩的变化。
本发明中所述的光吸收波长变化反应，是指显色基质在氧的存在下，通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应。
作为光吸收波长发生变化的显色基质的化学结构或性质的变化，具体例如有从羟基和氨基等中除去氢、双键的形成、基质之间的集合和偶联、伴随电子移动的电荷的非定域化等种种变化。本发明中通过对使用的显色基质进行种种选择，可以利用所希望的颜色检测氧的有无。这样的显色基质例如有含有羟基、氨基、氰基、羰基等活性比较高的官能团的化合物、氧化还原指示剂、作为氧化还原试剂的苯酚衍生物、苯胺衍生物、甲苯胺衍生物、安息香酸衍生物等。具体例如有对苯二酚、多酚、对苯二胺、花青色素、氨基苯酚、N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、2，4-二氯苯酚、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺基丙基-3，5-二甲基苯胺(MAPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-间甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-磺基丙基-间甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-磺基丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-磺基丙基-3，5-二甲氧基苯胺(DAPS)、N-磺基丙基-3，5-二甲氧基苯胺(HDAPS)、N-乙基-N-磺基丙基-间甲苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-间甲氧基苯胺(ADOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)苯胺(ALOS)、N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-磺基丙基-苯胺(HALPS)、邻联二茴香胺、邻联甲苯胺、3，3-二氨基联苯胺、3，3，5，5-四甲基联苯胺、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲胺基)联苯胺(DA64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲胺基)吩噻嗪(DA67)、3，5-二硝基安息香酸、5-氨基水杨酸、3-羟基氨茴酸、3，5-二氨基安息香酸等，4-氨基安替比林、邻苯二胺、1-氨基-2-萘酚-4-磺酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、2-氨基-8-萘酚-6-磺酸、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙、2-氨基-苯酚-4-磺酸、2，6-二溴-4-氨基苯酚、2，2’-连氮基(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2，2’-ァジノ一ル(3-エチルベンゾチァゾリン-6-スルホン酸)ジァンモニゥム塩)、2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)铵盐(ABTS)、2，6-二氯靛酚、儿茶酚、鞣酸、表儿茶素、表没食子儿茶素等。需要说明的是，想要进一步进行荧光观察时，由于氧化而发出荧光的化合物，例如有高香草酸、4-羟基苯乙酸、酪胺、对甲酚、二乙酰基荧光素衍生物等，想要进行化学发光观察时，例如用邻苯三酚等。在此例示的物质只不过是其中一例，通过酶的催化作用能够明显促进发出荧光的反应的物质全部包含于此。另外，偶联多个化合物，光吸收波长发生变化的也可以。例如有4-氨基安替比林、2，6-二溴-4-氨基苯酚、ABTS等与苯酚衍生物、苯胺衍生物、4-羟基安息香酸衍生物等的组合。
在本发明中，通过与使用的氧化还原酶等的组合，可以单独使用自这些显色基质中适宜选择的基质，也可以多个组合使用。上述显色基质中，从通用性、显色基质自身的稳定性、成本等方面考虑，优选安息香酸衍生物、2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)铵盐(ABTS)、1，2-二羟基苯衍生物、对苯二酚衍生物、1，4-苯二胺衍生物、3-羟基氨茴酸衍生物，从在水中的溶解性等操作方面考虑，最优选2，2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)铵盐(ABTS)。
氧敏感性溶液中的显色基质的浓度，与单独使用的情况和多个组合使用的情况无关，优选为合计0.01～1000mg/ml的范围。在本发明中，该浓度如果在此范围，尽管根据使用的显色基质的不同而异，但可以确定地看出光吸收波长的变化，同时成本的负担也不成问题。为了调整使用的显色基质的种类和性质、与使用的氧化还原酶等其它原料的浓度的组合、作为原料使用的氧化还原酶的吸光度系数、或作为氧指示器时检测的氧浓度阈值和检测所必要的时间、检测时色彩等的色差变化等，该浓度可以从上述范围适当选定。从作为氧指示器时氧检测的易于辨认和成本方面考虑，该浓度更优选为0.1～50mg/ml的范围。
一般在生物化学领域有一个共识，即由于热和pH等的影响，酶的反应活性容易降低，尽管根据酶的种类不同而异，但在长期保存酶时，通常不是以溶液状态，而是以干燥状态直接冷冻保存。但是，在以酶为氧指示器利用时，在进行上述氧检测反应时，必须制成溶液状态的氧敏感性溶液。
在本发明中，作为还原被氧化了的显色基质的还原剂，特别是通过使用由氧化生成二硫基的含巯基化合物，即使以溶液状态也不会发生酶的反应活性的明显劣化，作为制品可以长期地稳定进行氧检测。即使在一般的还原剂中，该化合物尤其具有酶的稳定化剂、或通过酶作为活化剂发挥作用的性质。或者说，在本发明中，通过在氧敏感性溶液中添加酶稳定剂，即使在溶液状态也不会发生酶的反应活性的明显劣化，用作制品可以长期地稳定进行氧检测。使用酶稳定剂，不限于上述特定的还原剂，也可以使用一般的还原剂，因此更优选。
