用于选择性修饰蛋白质的方法

专利名称：用于选择性修饰蛋白质的方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及对蛋白质引入性质修饰基团的新方法。具体地，本发明涉及赖氨酸残基的衍生，以及具有改良的药理学性质的生长激素的新缀合物，和用于其制备和 在治疗中使用的方法。
背景技术：
众所周知通过使基团与蛋白质缀合修饰蛋白质的性质和特征，以改变蛋白质的性 质。事实上，超过20年前，美国专利号4，179，337教导了与聚乙二醇或聚丙二醇缀合的蛋 白质。一般地，此种缀合一般需要蛋白质中的某一官能团以与缀合基团中的另一种官能团 反应。一般地，氨基例如N末端氨基或在赖氨酸中的ε-基团，已与合适的酰化试剂组合使 用。经常希望或甚至需要能够控制缀合反应，即控制缀合化合物在何处附着且控制附着多 少个缀合基团。这经常称为特异性或选择性。然而，选择性化学反应谱(r印ertoire)非常有限。替代方案是通过重组方法引入 具有独特反应性的特定非天然氨基酸，并且随后在进一步的衍生中利用这种反应性。替代 方案是使用识别待修饰蛋白质的结构和功能特征的酶。这个的例子是微生物转谷氨酰胺酶 (mTGase)的使用，以选择性修饰生长激素中的Gln残基。具体地，转谷氨酰胺酶已在食品工 业且特别在乳制品厂工业中用于交叉结合蛋白质。其他文件公开了转谷氨酰胺酶改变生理 学活性蛋白质的性质的用途。参见例如EP950665，EP 785276和Sato，Adv. Drug Delivery Rev.，54,487-504(2002)，其公开了在转谷氨酰胺酶的存在下在包括至少一个Gln的蛋 白质和氨基官能化PEG或相似配体之间的直接反应；还参见Wada在Biotech. Lett.，23， 1367-1372(2001)中，其公开了借助于转谷氨酰胺酶β -乳球蛋白与脂肪酸的直接缀合。通 过转谷氨酰胺酶催化的反应是其中谷氨酰胺残基的伯酰胺(primary amide)从反应混合物 中存在的伯胺转化成仲酰胺的转酰胺基反应，如

图1中所示。然而，蛋白质的选择性衍生是非常困难的任务；蛋白质中的赖氨酸通过酰化进行 衍生是甚至更加固有的非选择性过程。因此，目前不存在用于赖氨酸残基选择性衍生的有 效方法。因此，本领域中迫切需要用于选择性衍生蛋白质或目的多肽中的氨基酸残基例如 赖氨酸的方法。附图简述图1描述了通过TGase催化的一般反应。图2描述了本发明的一般反应，也称为“反向TGase”。图3描述了如实施例1中所述的人生长激素的修饰。图4详细描述了 TGase介导的转酰胺基作用的机制。发明详述本发明通过提供这样的方法解决了这些需要，所述方法经由辅助蛋白质以更选择 性的方式将性质修饰基团引入靶蛋白质中，同时使用常规化学方法。一般而言该方法可 以如下描述首先，形成辅助蛋白质和性质修饰基团之间的活化复合物；其次，以比通过常 规方法可以达到的那种更加选择性的方式，将修饰基团从活化复合物转移到待修饰的蛋白质，且从而导致“修饰的蛋白质”。同样，如本文所使用的，“修饰的蛋白质”指已通过本发明的方法选择性修饰的蛋白质或多肽。具体地，本发明涉及包括含至少2个赖氨酸的蛋白质与性质修饰基团的转谷氨酰胺酶催化的反应的方法。性质修饰基团是式Rl-Gln-Gly-R2的含谷氨酰胺-甘氨酸的蛋白 质。具体地，在这个方法中，通过使性质修饰基团中的谷氨酰胺残基与TGase反应形成活化 酰基复合物，以附着性质修饰基团。在优选实施方案中，性质修饰基团通过酰化转移给靶蛋 白质中的赖氨酸残基，如图2中所述。在一个实施方案中，Rl和R2都是所需取代基，其中 至少一个包括适合于进一步修饰的化学基团。因此，本发明涉及“反向”TGase反应，以选择 性修饰在靶蛋白质内的赖氨酸残基。如本文所使用的，术语“多肽，，指通过肽键连接的氨基酸残基聚合物，无论是天然 还是合成产生的。小于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。术语“肽”意指通过肽键 连接的2个或更多氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然或非天然的。该术语包含术 语多肽和蛋白质，这可以由通过共价相互作用或非共价相互作用结合在一起的2个或更多 肽组成，所述共价相互作用例如半胱氨酸桥。“蛋白质”是包括一条或多条多肽链的大分子。 蛋白质还可以包括非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其他非肽取代基通过其 中产生蛋白质的细胞可以加入蛋白质中，并且将随着细胞类型而改变。蛋白质在本文中就 其氨基酸主链结构而言进行定义；取代基例如碳水化合物基团一般并未指定，但仍可以存 在。由非宿主DNA分子编码的蛋白质或多肽是“异源”蛋白质或多肽。“分离的多肽”是基 本上不含在自然界中与多肽结合的污染细胞组分的多肽，所述污染细胞组分例如碳水化合 物、脂质或其他蛋白质杂质。一般地，分离的多肽制剂包含高度纯化形式的多肽，即至少约 80%纯、至少约90%纯、至少约95%纯、超过95%纯，例如96%、97%或98%或更高纯，或超 过99%纯。显示具体蛋白质制剂包含分离的多肽的一种方法是通过在蛋白质制剂的十二烷 基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后单个条带的出现。然而， 术语“分离的”不排除可选择的物理形式的相同多肽的存在，例如二聚体或可选择地糖基化 或衍生形式。术语“氨基末端”和“羧基末端”在本文中用于指在多肽内的位置。当上下文 允许时，这些术语关于多肽的特定序列或部分用于指接近或相对位置。例如，置于多肽内的 参考序列羧基末端的特定序列定位接近于参考序列的羧基末端，但不一定在完整多肽的羧 基末端处。本发明的辅助蛋白质本发明的一个方面涉及使用辅助蛋白质用于选择性修饰靶蛋白质的方法。在优选 实施方案中，辅助蛋白质是酶例如转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶(在本文中也可互换地称 为“TGase”)也称为蛋白质-谷氨酰胺-Y -谷氨酰转移酶，并且催化蛋白质或蛋白质链中 的谷氨酰胺(Gln)残基的Y-羧酰胺基(carboxyamido)和赖氨酸(Lys)残基的氨基或 各种烷基胺之间的酰基转移反应，如图1中所示。TGase在各种动物组织、血细胞、血浆等中 以各种分子形式广泛发现。这种酶催化通过 -( Y-谷氨酰)赖氨酸-同工蛋白质键的交 联反应，和在血液凝固的最后一个步骤中交联血纤蛋白分子，并且发现它涉及表皮细胞的 角质化、精液凝固、创伤组织愈合等。因为转谷氨酰胺酶对Gln残基具有非常高的底物特异 性，所以可能仅在蛋白质中的特定Gln残基可以用烷基胺修饰。例如，使用源于豚鼠肝脏的 转谷氨酰胺酶(TGase)，将具有末端糖单位的烷基胺引入β _酪蛋白内的其一个或多个特定 Gln 残基处(Yan, S. C. B.等人，(1984) Biochemistry，23，3759-3765)。此外，使用血液 凝固因子XIII (因子XIII)——在血浆中发现的转谷氨酰胺酶，将更低分子量的精胺衍生 物引入载脂蛋白B内的其一个或多个Gln残基处(Cocuzzi,E.等人，(1990), Biochem. J., 265,707-713)。在本发明的方法中使用的转谷氨酰胺酶可以得自各种来源，无具体限制， 例如得自各种动物组织、血浆组分和微生物。有用的转谷氨酰胺酶的例子包括微生 物转谷氨酰胺酶，例如来自茂原链霉菌(Str印tomyces mobaraense)、肉桂链霉菌 (Streptomycescinnamoneum)禾口 灰肉色链霉菌(Streptomyces griseocarneum)(全 部公开于引入本文作为参考的US 5，156,956中)，以及淡紫灰链霉菌(Str印tomyces lavendulae)(公开于引入本文作为参考的US 5，252，469中)和拉达卡链霉菌 (Streptomyces ladakanum)(引入本文作为参考的JP2003199569)。应当指出，以前的链轮 ^MM (Streptoverticillium) @Ι ^β Ι β^Μ (Streptomyces) ψ [Kaempfer, J. Gen. Microbiol.，137，1831-1892，1991]。其他有用的微生物转谷氨酰胺酶已从枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)(公开于引入本文作为参考的US 5，731，183中)和各种黏菌中 分离。有用的微生物转谷氨酰胺酶的其他例子是公开于WO 96/06931 (例如来自Bacilus Iydicus的转谷氨酰胺酶)和WO 96/22366中的那些，所述2个专利申请都引入本文作 为参考。有用的非微生物转谷氨酰胺酶包括豚鼠肝转谷氨酰胺酶和来自各种海洋来源的 转谷氨酰胺酶，所述海洋来源如比目鱼真鲷(Pagrusmajor)(公开于引入本文作为参考的 EP-0555649中)和日本牡蛎太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)(公开于引入本文作为参考 的 US 5，736，356 中)。因此，在优选实施方案中，在本发明的方法中使用的TGase是微生物转谷氨酰胺 酶。在更优选的实施方案中，TGase来自茂原链霉菌。在另一个实施方案中，TGase是与天 然TGase具有至少80%序列同源性的突变TGase。性质修饰基团本发明的性质修饰基团包含通式Rl-Gln-Gly-R2的含谷氨酰胺蛋白质。在更优选
的实施方案中，性质修饰基团具有下式
<formula>formula see original document page 6</formula>在优选实施方案中，Rl是<formula>formula see original document page 6</formula>在另一个实施方案中，Rl是CBz ；R2选自H、炔丙基或4-氨苄基；Y是OH或=0; 禾口 X 是 CH2OH 或 OH0<formula>formula see original document page 7</formula>本发明的方法用于修饰本发明的靶蛋白质(即目的蛋白质)的需要可能由于许多原因而出现， 并且这也在可以根据本发明的方法选择性修饰的化合物种类中反映。总的来说，本发明的方法包括包含至少2个赖氨酸的蛋白质与式Rl-Gln-Gly-R2 的含谷氨酰胺和甘氨酸肽的转谷氨酰胺酶催化的反应。该方法由下述步骤组成(a)通过 肽合成制备式Rl-Gln-Gly-R2的化合物，并且如本领域已知的纯化；(b)使过量的这种化 合物Rl-Gln-Gly-R2与包含至少一个赖氨酸且优选超过一个赖氨酸的靶蛋白质在任选包 含有机溶剂、去污剂或其他改性剂的水缓冲液中混合；(c)向这种混合物中加入催化量的 转谷氨酰胺酶，优选来自茂原链霉菌的微生物转谷氨酰胺酶(允许反应进行所需时间量)； (cOTGase抑制剂可以任选加入混合物中；(e)对混合物实施纯化过程，一般包括单元操作 例如超滤或渗滤和层析(离子交换、尺寸排阻、疏水作用等)。以这种方式，获得选择性修饰 的蛋白质。蛋白质通过标准蛋白质分析法进行表征，包括层析、电泳、肽作图和质谱分析法。 任选地，在步骤(b)或(c)后，修饰的蛋白质可以经由R1或R2的官能团进行进一步修饰。具体地，作为TGase介导的转酰胺基作用机制的部分，通过TGase活性位点中的 Cys和Gin-底物之间的反应形成分子间硫酯(参见图4)。术语“转酰胺基作用”意指在其 中谷氨酰胺侧链中的氮与来自另一种化合物的氮，特别是来自另一种含氮亲核体的氮交换 的反应。这种中间体可以视为活化的Gin残基，活性种类是TGase-硫酯，其与胺例如蛋白 质赖氨酸残基反应。反应的选择性是下述的结果1)在与具有Lys的蛋白质底物相互作用 时，TGase-硫酯的剪切立体体积，和2)在TGase-硫酯和具有Lys的蛋白质底物之间更限
7在另外一个实施方案中，R1是CBz ；R2是H ;Y是0H ；和X是CH20H。在另外一个实施方案中，R1是CBz ；R2是4_氨苄基；Y是=0 ；和X是0H。在另一个实施方案中，R1是CBz ；R2是炔丙基；Y是=0 ；和X是0H。因此，本发明的优选性质修饰基团(或底物)选自定的非共价相互作用。这个的直接结果是携带活化的酰基的蛋白质一酰基-X-蛋白质包 括在本发明中，其中X是使酰基朝向通过蛋白质-赖氨酸胺的亲核攻击活化的原子或基团。 因此，可能希望修饰蛋白质以改变蛋白质的物理化学件质,例如以增加(或减少) 可溶性以修饰治疗蛋白质的生物利用率。在另一个实施方案中，可能希望通过使化合物与 蛋白质缀合修饰在身体中的清除率，所述化合物与血浆蛋白质例如清蛋白结合，或增加蛋 白质的大小以阻止或延迟通过肾的排出。缀合还可以改变且特别是减少蛋白质对水解例如 在体内的蛋白酶解的易感性。在另一个实施方案中，可能希望缀合标记以促进蛋白质的分 析。此种标记的例子包括放射性同位素、荧光标记和酶底物。在另外一个实施方案中，使化 合物与蛋白质缀合，以促进蛋白质的分离。例如，对具体柱材料具有特定亲和力的化合物可 以与蛋白质缀合。还可能希望修饰蛋白质的免疫原性，例如通过缀合蛋白质，以便隐藏、掩 蔽或遮蔽在蛋白质上的一个或多个免疫原性表位。术语“缀合”作为名词意指修饰的肽，即 具有与之结合以修饰所述肽性质的部分的肽。作为动词，该术语意指使部分与肽结合以修 饰所述肽性质的过程。在一个实施方案中，本发明提供了改善靶化合物或蛋白质的药理学性质的方法。 改善就相应未修饰的蛋白质而言。此种药理学性质的例子包括功能体内半衰期、免疫原性、 肾过滤、蛋白酶保护和清蛋白结合。术语“功能体内半衰期”以其正常含义使用，即在其下蛋白质或修饰的蛋白质的 50%生物活性仍存在于身体/靶器官中的时间，或在其下蛋白质或修饰的蛋白质活性是其 起始值的50%的时间。作为测定功能体内半衰期的替代方案，可以测定“体内血浆半衰期”， 即在其下在被清除前50%修饰的蛋白质在血浆或血流中循环的时间。血浆半衰期的测定通 常比测定功能半衰期更简单，并且血浆半衰期的量级通常是功能体内半衰期量级的良好指 示。血浆半衰期的替代术语包括血清半衰期、循环半衰期、循环的半衰期、血清清除、血浆清 除和清除半衰期。与功能体内半衰期或血浆半衰期结合使用的术语“增加的”，用于指相对于未修饰 的(亲本)蛋白质的那种，修饰的蛋白质的相关半衰期统计学上显著地增加，如在可比较条 件下测定的。例如，相关半衰期可以增加至少约25 %，例如至少约50 %，例如至少约100 %、 150 %、200 %、250 %或500 %。在一个实施方案中，相对于亲本蛋白质的半衰期，本发明的化 合物显示至少约5小时、优选至少约24小时、更优选至少约72小时且最优选至少约7天的 半衰期中的增加。体内血浆半衰期的测量可以以如文献中描述的许多方法来进行。体内血浆半衰期 中的增加可以定量为清除(CL)中的减少或平均滞留期(MRT)中的增加。如在合适测定中 测定的，对于其CL减少至亲本蛋白质CL的小于70%、例如小于50%、例如小于20%、例如 小于10%的本发明修饰的蛋白质被说成具有增加的体内血浆半衰期。在合适测定中对于其 MRT增加至亲本蛋白质MRT的大于130%、例如大于150%、例如大于200%、例如大于500% 的本发明修饰的蛋白质被说成具有增加的体内血浆半衰期。清除和平均滞留期可以在标准 药物代谢动力学研究中使用合适的测试动物进行评估。选择对于给定蛋白质合适的测试动 物在本领域技术人员的能力内。当然，在人中的测试代表最终测试。一般地并且作为例子， 小鼠、大鼠、犬、猴或猪注射入目的化合物。注射的量依赖于测试动物。随后，如对于CL和 MRT评估合适的，在1至5天的时间段内获取血样。通过ELISA技术方便地分析血样。
术语化合物的“免疫原性”指化合物当施用于人时，引发有害免疫应答的能力，无 论是体液、细胞还是两者。在任何人亚群中都可能存在显示对特定施用的蛋白质的敏感性 的个体。使用本领域已知的常规方法，通过定量在敏感个体中生长激素抗体和/或生长激 素应答性T细胞的存在可以测量免疫原性。在一个实施方案中，相对于敏感个体的亲本蛋 白质的免疫原性，本发明的修饰的蛋白质显示在那个个体中免疫原性的至少约10%、优选 至少约25%、更优选至少约40%且最优选至少约50%的减少。
如本文所使用的，术语“蛋白酶保护”或“蛋白酶保护的，，意指本发明修饰的蛋白 质对血浆肽酶或蛋白酶比亲本蛋白质更有抵抗力。已知血浆中存在的蛋白酶和肽酶牵涉于 循环蛋白质的降解。通过下述降解测定来测定蛋白质对通过例如二肽基氨肽酶IV(DPPIV)降解的抗 性在100 μ L 0. IM三乙胺-HCl缓冲液，PH 7. 4中，使等分试样的蛋白质(5nmol)和与5mU 酶促活性对应的1 μ L纯化二肽基氨肽酶IV在37°C下温育10-180分钟。通过加入5 μ L 10%三氟乙酸终止酶促反应，并且分离蛋白质降解产物且使用HPLC分析进行定量。用于执 行这种分析的一种方法是根据Siegel等人，Regul. P印t. 1999 ；79 :93_102和Mentlein等 人Eur. J. Biochem. 1993 ；214 :829_35，将混合物应用到 Vydac C18 wid印ore (30nm 孔，5 μ m 颗粒)250x4. 6mm柱内，并且以lml/分钟的流速用溶于0. 1 %三氟乙酸的乙腈线性逐步梯度 (0%乙腈3分钟、0-24%乙腈17分钟、24-48%乙腈1分钟)洗脱。蛋白质及其降解产物可 以通过其在220nm(蛋白质键)或280nm(芳族氨基酸)的吸光度进行监控，并且通过与标 准的那些相关的其峰面积积分进行定量。在导致小于10%的蛋白质被水解的温育时间下估 计蛋白质通过二肽基氨肽酶IV的水解率。在一个实施方案中，修饰的蛋白质的水解率是亲 本蛋白质那种的小于70%、例如小于40%、例如小于10%。哺乳动物物种的循环血液中最丰富的蛋白质组分是血清清蛋白，其通常以约3至 4. 5克/100毫升全血的浓度存在。血清清蛋白是约70，000道尔顿的血液蛋白质，其在循 环系统中具有几种重要功能。它充当在血液中发现的多种有机分子的转运蛋白，充当各种 代谢物例如脂肪酸和胆红素通过血液的主要转运蛋白，并且由于其丰度，充当循环血液的 渗透调节物。血清清蛋白具有超过一周的半衰期，并且增加蛋白质血浆半衰期的一种方法 是使蛋白质与和血清清蛋白结合的基团缀合。清蛋白结合性质可以如引入本文作为参考的 J. Med. Chem, 43, 2000,1986-1992 中所述进行测定。在一个方面，本发明修饰的蛋白质可以通过Rl和或R2的进一步衍生进行进一步 修饰。具体地，Rl和/或R2可以包括适合于进一步修饰的化学基团。此种修饰可以包括 选自下述的化学基团的缀合树状聚体、聚环氧烷(ΡΑ0)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇(PPG)、分支PEGs、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-马 来酸酐共聚物、苯乙烯_马来酸酐共聚物、葡聚糖、羧甲基_葡聚糖；血清蛋白质结合配体， 例如与清蛋白结合的化合物，例如脂肪酸、C5-C24脂肪酸、脂族二酸(例如C5-C24)、抑制聚 糖与受体(例如脱唾液酸糖蛋白受体和甘露糖受体)结合的结构(例如唾液酸衍生物或模 拟物)、包含在生理条件下改变电荷性质的部分的小有机分子，例如羧酸或胺，或阻止聚糖 特异性识别的中性取代基例如较小的烷基取代基(例如C1-C5烷基)、低分子量有机荷电 原子团(例如C1-C25)，其可以包含一种或多种羧酸、胺磺酸(amines sulfonic)、膦酸或其 组合；低分子中性亲水分子(例如C1-C25)，例如可以任选分支的环糊精或聚乙烯链；具有2-40KDa平均分子量的聚乙二醇；定义明确的精确聚合物，例如具有700至20. OOODa、或更 优选700-10. OOODa之间的精确分子量的树状聚体；和基本上非免疫原性多肽例如清蛋白 或抗体或任选包含Fc结构域的抗体部分。在一个实施方案中，本发明修饰的蛋白质是聚乙二醇化的(PEGylated)。术语 “PEG”意指分子量约100至约1，000, OOODa的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端 OH-基团已由烷氧基例如甲氧基、乙氧基或丙氧基替代。具体地，其中末端-OH基团已由甲 氧基替代的PEG称为mPEG。术语“mPEG” (或更适当地“mPEG基(mPEGyl) ”)指结构的多分散或单分散原子
团<formula>formula see original document page 10</formula>其中m是大于1的整数。因此，其中m是90的mPEG具有3991Da的分子量，即约 4kDa。同样地，具有20kDa平均分子量的mPEG具有454的m平均值。由于用于产生mPEG 的方法，这些分子经常具有分子量的分布。这种分布由多分散性指数描述。如本文所使用的，术语“多分散性指数”指重均分子量和数均分子量之间的比， 如聚合物化学领域中已知的(参见例如，“Polymer Synthesisand Characterization", J. A. Nairn, University of Utah，2003)。多分散性指数是大于或等于1的数字，并且它可 以由凝胶渗透层析(GelPermeation Chromatographic)数据进行估计。当多分散性指数是 1时，产物是单分散的，并且因此由具有单一分子量的化合物组成。当多分散性指数大于1 时，它是那种聚合物的多分散性的量度，即具有不同分子量的聚合物的分布如何广泛。在式、化合物名称或分子结构中例如“mPEG20000”的使用指示其中mPEG是多分散 的并且具有约20kDa分子量的mPEG残基。多分散性指数一般随着PEG或mPEG分子量而增加。当参考20kDa PEG且特别 是20kDa mPEG时，它意指具有低于1. 06的多分散性指数的化合物(或事实上化合物的混 合物)，例如低于1. 05、例如低于1. 04、例如低于1. 03、例如在1. 02和1. 03之间。当参考 30kDa PEG且特别是30kDa mPEG时，它意指具有低于1. 06的多分散性指数的化合物(或事 实上化合物的混合物)，例如低于1. 05、例如低于1. 04、例如低于1. 03、例如在1. 02和1. 03 之间。当参考40kDa PEG且特别是40kDa mPEG时，它意指具有低于1. 06的多分散性指数 的化合物(或事实上化合物的混合物)，例如低于1. 05、例如低于1. 04、例如低于1. 03、例 如在1. 02和1. 03之间。通过Rl和/或R2基团的进一步衍生与修饰的蛋白质缀合的PEG或mPEG可以具有 任何分子量。具体地，分子量可以在500和1000，OOODa之间、例如在500和500，OOODa之 间、例如在500和100，OOODa之间、例如在500和60，OOODa之间、例如在1000和40，OOODa 之间、例如在5000和40，OOODa之间。具体地，可以使用具有在10，OOODa和40，OOODa之间、 例如在 20，OOODa 和 40，OOODa 之间、例如在 20，000 和 30，OOODa 或在 30，000 和 40，OOODa 之间的分子量的PEG。特别提及具有10，000,20, 000,30, 000或40，OOODa分子量的PEG或 mPEG。在一个实施方案中，Rl和/或R2包括已知与血浆蛋白质例如清蛋白结合的一种或 多种部分。化合物与清蛋白结合的能力可以如引入本文作为参考的J.Med. Chem，43，2000，1986-1992中所述进行测定。在本背景中，如果Ru/Da高于0. 05、例如高于0. 10、例如高于 0. 12或甚至高于0. 15，那么化合物定义为与清蛋白结合。在本发明的另一个实施方案中，清蛋白结合部分是蛋白质，例如包括小于40个 氨基酸残基的蛋白质。其为清蛋白结合部分的许多小蛋白质公开于引入本文作为参考的 J.Biol Chem. 277，38(2002)35035-35043 中。如上文讨论的，修饰性质基团的直接缀合是已知的(例如，通过使用TGase经由Gln残基与含Gln蛋白质缀合的胺官能化PEG或脂肪酸)。然而，当衍生靶化合物例如治疗 蛋白质时，此种缀合有时可以缺乏所需特异性。此外，从例如EP 950665,EP 785276, Sato, Adv. DrugDelivery Rev.，54，459—476，2002 禾口 Wada，Biotech. Lett.，23，1367—1372，2001 中公开的例子显而易见的是，需要显著过量(最高达100-1000倍)的待与蛋白质缀合的化 合物用于反应进行。此种过量对反应在技术或大规模中的利用构成限制。例如，具有小多分 散性指数的mPEG是非常昂贵的，并且关于大量过量的需求实际上是不容许的。此外，对于 大的部分例如PEG IOkDa或PEG 20k Da的缀合，由于此种化合物的分子量，以100-1000倍 级别的试剂过量是不可行的。还众所周知的是，大量PEG的存在可能使蛋白质即待修饰的 蛋白质和转谷氨酰胺酶沉淀。与此形成对比的是，本方法提供下述优点在酶促步骤中需要 大量过量的反应物是即使以大量过量也容易处理的小分子。通过正确选择在第二个步骤中 待形成的键，不需要大量过量，因为例如在几乎等摩尔量的胺和酮官能性(functionality) 下发生肟形成。本发明的靶化合物本发明的靶化合物优选是蛋白质或蛋白质。具体地，根据本发明的方法，蛋白质必 须是转谷氨酰胺酶的底物。在一个方面，靶化合物包含至少一个Lys残基且优选至少2个 Lys残基。如果靶化合物本身不是转谷氨酰胺酶底物，那么可能在蛋白质中插入一个或多个 Gln或Lys残基，并且特别是Lys残基，以使得蛋白质成为转谷氨酰胺酶的底物。原则上，此 种Gln或Lys残基可以在序列中的任何位置处插入，然而，它优选在其中蛋白质的生理例如 治疗活性不受影响至蛋白质例如在治疗干预中不再有用的程度的位置处插入。氨基酸残基 在蛋白质中的插入可以通过本领域技术人员已知的标准技术来达到，例如翻译后化学修饰 或转基因技术。其为转谷氨酰胺酶底物的任何靶化合物或蛋白质都可以通过本发明的方法进行 修饰，例如酶、蛋白质激素、生长因子、抗体、细胞因子、受体、淋巴因子和疫苗抗原，并且 特别提及治疗蛋白质，例如胰岛素、胰高血糖素样蛋白质I(GLP-I)、胰高血糖素样蛋白质 2(GLP-2)、生长激素、细胞因子、三叶因子蛋白质(TFF)、蛋白质黑皮质素受体改性剂和因 子VII化合物。因此，本发明的靶化合物包括例如hGH、促乳素或任何其他细胞因子；胰岛 素、GLPl或任何其他蛋白质激素；抗体或由其衍生的片段；活化因子VII、活化因子IX、因子 VIII、因子XIII、或任何其他凝固因子。将获益于修饰基团的更选择性引入的一种此种蛋白质是生长激素。生长激素(GH) 或促生长素(STH)是蛋白质激素，其在人和其他动物中刺激生长和细胞繁殖。它是191-氨 基酸、单链多肽激素，其通过在垂体前叶腺的侧翼内的促生长素细胞合成、贮存且分泌。具 体地，关于人生长激素的基因位于染色体17的q22_24区域中，并且与人绒毛膜生长催乳激 素(hCS，也称为胎盘催乳激素)基因紧密相关。GH、人绒毛膜生长催乳激素(hCS)和促乳素(PRL)是具有生长促进和生乳活性的一组同源激素。如上所述，人生长激素的主要同工型是191个氨基酸(SEQ IDNOs 1和2)和约 22，000道尔顿分子量的蛋白质。结构包括与GH受体的功能相互作用所必需的4个螺旋。 GH在结构和外观上与促乳素和绒毛膜生长催乳激素在进化上同源。尽管在来自不同物种的 生长激素之间的显著结构相似性，但仅人和灵长类动物生长激素在人中具有显著作用。人 GH 的剪接变体显示于 SEQ ID NO :3 中。还参见，Boguszewski 等人，J. Clin. Endocrinol. Metab.83(8) :2878_2885(1998)。术语“生长激素化合物”意指人生长激素(hGH)，其中一个或多个氨基酸残基已缺 失和/或由其他氨基酸残基替代，天然或非天然的，和/或包括另外氨基酸残基的hGH，天然 或非天然的，和/或其中至少一个有机取代基与一个或多个有机取代基结合的hGH。特别提 及191天然氨基酸序列(生长激素)和192氨基酸N末端甲硫氨酸种类(人长高激素)。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括其中作为一组的氨基酸编 号 172、174、176 和 178 由下述氨基酸组之一替代(R、S、F、R) ； (R、A、Y、R)、(K、T、Y、K) ； (R、 S、Y、R) ； (K、A、Y、R) ； (R、F、F、R) ； (K、Q、Y、R) ； (R、T、Y、H) ； (Q、R、Y、R) ； (K、K、Y、K) ； (R、 S、F、S)或(K、S、N、R)，如引入本文作为参考的WO 92/09690 (Genentech)中公开的。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括具有下述置换的hGH: G120R、G120K、G120Y、G120F 和 G120E，如引入本文作为参考的 US 6，004931 (Genentech)中 公开的。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括具有下述置换组的hGH: R167N、D171S、E174S、F176Y 和 I179T ；R176E、D171S、E174S 和 F176Y ；F10A、M14W、H18D 禾口 H21N；F10A、M14W、H18D、H21N、R167N、D171S、E174S、F176Y、I179T；F10A、M14W、H18D、H21N、 R167N、D171A、E174S、F176Y、I179T ；F10H、M14G、H18N 和 H21N ；F10A、M14W、H18D、H21N、 R167N、D171A、T175T 和 I179T ；和 F10I、M14Q、H18E、R167N、D171S 和 I179T，如引入本文作 为参考的US 6，143，523 (Genentech)中公开的。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括具有下述置换组的hGH: H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174A 和 G120K,如引入本文作为参考的 US 6，136，536 (Genentech)中公开的。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括具有下述置换组的hGH: H18D、H21N、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S、I179T，并且其中 G120 进一步由 R、K、W、Y、 F或E置换，如引入本文作为参考的US 6,057, 292 (Genentech)中公开的。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括具有下述置换组的hGH: H18D、H21N、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S 和 I179T,如引入本文作为参考的 US 5，849，535 (Genentech)中公开的。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括具有下述置换组的hGH: H18D、H21D、R167N、K168A、D171S、K172R、E174S 和 I179T ；以及 H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、 E65A、K168A和E174A，如引入本文作为参考的WO 97/11178 (Genentech)中公开的。在本发明中可应用的生长激素化合物的其他例子包括具有下述置换组的hGH: K168A 和 E174A ；R178N和 I179M ；K172A 和 F176A ；以及 H54F、S56E、L58I、E62S、D63N和 Q66E, 如引入本文作为参考的WO 90/04788 (Genentech)中公开的。