本发明中使用的特定的还原剂，是指由氧化生成二硫基的含巯基化合物。该化合物的巯基(-SH基)氧化变成二硫基(-S-S-基)，由此可以防止酶的活性部位被氧化劣化。另外，通过调整该化合物在氧敏感性溶液中的浓度，可以以所希望的氧浓度为阈值判别氧的有无。该化合物具体例如有谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等的半胱氨酸衍生物、巯基乙醇、二硫苏糖醇、硫甘油等。在本发明中，通过与使用的氧化还原酶等的组合，可以单独使用自这些特定的还原剂中适当选择的那些，也可以多个组合使用。上述还原剂中，从通用性和成本等方面考虑，优选谷胱甘肽、半胱氨酸盐酸盐、N-乙酰半胱氨酸、硫甘油。该化合物在氧敏感性溶液中的浓度，没有特别限定。使用和该化合物不一样的酶稳定剂时，即使不使用该化合物而是使用其它一般的还原剂，酶的保存稳定性也没有障碍。为了以所希望的氧浓度为阈值判别氧的有无，该化合物的浓度根据使用的氧化还原酶和显色基质的浓度进行适当调整即可，但从溶解性和成本方面考虑，该化合物的浓度优选为150mM或其以下，从容易进行氧敏感性溶液的pH调整等溶液配制方面考虑，更优选为80mM或其以下。
另外，作为和上述特定的还原剂不一样的一般的还原剂，具体例如有碱性物质和还原糖类、亚铁氰化钾、亚连二硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、抗坏血酸、异抗坏血酸、草酸、丙二酸及这些有机酸的金属盐、专利文献2和其他文献中记载的还原剂等。在本发明中，通过与使用的氧化还原酶等的组合，可以单独使用自这些一般的还原剂中适当选择的物质，也可以多个组合使用。该还原剂中，从通用性和成本等方面考虑，优选抗坏血酸、异抗坏血酸、草酸、丙二酸及这些有机酸的金属盐，从安全卫生性方面考虑，更优选抗坏血酸和异抗坏血酸及它们的金属盐。上述一般还原剂在氧敏感性溶液中的浓度不特别限定。使用上述特定的还原剂作为还原剂时，可以不使用上述的一般还原剂。为了以所希望的氧浓度为阈值判别氧的有无，上述的一般还原剂的浓度根据使用的氧化还原酶和显色基质的浓度进行适当调整即可，但从溶解性和成本方面考虑，该一般还原剂的浓度优选为500mM或其以下。需要说明的是，上述一般还原剂，也可以和上述特定的还原剂适当组合使用。这样的组合，由于具有不使上述特定还原剂具有的酶活性劣化的作用，和一般还原剂的成本优势的组合，因此更优选。
本发明中使用的酶稳定剂，优选根据使用的酶适当选择。如果具体例示，在抗坏血酸氧化酶的情况下，例如有甘露糖醇等糖类，明胶和牛血清白蛋白等蛋白类。在胆红素氧化酶的情况下，例如有乙二胺四乙酸(EDTA)和天冬氨酸等。酶稳定剂可以将适当选择的物质单独使用，也可以多个组合使用，该稳定剂在氧敏感性溶液中的浓度，与单独使用的情况和多个组合使用的情况无关，为了有效地发挥稳定酶的作用，优选为0.1mM或其以上。酶稳定剂的浓度的上限不特别限定，但根据酶的不同，即使大量地使用，其酶稳定作用也几乎不变，因此，从成本方面考虑，优选该浓度为50mM或其以下。
本发明者有新的发现，即，通过添加尤其是0.2wt％水溶液的表面张力为0.06N/m或其以下的非离子性化合物作为酶稳定剂，与其他酶稳定剂相比，反应活性保持能力高，而且氧检测能力也显著提高。由此，作为氧指示器制品，就可能做到能够使氧检测能力长期且有效地稳定，而且能够以更高的精度检测氧。在该表面张力值为0.06N/m或其以下的情况下，尽管理由不明确，但含有该非离子性化合物的氧敏感性溶液的氧敏感性显著提高。为了使氧检测能力进一步提高，表面张力更优选为0.05N/m或其以下。另一方面，本发明者专心致志地研究的结果发现当将表面张力更低的化合物溶解时，氧敏感性溶液的氧敏感性可以更高，因此，表面张力的下限不特别限定。需要说明的是，本发明中的表面张力，是使用非离子性化合物的0.2wt％水溶液作为测定样品，用DuNouy表面张力计(吊环法)在23℃测定的值。另外，当用例如十二烷基硫酸钠等的离子性化合物替代非离子性化合物时，有时酶失活，作为氧指示器的功能就失去了。
本发明中使用的非离子性化合物，是指在水中不离子离解的化合物。具体例如有非离子性的水溶性聚合物、非离子性的表面活性剂等。
非离子性的表面活性剂例如有丙三醇衍生物、蔗糖、山梨糖醇等的脂肪族酯类和醇加成物等。在本发明中，从酶稳定化作用方面考虑，在这些非离子性化合物中，更优选非离子性水溶性聚合物。
本发明中使用的非离子性的水溶性聚合物，如果具体例示，可以举出乙烯醇共聚物或部分皂化的聚乙烯醇等的聚乙烯醇类、聚丙三醇衍生物、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素等的纤维素衍生物等中是水溶性的，而且0.2wt％水溶液的表面张力为0.06N/m或其以下的物质。这些水溶性聚合物中，从溶解等操作容易和成本方面考虑，特别优选部分皂化的聚乙烯醇和羟丙基甲基纤维素。通过添加这些水溶性聚合物本发明的氧指示器的功能提高，在使用抗坏血酸氧化酶作为氧化还原酶、ABTS作为显色基质时，特别显著。
本发明中作为酶稳定剂使用的非离子性化合物，可以单独使用适当选自上述的物质，也可以多个组合使用。该化合物在氧敏感性溶液中的浓度，与单独使用的情况和多个组合使用的情况无关，优选为0.01wt％或其以上。如果该化合物的浓度为0.01wt％或其以上，就可以有效地提高氧敏感性溶液的氧敏感性。为了更有效地发挥酶稳定化作用，该化合物的浓度更优选为0.03wt％或其以上。该化合物浓度的上限不特别限定，但即使大量使用该化合物氧敏感性的改善作用也几乎不变，因此，从成本方面考虑，优选其浓度为2％或其以下。
需要说明的是，在本发明中，可以只用上述的还原剂及酶稳定剂的任一方，也可以两者共用。
在本发明中，氧敏感性溶液通过进一步含有pH缓冲剂，可以抑制该溶液的显著的pH变化防止酶活性的变动，更长期稳定地进行氧检测。作为pH缓冲剂，具体例如有醋酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、苹果酸缓冲剂、磷酸缓冲剂等一般作为pH缓冲剂使用的物质，但并不限定于这些，可以根据使用的氧化还原酶适当选择合适的物质。pH缓冲剂可以将适当选择的物质单独使用，也可以多个组合使用。pH缓冲剂在氧敏感性溶液中的浓度，可以根据氧敏感性溶液中其他物质的浓度适当设定，具体来讲，与单独使用的情况和多个组合使用的情况无关，为了有效地发挥氧敏感性溶液的缓冲作用，优选为至少10mM或其以上。从溶解性和成本方面考虑，pH缓冲剂的浓度上限优选为1M或其以下。