当本发明的方法对包括hGH的靶化合物执行时，反应导致选自下述的至少一 个 Lys 的选择性修饰Lys64、Lys67、Lys96、Lysl41、Lysl66、Lysl71、Lysl84、Lysl94 和 Lysl98。在优选实施方案中，主要修饰SEQ ID NO :2的一个单个赖氨酸Lysl71。在另一个 实施方案中，修饰至少2个LyS。在另外一个实施方案中，Lysl71用一个性质修饰基团进行修饰，并且第二个Lys 用第二个、不同的性质修饰基团进行修饰，如本文公开的。将获益于本发明的方法的另一种蛋白质是胰岛素，并且具体地人胰岛素。在本背 景中，术语“人胰岛素”指天然产生的胰岛素或重组产生的胰岛素。重组人胰岛素可以在任 何合适的宿主细胞中产生，例如宿主细胞可以是细菌、真菌(包括酵母)、昆虫、动物或植物 细胞。许多胰岛素化合物已公开于文献中，并且它们在本发明的方法中也特别有用。“胰岛 素化合物”(和相关表达)指其中一个或多个氨基酸已缺失和/或由其他氨基酸残基包括 非编码氨基酸替代的人胰岛素，和/或包括另外氨基酸即超过51个氨基酸的人胰岛素，和 /或其中至少一个有机取代基与一个或多个氨基酸结合的人胰岛素。下述专利文件作为可在由本发明提供的方法中具体应用的胰岛素化合物的公开 内容提及。引入本文作为参考的WO 97/31022 (Novo Nordisk)公开了具有延长的活性概况的 胰岛素化合物，其中B链N末端氨基酸的氨基和/或LysB29的ε -氨基具有包含亲脂取代 基的羧酸。特别提及 Neb29-(CO-(CH2)14-COOH)人胰岛素；Neb29-(CO-(CH2) 16_C00H)人胰岛 素；nε b29_ (co_ (cig 18_⑶0H)人胰岛素；Nε B29- (CO- (CH2) 2。_C00H) ;Nε B29_ (CO- (CH2) 22_C00H) 人胰岛素；ΝεB29-(C0-(CH2)14-C00H)AspB28-人胰岛素；ΝεΒ29_(CO-(CH2) 16-C00H)AspB28-人胰 岛素；ΝεB29-(C0-(CH2)18-C00H) AspB28-人胰岛素；ΝεΒ29_(CO-(CH2)2(l-C00H)ASpB28-人胰岛素； Nε B29- (CO- (CH2) 22-C00H) Aspb28-人胰岛素；Nε Β3°- (CO- (CH2) 14_C00H) ThrB29LysB30-人胰岛素； Nε B30- (CO- (CH2) 16-C00H) Thre29LysB30-人胰岛素；ΝεΒ3(ι-(CO-(CH2) 18_C00H) ThrB29LysB3°-人 胰岛素；^-(0)-(012)2(1-0)0!1)1111^291^#3°-人胰岛素；ΝεΒ3°-(CO-(CH2)22-COOH) ThrB29LysB3 -人胰岛素；Nε B28_ (CO-(CH2) 14_C00H) LySB28Pr0B29-人胰岛素； Nε B28-(C0-(CH2)16-C00H) LysB28ProB29_ 人胰岛素；Nε B28- (CO- (CH2) 18-C00H) LysB28ProB29-人 胰岛素；N εΒ28_ (CO-(CH2)2tl-COOH) LysB28ProB29-人胰岛素；N εΒ28_ (CO-(CH2)22-COOH) LysB28ProB29-人胰岛素；ΝεΒ29_ (CO-(CH2) 14_C00H) desB30 人胰岛素；NεΒ29_ (CO-(CH2) 16_C00H) desB30 人胰岛素；NEB29-(C0-(CH2)18-C00H)desB30 人胰岛素;ΝεΒ29_ (CO-(CH2)20-COOH) desB30 人胰岛素；和 ΝεΒ29_ (CO-(CH2) 22C00H)desB30 人胰岛素。引入本文作为参考的WO 96/29344(Novo Nordisk)公开了具有延长的活性概况的 胰岛素化合物，其中B链N末端氨基酸的氨基具有附着的包含12-40个碳原子的亲脂取代 基，或其中B链C末端氨基酸的羧酸基团具有附着的包含12-40个碳原子的亲脂取代基。
引入本文作为参考的WO 95/07931 (Novo Nordisk)公开了具有延长的活性概况的 胰岛素化合物，其中LysB29的氨基具有亲脂取代基。特别提及ΝεΒ29_十三酰des(B30) 人胰岛素、ΝεΒ29_十四酰des(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_癸酰des(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_十二酰 des(B30)人胰岛素、Neb29-十三酰 GlyA21des(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十四酰 GlyA21des (B30) 人胰岛素、ΝεΒ29_癸酰GlyA21des(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_十二酰GlyA21des (B30)人胰岛 素、Neb29-十三酰 GlyA21GlnB3des(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十四酰 GlyA21GlnB3des (Β30)人胰岛素、Neb29-癸酰 GlyA21GlnB3des(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十二酰 GlyA21GlnB3des (B30)人胰 岛素、ΝεΒ29_十三酰AlaA21deS(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_十四酰AlaA21deS (B30)人胰岛素、 Neb29-癸酰 AlaA21deS(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十二酰 AlaA21deS (B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十三 酰 AlaA21GlnB3des (Β30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十四酰 AlaA21GlnB3des (B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 癸酰 AlaA21GlnB3des(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十二酰 AlaA21GlnB3des (B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十三酰 GlnB3des (B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 十四酰 GlnB3deS (B30)人胰岛素、ΝεΒ29_ 癸酰 GlnB3deS (B30) 人胰岛素、ΝεΒ29_十二酰GlnB3deS(B30)人胰岛素、ΝεΒ29_十三酰GlyA21人胰岛素、ΝεΒ29_十四 酰GlyA21人胰岛素、Neb29-癸酰GlyA21人胰岛素、Neb29-十二酰GlyA21人胰岛素、Neb29-十三 酰GlyA21GlnB3人胰岛素、ΝεΒ29_十四酰GlyA21GlnB3人胰岛素、Neb29-癸酰GlyA21GlnB3人胰 岛素、ΝεΒ29_十二酰GlyA21GlnB3人胰岛素、Neb29-十三酰AlaA21人胰岛素、Neb29-十四酰 AlaA21人胰岛素、Neb29-癸酰AlaA21人胰岛素、ΝεΒ29_十二酰AlaA21人胰岛素、Neb29-十三酰 AlaA21GlnB3人胰岛素、ΝεΒ29_十四酰AlaA21GlnB3人胰岛素、ΝεΒ29_癸酰AlaA21GlnB3人胰岛素、 Neb29-十二酰AlaA21GlnB3人胰岛素、Neb29-十三酰GIiib3人胰岛素、Neb29-十四酰GIiib3人胰 岛素、νεβ29_癸酰giiib3人胰岛素、neb29-十二酰giiib3人胰岛素、neb29-十三酰giub3q人胰 岛素、νεβ29_十四酰g1uB3°人胰岛素、neb29-癸酰g1uB3°人胰岛素、neb29-十二酰g1uB3°人胰 岛素、ΝεΒ29_十三酰GlyA21GluB3°人胰岛素、NεΒ29十四酰GlyA21GluB3°人胰岛素、Neb29-癸酰 GI7a21GIub30 人胰岛素、Neb29-十二酰 GlyA21GluB3° 人胰岛素、Neb29-十三酰 GlyA21GlnB3GlUB3° 人胰岛素、ΝεΒ29_十四酰GlyA21GlnB3GlUB3°人胰岛素、ΝεΒ29_癸酰GlyA21GlnB3GlUB3°人胰岛素、 Neb29-十二酰 GlyA21GlnB3GluB3° 人胰岛素、Neb29-十三酰 AlaA21GluB3° 人胰岛素、ΝεΒ29_ 十四 酰 AlaA21GluB3° 人胰岛素、Neb29 癸酰 AlaA21GluB3° 人胰岛素、Neb29-十二酰 AlaA21GluB3° 人胰 岛素、ΝεΒ29_ 十三酰 AlaA21GlnB3GlUB3° 人胰岛素、ΝεΒ29_ 十四酰 AlaA21GlnB3GlUB3° 人胰岛素、 Neb29-癸酰 AlaA21GlnB3GlUB3° 人胰岛素、ΝεΒ29_ 十二酰 AlaA21GlnB3GlUB3° 人胰岛素、ΝεΒ29_ 十三 酰GlnB3GluB3°人胰岛素、Neb29-十四酰GlnB3GluB3°人胰岛素、Neb29-癸酰GlnB3GluB3°人胰岛 素和Neb29-十二酰GlnB3GluB3°人胰岛素。引入本文作为参考的WO 97/02043 (Novo Nordisk)公开了在胰岛素预防中有用 的激素失活的胰岛素化合物，并且特别地人胰岛素的此种类似物选自desAl人胰岛素； des(Al-A2)人胰岛素；des(Al-A3)人胰岛素；desA21人胰岛素；des(Bl-B5)人胰岛素； des(Bl-B6)人胰岛素；des (B23-B30)人胰岛素；des (B24-B30)人胰岛素；des (B25-B30)人 胰岛素；GlyA2人胰岛素；AlaA2人胰岛素；NleA2人胰岛素；ThrA2人胰岛素；ProA2人胰岛素； D-allo IleA2人胰岛素；NvaA3人胰岛素；NleA3人胰岛素；LeuA3人胰岛素；ValA2，IleA3人胰 岛素；AbuA2，AbuA3人胰岛素；GlyA2，GlyA3人胰岛素；D_CysA6人胰岛素；D_CysA6，D-Cysm人胰 岛素；SerA6，SerAn, des(A8-A10)人胰岛素；D_CysA7 人胰岛素；D-Cysm 人胰岛素；LeuA19 人 胰岛素；GlyB6人胰岛素；GIub12人胰岛素；AsnB12人胰岛素；PheB12人胰岛素；D_AlaB12人胰岛 素；和AspB25人胰岛素，可在本发明的方法中应用。
引入本文作为参考的WO 92/15611 (Novo Nordisk)公开了在胰岛素受体结合过 程中具有快速结合速率常数的人胰岛素类似物，并且特征在于在位置A13中包括酪氨酸和 /或在位置B17中包括苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。具体地，此种类似物选自TyrA13人胰岛 素、PheB17人胰岛素、TrpB17人胰岛素、TyrB17人胰岛素、TyrA13，Phem7人胰岛素、TyrA13，Trpm7 人胰岛素、TyrA13, TyrB17 人胰岛素、PheA13，Phem7 人胰岛素、PheA13，TrpB17 人胰岛素、PheA13，Tyrm7人胰岛素、TrpA13, PheB17人胰岛素、TrpA13, TrpB17人胰岛素和TrpA13，Tyrm7人胰岛素。引入本文作为参考的WO 92/00322 (Novo Nordisk)公开了人胰岛素类似物，其能够靶向特定组织，并且特征在于在胰岛素分子的A13位置和/或B17位置中具有不同于亮 氨酸的天然存在的氨基酸残基和/或在胰岛素分子的B18位置中具有不同于缬氨酸的天 然存在的氨基酸残基。具体地，此种类似物选自AlaB17人胰岛素、AlaB18人胰岛素、AsnA13人 胰岛素、AsnA13，Alam7人胰岛素、AsnA13，Aspm7人胰岛素、AsnA13，GIub17人胰岛素、AsnB18人胰 岛素、Aspa13人胰岛素、AspA13，Alam7人胰岛素、AspA13，Aspm7人胰岛素、AspA13，GIub17人胰岛 素、Aspb18人胰岛素、GIiia13人胰岛素、GlnA13，Alam7人胰岛素、GlnA13，Aspm7人胰岛素、GlnB18 人胰岛素、GIua13人胰岛素、G1uA13，Alam7人胰岛素、GluA13，Aspm7人胰岛素、GluA13，GIub17人 胰岛素、GIub18人胰岛素、GlyA13人胰岛素、GlyA13, Alam7人胰岛素、GlyA13，Asnm7人胰岛素、 GlyA13，Aspm7人胰岛素、GlyA13，Glum7人胰岛素、Glym8人胰岛素、SerA13人胰岛素、SerA13, GlnA17, Glumo, GlnB17-des (ThrB30)人胰岛素、SerA13, Alam7 人胰岛素、SerA13, Asnm7 人胰岛素、 SerA13, Aspm7 人胰岛素、SerA13, Glnm7 人胰岛素、SerA13, GIub17 人胰岛素、SerA13, ThrB17 人胰 岛素、SerB14，Aspm7人胰岛素、Serm8人胰岛素、ThrA13人胰岛素或ThrB18人胰岛素。引入本文作为参考的WO 90/01038 (Novo Nordisk)公开了具有高生物活性的人 胰岛素类似物，并且特征在于具有由His或Tyr置换的PheB25，在位置A4、A8、A17、A21、B9、 B10、B12、B13、B21、B26、B27、B28和B30中的一个或多个中具有置换，以及在任选不存在的 位置B30处具有氨基酸残基。具体地，此种类似物选自TyrB25人胰岛素、TyrB25, AspB28人胰 岛素、HisB25人胰岛素、HisB25, Aspe28人胰岛素、TyrB25人胰岛素-B30-酰胺和HisB25人胰岛 素-B30-酰胺。引入本文作为参考的WO 86/05496 (Novo Nordisk)公开了具有延长的作用的人 胰岛素类似物，并且特征在于具有封闭的B30羧基，以在位置A4、A17、A21、B13和B21处 的氨基酸残基中具有1至4个封闭的羧基。具体地，此种类似物选自胰岛素-B30-辛酯、 胰岛素-B30-十二烷酰胺、胰岛素-B30-十六烷酰胺、胰岛素-(B21，B30)- 二甲酯、胰岛 素-(B17，B30)-二甲酯、胰岛素-(A4，B30) 二酰胺、胰岛素-A17酰胺-B30-辛酯、胰岛 素-(A4，B13)- 二酰胺-B30-己酰胺、胰岛素_(A4，A17，B21, B30)-四酰胺、胰岛素-(A17， B30)- 二酰胺、A4-Ala-胰岛素-B30-酰胺和B30_Leu-胰岛素_(A4，B30)- 二酰胺。引入本文作为参考的WO 86/05497 (Novo Nordisk)公开了胰岛素化合物，其中 位置A4、A17、B13和B21中的4个氨基酸残基中的一个或多个包括不带电侧链。特别 提及人胰岛素A17-Gln、人胰岛素A4-Gln、猪胰岛素B21_Gln、人胰岛素B13_Gln、人胰 岛素(A17，B21) -Gin、人胰岛素A4_Ala、人胰岛素B21_Thr、人胰岛素B13_Val、人胰岛 素-Thr-A17-Gln、人胰岛素B21-甲酯和人胰岛素A17-甲酯。