而且，在本发明中，为了使氧指示器兼具作为氧吸收剂的功能、为了进行使氧指示器的氧检测延迟等检测时间的调整、为了使由氧引起的光吸收波长变化反应从氧浓度的某一阈值开始激烈变化、或为了调整作为氧指示器的氧检测灵敏度，氧敏感性溶液中也可以含有与显色基质在氧的存在下通过酶的催化作用光吸收波长变化的反应竞争，和氧反应的化合物或吸附氧的化合物。作为这样的竞争化合物，如果是酶的反应，可以举出使用的酶显示高基质选择性的化合物，例如，抗坏血酸氧化酶中的抗坏血酸、胆红素氧化酶中的胆红素等，如果是非酶的反应，例如一氧化氮等。另一方面，作为吸附化合物，例如有血色素、钴二元络合物、Salen型络合物、氟代烃化合物等。该化合物并不限定于这些，根据需要可以单独使用适当选择的合适的物质，也可以多个组合使用。该化合物在氧敏感性溶液中的浓度，可以根据氧敏感性溶液中其他物质的浓度适当设定。
在本发明中，为了调整用于上述目的的氧指示器的氧检测性能，在上述化合物以外通过使酶抑制剂、基质类似物、包合物等共存，由此可以使光吸收波长反应变迟，或使灵敏度降低。抑制剂例如有叠氮化物、二乙基二硫代氨基甲酸、硫代硫酸盐、氟化物、氰化物、PCMB、EDTA、2价或3价的金属等，根据使用的酶适当选择的化合物作为基质类似物，环糊精等作为包合物。在此例示的物质只不过是一例，并不是限定本发明，可以考虑使用的酶和基质，根据需要适当组合种类和浓度使用。
本发明所说的利用酶的光吸收波长变化反应，通常是在溶剂中进行的溶液反应，溶液中溶解的氧和显色基质在酶的存在下发生氧化还原反应。可以使用不抑制上述反应且有氧溶解的溶剂的任何溶剂作为溶剂。作为食品包装的氧指示器使用时，从操作和食品卫生方面考虑，优选水或以水为主体(超过50wt％)的水和乙醇的混合液。
本发明的氧指示器，在其制造时和进行氧监测前的保存时，必须做成使氧敏感性溶液和氧不接触的结构，即酶和显色基质与氧隔离的结构。具体来讲，例如，在氧浓度低于0.05％的低氧状态、优选无氧状态下，将氧敏感性溶液用氧阻挡性薄膜包装保存，使用时通过除去氧阻挡性薄膜或弄破袋子使得与氧接触，检测氧的方法。或者，例如，在使酶溶液和显色基质溶液分别与氧隔离的状态下，分别用氧阻挡性薄膜包装保存，使用时通过除去氧阻挡性薄膜或弄破袋子，使酶溶液和显色基质溶液混合，同时与气氛氧接触，检测氧的方法。那时，在氧敏感性溶液和气氛氧之间存在氧透过性薄膜时，通过选择具有合适的氧透过性的薄膜，也可以控制氧检测时间。
在本发明中，与以液体状直接使用氧敏感性溶液相比，从操作方面考虑，优选将氧敏感性溶液浸渍或包含在载体中使用的方法。可以使用的载体例如有塑料、金属、陶瓷、结晶纤维素、无机粒子、凝胶、纸等。只要是不抑制前述光吸收波长变化反应、直接或加工形成固体状态的物质都可以使用。向这些载体k浸渍或含有的方法例如有在这些上涂敷、表面包覆、浸渍等。具体例如有将在由塑料、金属、陶瓷构成的多孔性成形品、无纺布、纸、织物等中使氧敏感性溶液浸渍形成的材料、使ァビセル(商品名，旭化成株式会社)等的结晶纤维素、硅藻土等无机粒子中含有并压片成形的材料、在明胶和琼脂等凝胶中包括而形成的材料等，用具有合适氧透过性的薄膜和容器进行包覆等的结构体。
需要说明的是，在本发明中，使用塑料作为上述载体及包覆材料时，优选使用焚烧时的燃烧热低或考虑在土壤中分解的生物降解性塑料。生物降解性塑料具体例如有由聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚丁酸、聚戊酸、这些的共聚物等的羟基羧酸构成的脂肪族聚酯类；由乙二醇和己二酸等的多元醇类和多元羧酸类的缩聚物构成的脂肪族聚酯类；及使对苯二甲酸等芳香族多元化合物与它们共聚的脂肪族芳香族共聚聚酯类；淀粉类和纤维素类等的天然高分子类等，生物降解性塑料的规格例如有符合日本的生物降解性塑料研究会制定的规格、美国的ASTMD-6400、德国的DIN V-54900等的规格。
本发明的氧指示器，可以在其形状加工成小袋状、标签状、带状、药片状、帽状等的结构体后使用。例如，在将含有黄油等容易氧化劣化的油脂的糕点等进行无氧包装的情况下，和将火腿等加工肉食品进行真空包装的情况下，将浸渍本发明的氧敏感性溶液的吸水性纸，用氧透过性薄膜包覆，作成小袋形状的结构体，通过将其作为本发明的氧指示器装入包装体内，可以检测包装体内氧的有无。另外，在气体置换包装的调理食品和盒饭的容器中，用小袋时担心会使小孩和老人误食小袋时，可以使用在容器内侧贴上加工成标签状的本发明的氧指示器，或粘贴该氧指示器使其堵塞为进行包装容器内的气体置换而形成的该容器的开孔后使用也可以。
需要说明的是，本发明所说的气体置换包装，是称为气调包装(Modified Atmosphere包装)、气体填充包装、调控包装(ControledAtmosphere包装)的包装技术。一般来讲，可以根据包装体内容物调整合适容器或袋内的气体组成，通常作为容器或袋内的气体成分，可以用惰性气体氮气和氩气进行置换。为了抑制菌类的繁殖，优选容器或袋内的氧的气体组成为无氧，更优选有抑菌作用的二氧化碳的气体组成为3％或其以上，最优选有杀菌作用的乙醇的气体组成为0.5％或其以上。而且，对于饮料，通过做成在顶面的透明帽内侧设置本发明的氧指示器的形状，即使对于象碳酸饮料等存在二氧化碳的情况那样不能使用现有的使用了亚甲蓝的氧指示器的用途，也能根据色彩等的变化确认氧的有无。
本发明的氧指示器，除了在上述食品包装领域外，也可以用于如需要确认密封空间内的氧的有无的任何用途。例如可以在精密机械部件包装和螺钉等的金属部件包装和电子衬底等的电气设备部件包装、医药品、化妆品等的包装中使用等。本发明的包装体，只要是例如袋状、容器状的等一般作为包装材料使用的形态，可以使用任何形态。为了使包装体内保持真空，或为了最大程度地抑制包装体内的气体组成的变动，使用的材质优选具有气体阻挡性。作为包装体的材质例如有塑料、金属、木材、纸、玻璃等单纯材料或这些的层叠材料等。其气体阻挡性优选对于使用的各种气体，在标准状态(23℃，50％RH)下，将包装体内的气体组成的变动抑制在小于10％的变动范围内。需要说明的是，这里所说的容器，是指具有由承受容器及盖构成的形态、用于装入内容物的器具，例如，可以是容器和盖的一边通过铰链部连接的所谓的食品包装。
本发明的氧指示器任何场合都能判别氧的有无，进行监控前(特别是保存时)，为了不发生光吸收波长变化反应，或只发生很微弱的反应，优选利用气体阻挡性材料包装进行气体置换包装，以和氧隔离。例如使用金属、玻璃等氧气阻挡性高的容器，或用氧气阻挡性薄膜进行袋包装进行保存。另外，更优选为了捕捉保存环境内极少量的氧及透过氧气阻挡性保存袋而侵入的氧，也可以在这些保存袋内等中放入脱氧剂等氧捕捉剂。
对于本发明的氧指示器，使用图说明其具体例。
图1是氧指示器的透视图和其A-A’面剖面图，其中将氧敏感性溶液1在保持低氧状态下直接包装在用氧气透过性薄膜制作的袋2中，进一步用氧气阻挡性薄膜制作的袋子3将其外侧包装。
图2是氧指示器的透视图和其B-B’面的剖面图，其中将氧敏感性溶液1在保持低氧状态下直接包装在具有氧气透过性的塑料容器4中，进一步用氧气阻挡性薄膜制作的袋子3将其外侧包装。
图3是氧指示器的透视图和其C-C’面的剖面图，其中将氧敏感性溶液1在保持低氧状态下直接浸渍在多孔性成型品、无纺布这样的片状物、使用了结晶纤维素和无机粒子等的压片成型品、明胶和琼脂等的凝胶、吸水性滤纸等的小片5上，在保持低氧状态下直接包装在用氧气透过性薄膜制作的袋子2中，进一步用氧气阻挡性薄膜制作的袋子3将其外侧包装。
图4是氧指示器的透视图和其D-D’面的剖面图，其中在低氧状态下在滤纸5上浸渍氧敏感性溶液1，在两面具有粘结层的氧气阻挡性胶带7的一个粘结面上，粘贴浸渍过的滤纸5，从其上面用氧气透过性薄膜6覆盖滤纸5，通过氧气阻挡性胶带7的粘结力粘合，从氧气透过性薄膜6之上用氧气阻挡性胶带7覆盖，通过氧气阻挡性胶带7的粘结力形成粘合的结构。
图5是氧指示器的透视图和其E-E’面的剖面图，其中在单面具有粘结层的氧气阻挡性粘结标签8的粘结面上，在低氧状态下粘贴滤纸5，浸渍氧敏感性溶液1，从其上用氧气透过性薄膜6覆盖滤纸5，通过氧气阻挡性粘结标签8的粘结力粘合，从氧气透过性薄膜6之上用氧气阻挡性胶带7’覆盖，通过氧气阻挡性粘结标签8的粘结力形成粘合的结构。
图6是将图5所示的粘结标签状氧指示器在具有开孔部的盖子上粘贴以堵塞该开孔部后使用时的透视图。这时，由于用氧气阻挡性粘结标签8堵塞该开孔部，因此，该容器内是和外界通过气体阻挡性材料隔离的密封状态，形成该容器内的气体组成的变动可以抑制的结构。另一方面，由于该指示器是浸渍过氧敏感性溶液1的滤纸5被氧气透过性薄膜6覆盖的结构，因此，滤纸5通过氧气透过性薄膜6和该容器内气氛连接，通过该指示器可以监控该容器内的氧浓度。
实施例1用胆红素氧化酶(ECl.3.3.5，天野制药社制BO-3)作为氧化还原酶，ABTS(东京化成工业社制高品质分析试剂)作为显色基质，用氧浓度为4ppm的50mM磷酸缓冲液(pH＝6.0，由和光纯药工业社制试剂特级磷酸一钾和磷酸二钾配制)作为溶剂。将该酶10μg、该基质3mg分别溶解于磷酸缓冲液100μl中，制成预配制酶溶液、预配制基质溶液。进一步将磷酸缓冲液2800μl、预配制酶溶液100μl、预配制基质溶液100μl混合，向其中溶解作为还原剂的谷胱甘肽(还原型，和光纯药工业社制试剂特级)使其浓度为0.6mM，配制成酶及基质的混合溶液。如图1所示，将该酶及基质的混合溶液(氧敏感性溶液)1在用氧气透过性薄膜制作的袋子2中保持低氧状态下直接包装，制成氧指示器。然后进一步将其外侧用氧气阻挡性薄膜制作的袋子3包装，制成氧指示器。通过只弄破在氧检测包装体内外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子3，检测包装体内的氧时，在无氧状态是无色的，但和空气接触时变成蓝绿色。另外，测定环境为氧浓度1％时是透明的，氧浓度为2％时着色形成蓝绿色，显示出灵敏的着色。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子3包装的状态下，即使将该氧指示器制作后在5℃保存了10日，在和上述同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为1％时是透明的，氧浓度为2％时着色成蓝绿色，该氧指示器制作后和在5℃保存了10日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其保存稳定性良好。
实施例2用胆红素氧化酶(ECl.3.3.5，天野制药社制BO-3)作为氧化还原酶、皂化度为80mol％的聚乙烯醇(和光纯药工业社制试剂特级，0.2wt％水溶液的表面张力＝0.051N/m)作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的200mM磷酸缓冲液(pH＝6.0，由和光纯药工业社制试剂特级磷酸一钾和磷酸二钾配制)一起溶解于蒸馏水中，配制成胆红素氧化酶为0.35μg/ml、聚乙烯醇为0.01％、磷酸缓冲液为50mM的酶溶液(A1)。用ABTS(东京化成工业社制高品质分析试剂)作为显色基质、谷胱甘肽(还原型，和光纯药工业社制试剂特级)作为还原剂、上述聚乙烯醇作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的200mM磷酸缓冲液(pH＝6.0)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为0.1mg/ml、谷胱甘肽为1.2mM、聚乙烯醇为0.01％、磷酸缓冲液为50mM的基质溶液(B1)。将这些酶溶液(A1)和基质溶液(B1)在氧浓度为30ppm的低氧环境下，分别进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L(用メトラ一トレ一ド社制溶解氧计MO128测定)后，将该酶溶液(A1)和该基质溶液(B1)分别各计量100μl混合配制成氧敏感性溶液(C1)。