引入本文作为参考的WO 92/00321 (Novo Nordisk)公开了具有延长的活性的胰岛 素化合物，其中已引入在B链N末端中的正电荷。特别提及ArgB5，SerA21, Thre30-NH2人胰岛 素、ArgB5，ProB6, SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB5，GlyA21，Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB5，ProB6, GlyA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB2，SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB2，ProB3, SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB2，GlyA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB2，ProB3, GlyA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB2， ArgB3, SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB2，ArgB3，SerA21 人胰岛素、ArgB4，ProB5，SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB4, ArgB5, ProB6, GlyA21，ThrB30 人胰岛素、ArgB3, GlyA21，Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB3, SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB4，GlyA21, Thre30-NH2 人胰岛素、ArgB4，SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素和 ArgB1，ProB2, GlyA21，Thre30-NH2 人胰岛素。引入本文作为参考的WO 90/07522 (Novo Nordisk)公开了在溶液中显示低结合能力的胰岛素化合物，其中在位置B28中存在带正电氨基酸残基，即Lys或Arg。 特别提及des[PheB25]-人胰岛素、des[TyrB26]-人胰岛素、des[ThrB27]-人胰岛素、 des[Pr0B28]-人胰岛素、deS[PheB25]-猪胰岛素、des[Pr0B28]-猪胰岛素、des[ProB28]-兔 胰岛素、des[PheB25], des[ThrB30]-人胰岛素、des[TyrB26], des[ThrB30]-人胰岛素、 [SerA21]-deS[Pr0B28]-人胰岛素、[GlyA21]-deS[Pr0B28]-人胰岛素、[GlyA21]-des[PheB25]-A 胰岛素、[ASpA21]-deS[PheB25]-人胰岛素、[HisB25]-des[TyrB26], des [ThrB3°]-人胰岛素、 [AsnB25]-des[TyrB26], des [ThrB3°]-人胰岛素、[AspA21]-des [PheB25], des [ThrB3°]-人胰岛 素、[AspB28]-des [PheB25]_ 人胰岛素、[AspB3]-des [PheB25]-人胰岛素、[LysB28]-人胰岛素、 [LysB28, ThrB29]_ 人胰岛素和[ArgB28]-des[LySB29]-人胰岛素。引入本文作为参考的WO 90/11290 (Novo Nordisk)公开了具有延长的活性的胰岛 素化合物。特别提及[ArgA°]-人胰岛素-(B30-酰胺)、[ArgA°，GIiib13]-人胰岛素-(B30-酰 胺)、[ArgA0, GlnA4, AspA21]-人胰岛素-(B30-酰胺)、[ArgA0, SerA21]-人胰岛素-(B30-酰 胺)和[ArgA°，ArgB27]-des[ThrB3°]-人胰岛素。引入本文作为参考的WO 90/10645 (Novo Nordisk)公开了糖基化胰岛素。特别提 及Phe (Bi)葡萄糖人胰岛素、Phe (Bi)甘露糖人胰岛素、Gly (Al)甘露糖人胰岛素、Lys (B29) 甘露糖人胰岛素、Phe(Bl)半乳糖人胰岛素、Gly(Al)半乳糖人胰岛素、Lys (B29)半乳糖 人胰岛素、Phe(Bl)麦芽糖人胰岛素、Phe(Bl)乳糖人胰岛素、Gly(Al)葡萄糖人胰岛素、 Gly(Al)麦芽糖人胰岛素、Gly (Al)乳糖人胰岛素、Lys (B29)葡萄糖人胰岛素、Lys (B29)麦 芽糖人胰岛素、Lys (B29)乳糖人胰岛素、Gly (Al)，Phe (Bi) 二葡萄糖人胰岛素、Gly (Al)， Lys (B29) 二葡萄糖人胰岛素、Phe (Bi)，Lys (B29) 二葡萄糖人胰岛素、Phe (Bi)异麦芽糖人 胰岛素、Gly (Al)异麦芽糖人胰岛素、Lys (B29)异麦芽糖人胰岛素、Phe (Bi)麦芽三糖人胰 岛素、Gly(Al)麦芽三糖人胰岛素、Lys (B29)麦芽三糖人胰岛素、Gly (Al)，Phe(Bl) 二麦 芽糖人胰岛素、Gly(Al), Lys (B29) 二麦芽糖人胰岛素、Phe(Bl), Lys (B29) 二麦芽糖人胰 岛素、Gly(Al)，Phe(Bl) 二乳糖人胰岛素、Gly (Al)，Lys (B29) 二乳糖人胰岛素、Phe (Bi)， Lys (B29) 二乳糖人胰岛素、Gly (Al)，Phe (Bi) 二麦芽三糖人胰岛素、Gly (Al)，Lys (B29) 二 麦芽三糖人胰岛素、Phe (Bi)，Lys (B29) 二麦芽三糖人胰岛素、Phe (Bi)，Gly (Al) 二甘露糖 人胰岛素、Phe (Bi)，Lys (B29) 二甘露糖人胰岛素、Gly (Al)，Lys (B29) 二甘露糖人胰岛素、 Phe(Bl), Gly(Al) 二半乳糖人胰岛素、Phe (Bi)，Lys (B29) 二半乳糖人胰岛素、Gly (Al)， Lys (B29) 二半乳糖人胰岛素、Phe (Bi)，Gly (Al) 二异麦芽糖人胰岛素、Phe (Bi)，Lys (B29) 二异麦芽糖人胰岛素、Gly (Al)，Lys (B29) 二异麦芽糖人胰岛素、Phe (Bi)葡萄糖[AspB1°]人 胰岛素和Gly (Al) ,Phe(Bl) 二葡萄糖[Aspmo]人胰岛素。引入本文作为参考的WO 88/065999 (Novo Nordisk)公开了稳定的胰岛素化合物，
其中Ans21A已由其他氨基酸残基置换。特别提及GlyA21人胰岛素、AlaA21人胰岛素、SerA21人 胰岛素、ThrA21人胰岛素和hSerA21人胰岛素。引入本文作为参考的EP 254516 (Novo Nordisk)公开了具有延长的作用的胰岛素 化合物，其中碱性氨基酸残基已由中性氨基酸残基置换。特别提及
GlyA21, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、SerA21, LysB27, Thre30-NH2人胰岛素、ThrA21, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、AlaB21，LysB27，Thre30-NH2 人胰岛素、HisA21，LysB27，Thre30-NH2 人胰 岛素、AspB21, LysB27, Thre30-NN2 人胰岛素、GlyA21, ArgB21, Thre30-NH2 人胰岛素、SerA21, ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、ThrA21，ArgB27，Thre30-NH2 人胰岛素、AlaB21，ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、 HisA21, ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、AspB21，ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13，GlyA21, ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、Glnm3, SerA21, Thre30-NH2 人胰岛素、Glnm3, SerA21, ArgB27, Thre30-NH2 人 胰岛素、GlnB13，ThrA21，ArgB27，Thre30-NH2 人胰岛素、Glnm3, AlaA21, ArgB27，Thre30-NH2 人胰岛 素、Glnm3, HisA21, ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、Glnm3, AspA21，ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、 Glnm3, GlyA21, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13，SerA21, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13， ThrA21, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13，AlaA21, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13，HisA21， LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13，AspA21, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、AsnA21，LysB27 人胰岛 素、SerA21，LysB27 人胰岛素、ThrA21，LysB27 人胰岛素、AlaA21，LysB27 人胰岛素、HisA21，LysB27 人 胰岛素、AspA21，LysB27 人胰岛素、GlyA21，LysB27 人胰岛素、AsnA21，ArgB27 人胰岛素、SerA21，ArgB27 人胰岛素、ThrA21, ArgB27 人胰岛素、AlaA21, ArgB27 人胰岛素、HisA21, ArgB27 人胰岛素、AspA21， ArgB27 人胰岛素、GlyA21，ArgB27 人胰岛素、GlnA17，AsnA21, ArgB27 人胰岛素、GlnA17，SerA21, ArgB27 人胰岛素、GlnA17，ThrA21，ArgB27 人胰岛素、GlnA17，AlaA21，ArgB27 人胰岛素、GlnA17，HisA21，ArgB27 人胰岛素、GlnA17，ASpA21，ArgB27 人胰岛素、GlnA17，GlyA21，ArgB27 人胰岛素、GlnA17，AsnA21，GlnB13 人胰岛素、GlnA17，SerA21，GlnB13 人胰岛素、GlnA17，ThrA21，GlnB13 人胰岛素、GlnA17，AlaA21，GlnB13 人胰岛素、GlnA17，HisA21, Glnm3 人胰岛素、GlnA17，AspA21，Glnm3 人胰岛素、GlnA17，GlyA21，Glnm3 人胰岛素、ArgA27，AsnA21, Glnm3 人胰岛素、ArgA27，SerA21, Glnm3 人胰岛素、ArgA27，ThrA21, Glnm3 人胰岛素、ArgA27，AlaA21, Glnm3 人胰岛素、ArgA27，HisA21, Glnm3 人胰岛素、ArgA27，AspA21, Glnm3 人胰岛素、ArgA27，GlyA21，Glnm3 人胰岛素、GlnA17，AsnA21, LysB27 人胰岛素、GlnA17，SerA21, LysB27 人胰岛素、GlnA17，ThrA21, LysB27 人胰岛素、GlnA17，AlaA21, LysB27 人胰岛素、GlnA17，HisA21，LysB27 人胰岛素、GlnA17，ASpA21，LySB27 人胰岛素、GlnA17，GlyA21，LySB27 人胰岛素、GlnB13，AsnA21，LysB27 人胰岛素、GlnB13，SerA21, LysB27 人胰岛素、GlnB13，ThrA21, LysB27 人胰岛素、GlnB13，AlaA21, LysB27 人胰岛素、GlnB13，HisA21, LysB27 人胰岛素、Glnm3, AspA21, LysB27 人胰岛素和 GlnB13，GlyA21， LysB27人胰岛素。引入本文作为参考的EP 214826 (Novo Nordisk)公开了速效胰岛素化合物。引入本文作为参考的EP 194864(Novo Nordisk)公开了具有延长的作用的胰岛素 化合物，其中碱性氨基酸残基已由中性氨基酸残基置换。特别提及GlnA17，ArgB27，ThrB3°-NH2 人胰岛素、GlnA17, Glnm3, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnA17, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnA17, Lysb27-NH2 人胰岛素、GlnA17，GlnA17, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13，ArgB27, Thre30-NH2 人胰岛素、 Glnm3, LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、GlnB13，LysB30-NH2 人胰岛素、GlnB13，Thre30-NH2 人胰岛素、 ArgB27, Arge30-NH2 人胰岛素、ArgB27，LysB30-NH2 人胰岛素、ArgB27，Thre30-NH2 人胰岛素、LysB27， Arge30-NH2 人胰岛素、LysB27, LysB30-NH2 人胰岛素、LysB27, Thre30-NH2 人胰岛素、LysB29-NH2, des-(B30)人胰岛素，Thre30-NH2 人胰岛素、LysB30-NH2 人胰岛素、LysB30(Lau)-NH2 人胰岛 素、LysB3°，Arge31-NH2 人胰岛素、LysB30, LysB31-NH2 人胰岛素、Arge30-NH2 人胰岛素、ArgB30, Arge31-NH2 人胰岛素和 ArgB3°，LysB31-NH2 人胰岛素。引入本文作为参考的美国专利号3，528，960 (Eli Lilly)公开了 N-羧基芳酰基胰岛素化合物，其中胰岛素分子的1、2或3个伯胺基具有羧基芳酰基。引入本文作为参考的GB专利号1. 492. 997 (Nat. Res. Dev. Corp.)公开了具有改善 的降血糖作用概况的在ΝεΒ29处具有氨基甲酰置换的胰岛素化合物。引入本文作为参考的JP公开(laid-open)专利申请号1-254699 (Kodama Co.， Ltd.)公开了胰岛素化合物，其中烷酰基与PheB1的氨基或与LysB29的ε -氨基或这两者结