然后，如图3所示，将该氧敏感性溶液(C1)的一部分保持低氧状态下直接浸渍在滤纸(ヮットマン社制クロマグラフィ一ペ一パ一3MMChr)上，在保持低氧状态下直接包装在用氧气透过性薄膜(旭化成社制OPS薄膜25μm厚)制作的袋子中，制成氧指示器(D1)。进一步保持低氧状态下，将得到的氧指示器(D1)和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜(旭化成パックス社制飛意シリ一ズOPS规格袋)制作的袋子包装。然后，用二氧化碳、氮气及氮气和氧气的混合气体，将测定环境调整成二氧化碳的气体成分为50vol％、氧的气体成分为规定浓度(0.5vol％，1.0vol％，2vol％，用ダンセンサ一社制チェックポイント测定)，将得到的氧指示器(D1)在测定环境内通过只弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，制成该氧指示器(D1)后，在5℃保存30日，和上述同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。该氧指示器(D1)制作后直接使用和在5℃保存了30日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其长期保存稳定性良好。
实施例3用胆红素氧化酶(ECl.3.3.5)作为氧化还原酶、甲基取代度为1.9和羟丙基甲基取代度为0.25的羟丙基甲基纤维素(信越化学工业社制メトロ一ズ60SH-15，0.2wt％水溶液的表面张力＝0.047N/m)作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的200mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成胆红素氧化酶为2.0μg/ml、羟丙基甲基纤维素为0.5％、磷酸缓冲液为50mM的酶溶液(A2)。用ABTS作为显色基质、N-乙酰半胱氨酸(和光纯药工业社制试剂特级)作为还原剂、上述羟丙基甲基纤维素作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的200mM磷酸缓冲液(pH＝6.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为3.0mg/ml、N-乙酰半胱氨酸为4.0mM、羟丙基甲基纤维素为0.5％、磷酸缓冲液为50mM的基质溶液(B2)。将这些酶溶液(A2)和基质溶液(B2)在氧浓度为30ppm的低氧环境下，分别进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L后，将该酶溶液(A2)和该基质溶液(B2)分别各计量100μl混合配制成氧敏感性溶液(C2)。然后，如图3所示，将该氧敏感性溶液(C2)的一部分在保持低氧状态下直接浸渍在滤纸上，保持低氧状态直接包装在用氧气透过性薄膜制作的袋子中，制成氧指示器(D2)。进一步保持低氧状态将得到的氧指示器(D2)和吸氧剂一起用用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装。然后，和实施例2同样，将得到的氧指示器(D2)在测定环境内通过只弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，将该氧指示器(D2)制作后在5℃保存30日，和上述实施例2同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。该氧指示器(D2)制作后直接使用和在5℃保存了30日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其长期保存稳定性良好。
实施例4用胆红素氧化酶(ECl.3.3.5)作为氧化还原酶、聚合度为10的聚丙三醇癸酸酯(理研ビタミン社制ポエムC-781，0.2wt％水溶液的表面张力＝0.057N/m)作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的400mM磷酸缓冲液(pH＝5.0)一起溶解于蒸馏水中，配制成胆红素氧化酶为20μg/ml、聚丙三醇癸酸酯为10％、磷酸缓冲液为100mM的酶溶液(A3)。用ABTS作为显色基质、草酸锰(和光纯药工业社制二水合物)作为还原剂、上述聚丙三醇癸酸酯作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的400mM磷酸缓冲液(pH＝5.0)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为1.0mg/ml、草酸锰为10mM、聚丙三醇癸酸酯为10％、磷酸缓冲液为100mM的基质溶液(B3)。将这些酶溶液(A3)和基质溶液(B3)在氧浓度为30ppm的低氧环境下，分别进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L后，将该酶溶液(A3)和该基质溶液(B3)分别各计量100μl混合配制成氧敏感性溶液(C3)。然后，如图4所示，将该氧敏感性溶液(C3)的一部分保持低氧状态直接浸渍在滤纸上，在两面具有粘结层的氧气阻挡性胶带(サトゥシ一ル社制PET75μm厚)的一个粘结面上粘贴浸渍过的滤纸，从其上用氧气透过性薄膜覆盖该滤纸，通过氧气阻挡性胶带的粘结力粘合，从该氧气透过性薄膜之上用氧气阻挡性胶带(旭化成パックス社制ァルミラミフィルム)覆盖，通过氧气阻挡性胶带的粘结力粘合，制成氧指示器(D3)。进一步保持低氧状态将得到的氧指示器(D3)和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装。然后，和实施例2同样，将得到的氧指示器(D3)，在测定环境内通过弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子并除去氧气阻挡性胶带，由此检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，将该氧指示器(D3)制作后在5℃保存30日，和上述实施例2同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。该氧指示器(D3)制作后直接使用和在5℃保存了30日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其长期保存稳定性良好。