I=I O引入本文作为参考的JP公开专利申请号57-067548 (Shionogi)公开了胰岛素化 合物，其中B30位置具有含至少5个碳原子的氨基酸，所述氨基酸不一定由核苷酸三联体编 码。引入本文作为参考的WO 03/053339 (Eli Lilly)公开了胰岛素化合物，其中A链 在N末端中已延伸了 2个氨基酸残基——A-I和A0，其中B链已在N末端处延伸了 2个 氨基酸残基——B-I和B0，其中在位置B28、B29和B39处的氨基酸残基可以置换，并且其 中在位置B28或B29处的Lys的ε _氨基与带正电的氨基酸的α-羧基共价结合，以形成 Lys-N ε -氨基酸衍生物。特别提及所述类似物，其中A-I和B-I都不存在，并且其中AO代 表Arg和BO代表Arg或不存在。选自下述的胰岛素化合物也可应用于本发明的方法i)其中位置B28是Asp、Lys、 Leu、Val 或 Ala 并且位置 B29 是 Lys 或 Pro 的类似物；禾口 ii) des (B28-B30)、des (B27)或 des (B30)人胰岛素，并且特别地其中位置B28是Asp或Lys并且位置B29是Lys或Pro的 胰岛素化合物。其他可应用的胰岛素化合物选自Β29_Νε-肉豆蔻酰-des(B30)人胰岛素、 B29-Nε -棕榈酰-des (B30)人胰岛素、B29-N ε_肉豆蔻酰人胰岛素、Β29-Νε -棕榈酰 人胰岛素、Β28-Νε-肉豆蔻酰LysB28ProB29人胰岛素、Β28_Νε -棕榈酰LySB28Pr0B29人 胰岛素、Β30-Νε-肉豆蔻酰-ThrB29LysB30人胰岛素、B30-N、棕榈酰-ThrB29LysB30人 胰岛素、Β29-Νε- (N-棕榈酰-Y -谷氨酰)-des (B30)人胰岛素、Β29_Νε - (N-石胆酰 (Iithocholyl)-Y-谷氨酰)-des (B30)人胰岛素、Β29_Νε - (ω -羧基十七烷酰)-des (B30) 人胰岛素、Β29-Νε-(ω-羧基十七烷酰)人胰岛素和Β29-Νε-肉豆蔻酰-des(B30)人胰岛
ο将获益于本发明的方法的另一种蛋白质是GLP-1。在本发明的方法中可应用的 GLP-I的例子包括人GLP-I和GLP-I化合物。人GLP-I是源于前胰高血糖素原的37氨基 酸残基蛋白质，其尤其(i.a.)在远端回肠、胰和脑中在L细胞中合成。GLP-I是在葡萄糖 代谢以及胃肠道分泌和代谢中具有调节功能的重要胃肠激素。前胰高血糖素原加工以产生 GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37)和GLP-2主要在L细胞中发生。片段GLP-I (7-36)-酰胺 和GLP-I (7-37)都是葡萄糖依赖性促胰岛素试剂。在过去数十年中，GLP-I的许多结构类 似物从希拉毒蜥蜴(钝尾毒蜥(Heloderma suspectum)和珠毒蜥(Heloderma horridum)) 毒液中分离。毒蜥外泌肽-4(Exendin-4)是从珠毒蜥毒液中分离的39氨基酸残基蛋白 质，并且这种蛋白质与GLP-I共享52%同源性。毒蜥外泌肽-4是有效的GLP-I受体激动 齐U，其在注射入犬内时已显示刺激胰岛素释放和确保血糖水平降低。GLP-I (1-37)和毒蜥 外泌肽-4(1-39)组及其特定片段、类似物和衍生物(本文指定为GLP-I化合物)是有效 的促胰岛素试剂，并且它们在本发明的方法中都可应用。GLP-I (1-37)的促胰岛素片段是促胰岛素蛋白质，关于其完整序列可以在GLP-I (1-37)的序列中发现，并且其中至少一个 末端氨基酸已缺失。GLP-I (1-37)的促胰岛素片段的例子是其中GLP-I (1-37)的位置1_6 中的氨基酸残基已缺失的GLP-I (7-37)，和其中GLP-I (1-37)的位置1_6和37中的氨基 酸残基已缺失的GLP-I (7-36)。毒蜥外泌肽-4(1-39)的促胰岛素片段的例子是毒蜥外泌 肽-4(1-38)和毒蜥外泌肽-4(1-31)。化合物的促胰岛素性质可以通过本领域众所周知的 体内或体外测定进行测定。例如，化合物可以施用于动物并且随着时间过去监控胰岛素浓 度。GLP-I (1-37)和毒蜥外泌肽-4(1-39)的促胰岛素类似物指其中一个或多个氨基酸残 基已由其他氨基酸残基交换，和/或一个或多个氨基酸残基已从其缺失，和/或一个或多个 氨基酸残基已从其加入的各自分子，前提是所述类似物是促胰岛素的或是促胰岛素化合物 的前体药物。GLP-I (1-37)的促胰岛素类似物的例子是例如，其中位置8中的丙氨酸已由 甲硫氨酸替代并且位置1至6中的氨基酸残基已缺失的Met8-GLP-I (7_37)，和其中位置34 中的缬氨酸已由精氨酸替代并且位置1至6中的氨基酸残基已缺失的Arg34-GLP-I (7-37)。 毒蜥外泌肽_4 (1-39)的促胰岛素类似物的例子是Ser2Asp3-毒蜥外泌肽_4 (1-39)，其中位 置2和3中的氨基酸残基已分别由丝氨酸和天冬氨酸替代(这个具体类似物在本领域中也 称为毒蜥外泌肽-3)。GLP-I (1-37)、毒蜥外泌肽-4(1-39)及其类似物的促胰岛素衍生物 是本领域技术人员视为这些蛋白质的衍生物的那些，即具有亲本蛋白质分子中不存在的至 少一个取代基，前提是所述衍生物是促胰岛素的或是促胰岛素化合物的前体药物。取代基 的例子是酰胺、碳水化合物、烷基和亲脂取代基。GLP-I (1-37)、毒蜥外泌肽-4 (1-39)及其 类似物的促胰岛素衍生物的例子是GLP-I (7-36)-酰胺、Arg34，Lys26(NE-(y -Glu(Να-十六 烷酰)))-GLP-I (7-37)和 Tyr31-毒蜥外泌肽 _4 (1_31)-酰胺。GLP-I (1-37)、毒蜥外泌 肽-4(1-39)、其促胰岛素片段、其促胰岛素类似物及其促胰岛素衍生物的进一步例子在WO 98/08871、WO 99/43706、US 5424286和WO 00/09666中描述，所述专利文件全部包含入本 文作为参考。将获益于本发明的方法的另一种蛋白质是GLP-2。GLP-2和GLP-2化合物也可以通过本发明提供的方法进行修饰。在本背景中，GLP-2化合物与GLP-2受体结合，优选具有 低于1 μ Μ、例如低于IOOnM的亲和常数(Kd)或效力(EC5tl)。术语“GLP-2化合物”意指人 GLP-2，其中一个或多个氨基酸残基已缺失和/或由另一个氨基酸残基替代，天然或非天然 的，和/或包括另外氨基酸残基的人GLP-2，和/或其中至少一个有机取代基与一个或多个 氨基酸残基结合的人GLP-2。具体地，考虑那些蛋白质，其氨基酸序列在33个连续氨基酸的 任何序列处显示超过60%的人GLP-2氨基酸序列。同样，考虑那些蛋白质，当最高达4个 氨基酸从氨基酸序列中缺失时，其氨基酸序列在37个连续氨基酸的任何序列处显示超过 60%的人GLP-2氨基酸序列。同样，考虑那些蛋白质，当最高达2个氨基酸加入其氨基酸序 列中时，其氨基酸序列在31个连续氨基酸的任何序列处显示超过60%的GLP-2氨基酸序 列。术语“GLP化合物”还包括可以从一个个体到另一个存在且发生的天然等位基因变异。 同样，糖基化或其他翻译后修饰的程度和定位可以依赖于选择的宿主细胞和宿主细胞环境 的性质而改变。可以根据本发明使用的候选GLP-2化合物包括WO 96/32414、W097/39031、WO 98/03547,WO 96/29342,WO 97/31943,WO 98/08872 中描述的 GLP-2 化合物，所述专利文件
全部引入本文作为参考。
具体地，下述GLP-2化合物可在本发明的方法中应用。A2G-GLP-2(l-33) ；K30R-GLP-2(1-33) ；S5K-GLP-2(1-33) ；S7K-GLP-2(1-33)； D8K-GLP-2 (1-33) ；E9K-GLP-2 (1-33) ；M10K-GLP-2 (1-33) ；Nl1K-GLP-2 (1-33)； T12K-GLP-2(1-33) ； I13K-GLP-2 (1-33) ；L14K-GLP-2 (1_33) ；D15K-GLP-2(1-33)； N16K-GLP-2(1-33) ；L17K-GLP-2(1-33) ；A18K-GLP-2(1-33) ；D21K-GLP-2(1_33)； N24K-GLP-2(l-33) ；Q28K-GLP-2(1-33) ；S5K/K30R-GLP-2(1-33) ；s7K/K30R_GLP_2(1-33)； D8K/K30R-GLP-2(1-33) ；E9K/K30R-GLP-2(1-33) ；M10K/K30R-GLP-2(1-33) ；NllK/ K30R-GLP-2(1-33) ；T12K/K30R-GLP-2(1-33) ； 113K/K30R-GLP-2(1-33) ；L14K/ K30R-GLP-2(1-33) ；D15K/K30R-GLP-2(1-33) ；N16K/K30R-GLP-2(1-33) ；L17K/ K30R-GLP-2(1-33) ；A18K/K30R-GLP-2(1-33) ；D21K/K30R-GLP-2(1-33) ；N24K/ K30R-GLP-2(1-33) ；Q28K/K30R-GLP-2 (1-33) ；K30R/D33K-GLP-2(1-33) ；D3E/ K30R/D33E-GLP-2 (1-33) ；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/S7K/K30R/ D33E-GLP-2(l-33) ；D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)； D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/ T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/113K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/L14K/ K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/N16K/K30R/ D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/L 1 7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33) ；D3E/A18K/K30R/ D33E-GLP-2 (1-33) ；D3E/D21K/K30R/D3 3E-GLP-2(1-33) ；D3E/N24K/K30R/ D33E-GLP-2(1-33)；和 D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)。具有与GLP-2蛋白质附着的仅一个亲脂取代基的GLP-2衍生物也可本发明的方法中应用，例如其中亲脂取代基包括4-40个碳原子、例如8-25个碳原子、例如12-20个碳原 子的GLP-2衍生物。下述列表包含可在本发明的方法中具体应用的GLP-2衍生物S5K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；S7K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；D8K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；E9K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；MlOK (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；Nl IK (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；Τ12Κ(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；Ι13Κ(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；L14K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；D15K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；N16K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(3_(辛酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；L17K(3_(壬酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；L17K (3-(癸酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(3-(i^一烷酰氨基)丙酰基)-GLP_2 (1-33)；L17K (3-(十二烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；
L17K (3-(十三烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(3_(十四烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；
L17K (3-(十五烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十七烷酰氨基)丙酰基)_GLP_2 (1-33)；L17K (3-(十八烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十九烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (3- ( 二十烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (辛酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (壬酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (癸酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ ( i^一烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十二烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十三烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K((S)-4_ 羧基 _4-(十四烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十五烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十六烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；1^171(((5)-4-羧基-4-(十七烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；1^171(((5)-4-羧基-4-(十八烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；1^171(((5)-4-羧基-4-(十九烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；1^171(((5)-4-羧基-4-(二十烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(4_(辛酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(4-(壬酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(4_(癸酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(4-(i^一烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(4_(十二烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(4_(十三烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K(4_(十四烷酰氨基)丁酰基)-GLP_2 (1-33)；
L17K (4-(十五烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十六烷酰氨基)丁酰基)_GLP_2 (1-33)；L17K (4-(十七烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十八烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十九烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；L17K (4- ( 二十烷酰氨基)丁酰基)-GLP-2 (1-33)；A18K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；D21K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；N24K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；Q28K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)-GLP-2 (1-33)；S5K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；
S7K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；D8K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；E9K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；MlOK (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；Nl IK (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；T12K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；I13K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L14K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；D15K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；
N16K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(辛酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(壬酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(癸酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3- ( ^^一烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十二烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十三烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K(3_(十四烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1_33)；L17K (3-(十五烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；
L17K (3-(十七烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十八烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3-(十九烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (3- ( 二十烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (辛酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (壬酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (癸酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ ( i^一烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十二烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十三烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十五烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十六烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十七烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十八烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ (十九烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K ((S) -4-羧基 _4_ ( 二十烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(辛酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(壬酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(癸酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；
L17K (4- ( i^一烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十二烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十三烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K(4_(十四烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十五烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十六烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十七烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十八烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K (4-(十九烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；L17K(4-( 二十烷酰氨基)丁酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)； A18K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；D21K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(l_33)；N24K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2 (1-33)；Q28K(3_(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R-GLP-2(l_33)；D3E/S5K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/S7K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/D8K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/E9K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/M10K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/N1IK (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；
D3E/T12K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/I13K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L14K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/D15K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/N16K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3-(辛酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3-(壬酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3-(癸酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3- ( ^^一烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3_ (十二烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；
D3E/L17K (3_ (十三烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K(3-(十四烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(l-33)；D3E/L17K (3_ (十五烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3-(十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3_ (十七烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3_ (十八烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3_ (十九烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (3_ ( 二十烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (辛酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；
D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (壬酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；
D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (癸酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ ( i^一烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (十二烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (十三烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十四烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (十五烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (十六烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (十七烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (十八烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ (十九烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；
D3E/L17K ((S) _4_ 羧基 _4_ ( 二十烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4-(辛酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4-(壬酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4-(癸酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4- ( ^^一烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4_ (十二烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4_ (十三烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K(4-(十四烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(l-33)；D3E/L17K (4_ (十五烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4_ (十六烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；