实施例5用抗坏血酸氧化酶(ECl.10.3.3，旭化成社制ASOM)作为氧化还原酶、甲基取代度为1.8的甲基纤维素(信越化学工业社制メトロ一ズSM-15，0.2wt％水溶液的表面张力＝0.054N/m)作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的400mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.0，由和光纯药工业社制试剂特级柠檬酸和柠檬酸钠配制)一起溶解于蒸馏水中，配制成抗坏血酸氧化酶为10μg/ml、甲基纤维素为2.0％、柠檬酸缓冲液为50mM的酶溶液(A4)。用ABTS作为显色基质、半胱氨酸盐酸盐(和光纯药工业社制一级试剂)作为还原剂、上述甲基纤维素作为酶稳定剂，将它们和事先配制好的400mM柠檬酸缓冲液(pH＝4.0)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为8.0mg/ml、半胱氨酸盐酸盐为10mM、甲基纤维素为2.0％、柠檬酸缓冲液为50mM的基质溶液(B4)。将这些酶溶液(A4)和基质溶液(B4)在氧浓度为30ppm的低氧环境下，分别进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L后，将该酶溶液(A4)和该基质溶液(B4)分别各计量100μl混合配制成氧敏感性溶液(C4)。然后，如图4所示，将该氧敏感性溶液(C4)的一部分保持低氧状态直接浸渍在滤纸上，在两面具有粘结层的氧气阻挡性胶带的一个粘结面上粘贴浸渍过的滤纸，从其上用氧气透过性薄膜覆盖该滤纸，通过氧气阻挡性胶带的粘结力粘合，从该氧气透过性薄膜之上用氧气阻挡性胶带覆盖，通过氧气阻挡性胶带的粘结力粘合，制成氧指示器(D4)。进一步保持低氧状态将得到的氧指示器(D4)和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装。然后，和实施例2同样，将得到的氧指示器(D4)在测定环境内通过弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子并除去氧气阻挡性胶带，从而检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，将该氧指示器(D4)制作后在5℃保存30日，和上述实施例2同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。该氧指示器(D4)制作后直接使用和在5℃保存了30日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其长期保存稳定性良好。
实施例6用抗坏血酸氧化酶(ECl.10.3.3)作为氧化还原酶，溶解于蒸馏水中配制成5mg/ml的抗坏血酸氧化酶母液。用皂化度为80mol％的聚乙烯醇(和光纯药工业社制试剂特级，0.2wt％水溶液的表面张力＝0.051N/m)作为酶稳定剂，溶解于蒸馏水中配制成1重量％的聚乙烯醇母液。用这些抗坏血酸氧化酶母液和聚乙烯醇母液，和事先配制好的400mM醋酸缓冲液(pH＝4.5，由和光纯药工业社制试剂特级醋酸和醋酸钠配制)一起溶解于蒸馏水中，配制成抗坏血酸氧化酶为100μg/ml、聚乙烯醇为0.05％、醋酸缓冲液为100mM的酶溶液(A5)100ml。用ABTS作为显色基质，溶解于蒸馏水中配制成25mg/ml的ABTS母液。用L-抗坏血酸(和光纯药工业社制试剂特级)作为还原剂，溶解于蒸馏水中配制成100mM的L-抗坏血酸母液。和上述同样，用上述聚乙烯醇作为酶稳定剂，溶解于蒸馏水中配制成1重量％的聚乙烯醇母液。用这些ABTS母液、L-抗坏血酸母液、聚乙烯醇母液，和事先配制好的400mM醋酸缓冲液(pH＝4.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为8.0mg/ml、L-抗坏血酸为25mM、聚乙烯醇为0.05％、醋酸缓冲液为100mM的基质溶液(B5)100ml。将这些酶溶液(A5)和基质溶液(B5)，分别在带有止回阀的容器内在不接触大气的情况下，进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L后，各自通过微型泵等量送液至混合器，连续将该酶溶液(A5)和该基质溶液(B5)混合后配制成氧敏感性溶液(C5)。然后，在氧浓度为30ppm的低氧环境下，如图5所示，将该氧敏感性溶液(C5)的一部分浸渍在单面具有粘结层的氧气阻挡性粘结标签(サトゥシ一ル社制PET75μm厚)的粘结面上粘贴的滤纸上，从其上用氧气透过性薄膜(旭化成社制OPS薄膜25μm厚)覆盖该滤纸，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，从氧气透过性薄膜之上用氧气阻挡性胶带覆盖，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，制成氧指示器(D5)。进一步保持低氧状态，将得到的氧指示器(D5在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装。然后，和实施例2同样，将得到的氧指示器(D5)在测定环境内通过弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子并除去氧气阻挡性带，从而检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，将该氧指示器(D5)制作后在5℃保存30日，和上述实施例2同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。该氧指示器(D5)制作后直接使用和在5℃保存了30日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其长期保存稳定性良好。
实施例7用抗坏血酸氧化酶(ECl.10.3.3)作为氧化还原酶，溶解于蒸馏水中配制成5mg/ml的抗坏血酸氧化酶母液。用甲基取代度为1.9和羟丙基甲基取代度为0.25的羟丙基甲基纤维素(信越化学工业社制メトロ一ズ60SH-15，0.2wt％水溶液的表面张力＝0.047N/m)作为酶稳定剂，溶解于蒸馏水中配制成2重量％的羟丙基甲基纤维素母液。用这些抗坏血酸氧化酶母液和羟丙基甲基纤维素母液，和事先配制好的1M醋酸缓冲液(pH＝3.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成抗坏血酸氧化酶为200μg/ml、羟丙基甲基纤维素为0.1％、醋酸缓冲液为200mM的酶溶液(A6)100ml。用ABTS作为显色基质，溶解于蒸馏水中配制成25mg/ml的ABTS母液。用L-抗坏血酸钠作为第一还原剂，溶解于蒸馏水中配制成500mM的L-抗坏血酸钠母液。用N-乙酰半胱氨酸作为第二还原剂，溶解于蒸馏水中配制成200mM的N-乙酰半胱氨酸母液。和上述同样，用上述羟丙基甲基纤维素作为酶稳定剂，溶解于蒸馏水中配制成2重量％的羟丙基甲基纤维素母液。用这些ABTS母液、L-抗坏血酸钠母液、N-乙酰半胱氨酸母液、羟丙基甲基纤维素母液，和事先配制好的1M醋酸缓冲液(pH＝3.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为4.0mg/ml、L-抗坏血酸钠为200mM、N-乙酰半胱氨酸为80mM、羟丙基甲基纤维素为0.1％、醋酸缓冲液为200mM的基质溶液(B6)100ml。将这些酶溶液(A6)和基质溶液(B6)，分别在带有止回阀的容器内在不接触大气的情况下，进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L后，分别通过微型泵等量送液至混合器，连续将该酶溶液(A6)和该基质溶液(B6)混合配制成氧敏感性溶液(C6)。然后，在氧浓度为30ppm的低氧环境下，如图5所示，将该氧敏感性溶液(C6)的一部分浸渍在单面具有粘结层的氧气阻挡性粘结标签的粘结面上粘贴的滤纸上，从其上用氧气透过性薄膜覆盖该滤纸，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，从氧气透过性薄膜之上用氧气阻挡性胶带覆盖，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，制成氧指示器(D6)。在大气中将取出的该氧指示器(D6)和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子进行氮气置换包装。然后，和实施例2同样，将得到的氧指示器(D6)在测定环境内通过弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子并除去氧气阻挡性带，从而检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，将该氧指示器(D6)制作后在5℃保存30日，和上述实施例2同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为1％时着色成蓝绿色，以氧浓度1％为阈值灵敏地显示氧的存在。该氧指示器(D6)制作后直接使用和在5℃保存了30日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其长期保存稳定性良好。
实施例8用抗坏血酸氧化酶(ECl.10.3.3)作为氧化还原酶，溶解于蒸馏水中配制成5mg/ml的抗坏血酸氧化酶母液。不添加酶稳定剂，用抗坏血酸氧化酶母液，和事先配制好的400mM醋酸缓冲液(pH＝4.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成抗坏血酸氧化酶为100μg/ml、醋酸缓冲液为100mM的酶溶液(A7)100ml。用ABTS作为显色基质，溶解于蒸馏水中配制成25mg/ml的ABTS母液。用L-抗坏血酸作为还原剂，溶解于蒸馏水中配制成100mM的L-抗坏血酸母液。不添加酶稳定剂，用这些ABTS母液、L-抗坏血酸母液，和事先配制好的400mM醋酸缓冲液(pH＝4.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为8.0mg/ml、L-抗坏血酸为25mM、醋酸缓冲液为100mM的基质溶液(B7)100ml。将这些酶溶液(A7)和基质溶液(B7)，分别在带有止回阀的容器内在不接触大气的情况下，进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L后，分别通过微型泵等量送液至混合器，连续将该酶溶液(A7)和该基质溶液(B7)混合配制成氧敏感性溶液(C7)。然后，在氧浓度为30ppm的低氧环境下，如图5所示，将该氧敏感性溶液(C7)的一部分浸渍在单面具有粘结层的氧气阻挡性粘结标签(サトゥシ一ル社制PET75μm厚)的粘结面上粘贴的滤纸上，从其上用氧气透过性薄膜(旭化成社制OPS薄膜25μm厚)覆盖该滤纸，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，从氧气透过性薄膜之上用氧气阻挡性胶带覆盖，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，制成氧指示器(D7)。进一步保持低氧状态，将得到的氧指示器(D7)和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装。然后，和实施例2同样，将得到的氧指示器(D7)在测定环境内通过弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子并除去氧气阻挡性带，从而检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％时是透明的，氧浓度为2％时着色成蓝绿色，以氧浓度2％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，将该氧指示器(D7)制作后在5℃保存10日，和上述实施例2同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.5％和1％时是透明的，即使在氧浓度为2％时着色程度也限于微弱的蓝绿色，该氧指示器(D7)制作后直接使用和在5℃保存了10日后使用，其氧检测能力能够看出明确的差别。
实施例9用抗坏血酸氧化酶(ECl.10.3.3)作为氧化还原酶，溶解于蒸馏水中配制成5mg/ml的抗坏血酸氧化酶母液。用皂化度为80mol％的聚乙烯醇(和光纯药工业社制试剂特级，0.2wt％水溶液的表面张力＝0.051N/m)作为酶稳定剂，溶解于蒸馏水中配制成1重量％的聚乙烯醇母液。用这些抗坏血酸氧化酶母液和聚乙烯醇母液，和事先配制好的400mM醋酸缓冲液(pH＝4.5，由和光纯药工业社制试剂特级醋酸和醋酸钠配制)一起溶解于蒸馏水中，配制成抗坏血酸氧化酶为100μg/ml、聚乙烯醇为0.05％、醋酸缓冲液为100mM的酶溶液(A8)100ml。用ABTS作为显色基质，溶解于蒸馏水中配制成25mg/ml的ABTS母液。和上述同样，用上述聚乙烯醇作为酶稳定剂，溶解于蒸馏水中配制成1重量％的聚乙烯醇母液。不添加还原剂，用这些ABTS母液、聚乙烯醇母液，和事先配制好的400mM醋酸缓冲液(pH＝4.5)一起溶解于蒸馏水中，配制成ABTS为8.0mg/ml、聚乙烯醇为0.05％、醋酸缓冲液为100mM的基质溶液(B8)100ml。将这些酶溶液(A8)和基质溶液(B8)，分别在带有止回阀的容器内在不接触大气的情况下，进行氮气鼓泡使溶解氧浓度变成0.00mg/L后，分别通过微型泵等量送液至混合器，连续将该酶溶液(A8)和该基质溶液(B8)混合配制成氧敏感性溶液(C8)。然后，在氧浓度为30ppm的低氧环境下，如图5所示，将该氧敏感性溶液(C8)的一部分浸渍在单面具有粘结层的氧气阻挡性粘结标签(サトゥシ一ル社制PET75μm厚)的粘结面上粘贴的滤纸上，从其上用氧气透过性薄膜(旭化成社制OPS薄膜25μm厚)覆盖该滤纸，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，从氧气透过性薄膜之上用氧气阻挡性胶带覆盖，通过氧气阻挡性粘结标签的粘结力粘合，制成氧指示器(D8)。进一步保持低氧状态，将得到的氧指示器(D8)和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装。然后，除将测定环境内的氧气成分调整为浓度0.0vol％、0.2vol％、0.5vol％(用グンセンサ一社制チェックポイント测定)以外，其它和实施例2同样操作，将得到的氧指示器(D8)在测定环境内通过弄破外侧的用氧气阻挡性薄膜制作的袋子并除去氧气阻挡性带，从而检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.0％时是透明的，氧浓度为0.2％时着色成蓝绿色，以氧浓度0.2％为阈值灵敏地显示氧的存在。在和吸氧剂一起用氧气阻挡性薄膜制作的袋子包装的状态下，将该氧指示器(D8)制作后在5℃保存30日，和上述同样检测氧的有无时，测定环境的氧浓度为0.0％时是透明的，氧浓度为0.2％时着色成蓝绿色，以氧浓度0.2％为阈值灵敏地显示氧的存在。该氧指示器(D8)制作后直接使用和在5℃保存了30日后使用，其氧检测能力看不出差别，判定其长期保存稳定性良好。
工业应用的可能性本发明的氧指示器能够适用于避免氧存在的气体置换包装领域。
权利要求
1.氧指示器，利用基质在氧的存在下通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应，其含有至少包含显色基质、氧化还原酶和用于还原被氧化的显色基质的还原剂的氧敏感性溶液。
2.氧指示器，利用基质在氧的存在下通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应，其含有至少包含显色基质、氧化还原酶和酶稳定剂的氧敏感性溶液。
3.氧指示器，利用基质在氧的存在下通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应，其含有至少包含显色基质、氧化还原酶、酶稳定剂和用于还原被氧化的显色基质的还原剂的氧敏感性溶液。
4.如权利要求1或3记载的氧指示器，其中所述还原剂是一旦被氧化就生成二硫基的含巯基化合物。
5.如权利要求2或3记载的氧指示器，其中所述酶稳定剂是0.2wt％水溶液的表面张力为0.06N/m或其以下的非离子性化合物。
6.如权利要求5记载的氧指示器，其中所述非离子性化合物是水溶性聚合物。
7.如权利要求6记载的氧指示器，其中所述水溶性聚合物是水溶性聚乙烯醇类、水溶性聚丙三醇类或水溶性纤维素衍生物。
8.如权利要求5～7任一项记载的氧指示器，其中氧化还原酶是抗坏血酸氧化酶或胆红素氧化酶。
9.如权利要求1～8任一项记载的氧指示器，其中所述氧敏感性溶液含有缓冲剂。
10.如权利要求1～9任一项记载的氧指示器，其中所述氧敏感性溶液还含有与所述光吸收波长变化反应竞争而与氧进行反应的化合物，或吸附氧的化合物。
11.含有容器或袋的包装体，通过将权利要求1～10任一项记载的氧指示器包含在该容器内或袋内，或通过安装权利要求1～10任一项记载的氧指示器堵塞该容器或袋的开孔部，可以检验该容器内或袋内的氧浓度。
12.如权利要求11记载的包装体，其是真空包装的。
13.如权利要求11记载的包装体，其为所述容器或袋内填充有不含氧的气体的气体置换包装。
全文摘要
氧指示器，利用基质在氧存在的条件下通过酶的催化作用，光吸收波长发生变化的反应。其含有至少包含显色基质、氧化还原酶、用于还原被氧化的显色基质的还原剂的氧敏感性溶液。
文档编号B65D79/02GK1761740SQ200480007209
公开日2006年4月19日 申请日期2004年3月18日 优先权日2003年3月20日
发明者樱井和明, 川岛政彦, 松木丰, 植田成, 高桥守 申请人:旭化成生活制品株式会社