D3E/L17K (4_ (十七烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4_ (十八烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4_ (十九烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/L17K (4_ ( 二十烷酰氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/A18K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/D21K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；D3E/N24K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)；和D3E/Q28K (3_ (十六烷酰氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2 (1-33)。将获益于本发明的方法的另一种蛋白质是因子VII。可在本发明的方法中应用的 因子VII化合物包含野生型因子VII (即，具有在美国专利号4，784，950中公开的氨基酸序 列的多肽)，以及相对于野生型因子VII显示基本上相同或改善的生物活性的因子VII变 体、因子VII相关多肽以及因子VII衍生物和因子VII缀合物。术语“因子VII化合物”意 欲包含其未切割(酶原)形式的因子VII多肽、以及已蛋白酶解加工以产生其各自生物活 性形式的那些，其可以指定为因子Vila。一般地，因子VII在残基152和153之间切割以产 生因子Vila。因子VII的此种变体可以显示相对于人因子VII的不同性质，包括稳定性、磷 脂结合、改变的比活性等。如本文所使用的，“因子VII相关多肽”包含多肽，包括变体，其中相对于野生型因 子VIIa的活性，因子VIIa生物活性已相当大地修饰或减少。这些多肽包括但不限于修饰或破坏多肽生物活性的特定氨基酸序列改变已引入其内的因子VII或因子Vila。如本文所使用的，术语“因子VII衍生物”意指野生型因子VII、相对于野生型因子 VII显示基本上相同或改善的生物活性的因子VII变体和因子VII相关多肽，其中亲本蛋白 质的一个或多个氨基酸已例如通过烷基化、聚乙二醇化、酰化、酯形成或酰胺形成等进行化 学修饰。这包括但不限于聚乙二醇化的人因子Vila、半胱氨酸-聚乙二醇化的人因子VIIa 及其变体。
术语“聚乙二醇化的人因子Vila”意指具有修饰到人因子VIIa多肽的PEG分子的 人因子Vila。应当理解，PEG分子可以与因子VIIa多肽的任何部分附着，包括因子VIIa多 肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。术语“半胱氨酸-聚乙二醇化的人因子Vila”意 指具有与人因子VIIa中引入的半胱氨酸巯基缀合的PEG分子的因子Vila。因子Vila在血液凝固中的生物活性衍生自其(i)与组织因子(TF)结合和(ii) 催化因子IX或因子X的蛋白酶剪切，以产生活化的因子IX或X(分别为因子IXa或Xa)的 能力。为了本发明的目的，因子VIIa生物活性可以通过测量制剂促进血液凝固的能力进行 定量，其中使用因子VII缺陷血浆和促凝血酶原激酶，如例如美国专利号5，997，864中描述 的。在这个测定中，生物活性表示为相对于对照样品凝固时间中的减少，并且通过与包含 1单位/ml因子VII活性的合并人血清标准相比较转化成“因子VII单位”。可替代地，因 子VIIa生物活性可以通过下述进行定量(i)测量因子Vila在包括包埋在脂质膜中的TF 和因子X的系统中产生因子Xa的能力。(Persson等人，J. Biol. Chem. 272 19919-19924， 1997) ； (ii)测量在水系统中的因子X水解；(iii)使用基于表面等离振子共振的仪器测量 其与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts. 413 =359-363,1997)和(iv)测量合成底物的水 解。相对于野生型因子Vila，具有基本上相同或改善的生物活性的因子VII变体包 含下述那些，当在如上所述的一种或多种凝固测定、蛋白酶解测定或TF结合测定中测试 时，其显示已在相同细胞类型中产生的因子VIIa的特异性活性的至少约25%、优选至少约 50%、更优选至少约75%且最优选至少约90%。相对于野生型因子Vila，具有基本上减少 的生物活性的因子VII变体是下述那些，当在如上所述的一种或多种凝固测定、蛋白酶解 测定或TF结合测定中测试时，其显示已在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa的特异 性活性的小于约25%、优选小于约10%、更优选小于约5%和最优选小于约1%。相对于野 生型因子VII，具有相当大的修饰的生物活性的因子VII变体包括但不限于，显示TF不依赖 性因子X蛋白酶解活性的因子VII变体和结合TF但不切割因子X的那些。相对于野生型因子VII，显示与野生型因子VII基本上相同或更佳生物活性或可 替代地显示相当大的修饰或减少的生物活性的因子VII变体包括但不限于，具有通过一个 或多个氨基酸的插入、缺失或置换与野生型因子VII的序列不同的氨基酸序列的多肽。如本文所使用的，术语“变体”意指具有野生型因子VII的序列的因子VII，其中亲 本蛋白质的一个或多个氨基酸已由另一个氨基酸置换，和/或其中亲本蛋白质的一个或多 个氨基酸已缺失，和/或其中一个或多个氨基酸已插入蛋白质中，和/或其中一个或多个氨 基酸已加入亲本蛋白质中。此种添加可以在亲本蛋白质的N末端或C末端或两者处发生。 在这个定义内的“变体”仍具有其活化形式的FVII活性。在一个实施方案中，变体与野生型 因子VII的序列70%等同。在一个实施方案中，变体与野生型因子VII的序列80%等同。在另一个实施方案中，变体与野生型因子VII的序列90%等同。在进一步的实施方案中，变 体与野生型因子VII的序列95%等同。
具有与野生型因子VII基本上相同生物活性的因子VII变体的非限制性例子 包括 S52A-FVIIa，S60A_FVIIa(Lino 等人，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998)； 如美国专利号5，580，560中公开的显示增加的蛋白酶解稳定性的FVIIa变体；已在残 基290和291之间或在残基315和316之间蛋白酶解切割的因子Vila(Mollerup等人， Biotechnol. Bioeng. 48 :501_505，1995)；氧化形式的因子 Vila(Kornfelt 等人，Arch. Biochem. Biophys. 363 :43_54，1999)；如 PCT/DK02/00189 中公开的 FVII 变体；和如 WO 02/38162 (Scripps Research Institute)中公开的显示增加的蛋白酶解稳定性的FVII变 体；如WO 99/20767 (University ofMinnesota)中公开的具有修饰的Gla-结构域且显示增 强的膜结合的FVII变体；和如WO 01/58935 (Maxygen ApS)中公开的FVII变体，所有所述 专利文件引入本文作为参考。特别提及与野生型FVIIa相比较具有增加的生物活性的FVII变体，包括如WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218，PCT/DK02/00635，丹麦专利申请 PA 2002 01423，丹 麦专利申请PA 2001 01627 ；W002/38162 (Scripps Research Institute)中公开的FVII 变 体；和如JP2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中公开的具有增强的活性的 FVIIa变体，所有所述专利文件引入本文作为参考，所有所述专利文件引入本文作为参考。相对于野生型因子VII，具有相当大地减少或修饰的生物活性的因子VII 变体的例子包括 R152E-FVIIa(Wildgoose 等人，Biochem 29 :3413_3420，1990)、 S344A-FVIIa (Kazama 等人，J. Biol. Chem. 270 :66_72，1995)、FFR-FVIIa (Hoist 等人，Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15 :515_520，1998)和缺乏 Gla 结构域的因子 Vila(Nicolaisen 等 人，FEBS Letts. 317 =245-249,1993)，所有所述专利文件引入本文作为参考。因子VII变体、因子VII或因子VII相关多肽的例子包括野生型因子VII， L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/ M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII， V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII,禾口 S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/ V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/ K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVH, L305V/K337A/ V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/ M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/ E296V/M298Q-FVII， L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII， L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII， L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/ E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/ M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/ K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/ V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/ E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, Κ316Q/E296V-FVII, Κ316Q/M298Q-FVII, K316Q/ V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/ E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/ V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/ L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/ E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/ L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/ E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/ M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, Κ316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/ E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/ V158T-FVII, Κ316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, Κ316H/L305V/K337A/E296V-FVII, Κ316Η/ L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/ E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, Κ316Η/ L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/ E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/ M298Q/K337A-FVII, Κ316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/ E296V-FVII, Κ316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/ V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/ L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/ E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, Κ316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/ L305V/E296V/M298Q-FVII， K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII， K316Q/L305V/V158T/ E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII, Κ316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, Κ316Q/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/ E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII， F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII， F374Y/L305V-FVII, F374Y/ L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/ M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/ S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/ E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/ M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/ M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/ M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/ K337A/E296V-FVII， F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII， F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII， F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D /M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/ L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/ V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/ K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/ E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/ K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/ V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/ V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/ E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/ E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/ K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/ S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/ K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/ S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/ M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/ M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/ L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/ K337A/S314E-FVII，S52A-因子 VII、S60A-因于 VII ；R152E-因子 VII、S344A_ 因子 VII、缺乏 Gla 结构域的因子 VIIa ；^P Pl 1Q/K33E-FVII,T106N-FVII,K143N/N145T-FVII,V253N-FVII, R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ； 和在从233Thr到240Asn的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII，在从304Arg到 329Cys的氨基酸序列中具有置换、添加或缺失的FVII。将获益于本发明的方法的另一种蛋白质是IL-19。可在本发明的方法中应用的 IL-19的具体例子包括WO 98/08870 (Human Genome Science)中公开的那些，所述专利文件 引入本文作为参考。特别提及在W098/08870中作为SEQ ID NO :2公开的蛋白质。将获益于本发明的方法的另一种蛋白质是IL-20。可应用的IL-20的具体例子包 括TO 99/27103 (ZymoGenetics)中公开的那些，所述专利文件引入本文作为参考。在本背 景中，IL-20意指IL-20自身及其片段以及与IL-20或其片段至少90%等同的多肽。可在本发明的方法中特别应用的蛋白质包括在WO 99/27103中作为下述公开的那些SEQ ID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO : 19、SEQ ID NO 20,SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ IDNO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 26,SEQ IDNO 27,SEQ ID NO 28,SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30,SEQ IDN0:31、SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :34 禾口 SEQ IDNO :35。将获益于本发明的方法的另外一种蛋白质是IL-21。在本发明的方法中可应用的 IL-21的例子包括WO 00/53761 (ZymoGenetics)中公开的那些，所述专利文件引入本文作 为参考。特别提及在WO 00/53761中作为SEQ ID NO 2公开的蛋白质。将获益于本发明的方法的另外一种蛋白质是TTF。TTF蛋白质是主要与胃肠道 相关发现的蛋白质家族。特别提及已知来自人、小鼠和大鼠的乳腺癌相关PS2蛋白质 (TFF-I)，已知来自人、猪、大鼠和小鼠的解痉多肽(TFF-2)，以及已知来自人、大鼠和小鼠的 肠三叶因子(TFF-3)。来自可在本发明的方法中应用的TFF家族的其他蛋白质包括W002/46226 (Novo Nordisk)中公开的那些，所述专利文件包括在本文中作为参考。特别提及TFF-2蛋白质，其 中具有在WO 02/46226的SEQ IDNO :1中公开的氨基酸的TFF2蛋白质包括在Cys6_Cysl04、 Cys8_Cys35、Cysl9_Cys34、Cys29_Cys46、Cys58_Cys84、Cys68_Cys83 和 Cys78_Cys95 之间 的双硫键，并且其中独立地选自糖残基和寡糖的部分X与Asnl5共价附着。TFF家族的其他蛋白质包括TFF-I和TFF-3 二聚物，如引入本文作为参考的WO 96/06861 (Novo Nordisk)中公开的那些。几种黑皮质素(melanorcortin)受体是已知的，并且可在本发明的方法中应 用的蛋白质特别提及肽黑皮质素-4受体激动剂，其已知具有食欲抑制作用。特别提及 在下述专利文件中公开的一种或多种蛋白质，所述专利文件全部引入本文作为参考US 6，054，556 (Hruby)、W000/05263 (William Harvey Research)、WO 00/35952 (Melacure)、 WO 00/35952 (Melacure), WO 00/58361 (Procter & Gamble)、W001/52880 (Merck)、WO 02/26774(Procter & Gamble)、W003/06620(Palatin)、WO 98/27113(Rudolf Magnus Institute)和 W099/21571(Trega)。可在本发明的方法中应用的其他一种或多种蛋白质包括ACTH、促肾上腺皮质素释 放因子、血管紧张素、降钙素、胰岛素及其片段和类似物、胰高血糖素、IGF-U IGF-2、肠胃泌 素、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿胃泌素(urogastrin)、表皮生长因子、促胰液素、神 经生长因子、促甲状腺素释放激素、生长抑素、生长激素释放激素、生长调节素、甲状旁腺激 素、血小板生成素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促甲状腺激素、内啡肽、脑啡 肽、加压素、催产素、阿片样物质(opiods)及其类似物、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨 酶、腺苷脱氨酶和核糖核酸酶。根据本发明的方法待修饰的蛋白质可以从天然来源(例如，植物、动物或微生物，例如酵母、细菌、真菌或病毒)中分离，或它们可以是合成的。来自天然来源的蛋白质也包 括来自转基因来源的蛋白质，例如已进行基因修饰以表达或增加蛋白质表达的来源，其中 所述蛋白质可以是在自然界中存在的意义上“天然的”或在仅由于人为干预存在的意义上“非天然的”。从天然来源中分离的蛋白质也可以在本发明的缀合前实施合成修饰。药物组合物
本发明还涉及包括通过本文公开的任何方法修饰的蛋白质的药物组合物。在一个 方面，此种药物组合物包括修饰的蛋白质例如生长激素(GH)，其以10_15mg/ml至200mg/ml、 例如10_1(lmg/ml至5mg/ml的浓度存在，并且其中所述组合物具有2. 0至10. 0的pH。组合 物可以进一步包括缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种强壮剂、一种或多种螯合剂、 稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物是水组合物，即包含水的组 合物。此种组合物一般是溶液或悬浮液。在本发明的进一步的实施方案中，药物组合物是 水溶液。术语“水组合物”定义为包括至少50% w/w水的组合物。同样地，术语“水溶液” 定义为包括至少50% w/w水的溶液，并且术语“水悬浮液”定义为包括至少50% w/w水的 悬浮液。在另一个实施方案中，药物组合物是冷冻干燥组合物，在使用前医生或患者向其 中加入溶剂和/或稀释剂。在另一个实施方案中，药物组合物是无需任何先前溶解即可使用的干燥组合物 (例如，冷冻干燥或喷雾干燥)。在进一步的方面，本发明涉及包括修饰的蛋白质例如修饰的GH蛋白质和缓冲剂 的水溶液的药物组合物，其中所述修饰的蛋白质例如修饰的GH蛋白质以0. l-100mg/ml或 更高的浓度存在，并且其中所述组合物具有约2. 0至约10. 0的pH。在本发明的另一个实施方案中，组合物的pH选自2.0,2. 1、2· 2、2· 3、2· 4、2· 5、 2. 6、2· 7、2· 8、2· 9、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 6、3· 7、3· 8、3· 9、4· 0、4· 1、4· 2、4· 3、4· 4、 4. 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9、5· 0、5· 1、5· 2、5· 3、5· 4、5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、 6. 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9、7· 0、7· 1、7· 2、7· 3、7· 4、7· 5、7· 6、7· 7、7· 8、7· 9、8· 0、8· 1、8· 2、 8. 3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 7、8· 8、8· 9、9· 0、9· 1、9· 2、9· 3、9· 4、9· 5、9· 6、9· 7、9· 8、9· 9 和 10. 0。在本发明的进一步的实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸、甘氨酰 甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲 基)_氨基甲烷、N-二 [羟乙基]甘氨酸(biCine)、N-[2-羟-1，1-二羟甲基乙基]甘氨酸 (tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、延胡素酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定 缓冲剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。在本发明的进一步的实施方案中，组合物进一步包括药学上可接受的防腐剂。在 本发明的进一步的实施方案中，防腐剂选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲 酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇 和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷基脲、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙 酯、氯化苄乙铵、氯苯甘油醚(3p-氯苯氧基丙-1，2-二醇)或其混合物。在本发明的进一 步的实施方案中，防腐剂以0. lmg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方 案中，防腐剂以0. lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中，防腐 剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方案中，防腐剂以10mg/ml 至20mg/ml的浓度存在。这些特定防腐剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。防腐 剂在药物组合物中的用途是本领域技术人员众所周知的。为了方便起见参考Remington TheScience and Practice of Pharmacy，第 20 片反，2000。
在本发明的进一步的实施方案中，组合物进一步包括等渗剂。在本发明的进一步 的实施方案中，等渗剂选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨 酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如甘油(丙三醇)、1， 2_丙二醇(丙二醇)、1，3_丙二醇、1，3_ 丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物。 可以使用任何糖例如单糖、二糖或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、 山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟 乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少 一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖 醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上文提及的糖或糖醇可以 个别或组合使用。关于使用的量无固定限制，只要糖或糖醇在液体制剂中是可溶的，并且不 会不利地影响使用本发明的方法获得的稳定作用。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度是约 lmg/ml至约150mg/ml。在本发明的进一步的实施方案中，等渗剂以lmg/ml至50mg/ml的浓 度存在。在本发明的进一步的实施方案中，等渗剂以lmg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本 发明的进一步的实施方案中，等渗剂以8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步 的实施方案中，等渗剂以25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些具体等渗剂中的每一种构 成本发明的替代实施方案。等渗剂在药物组合物中的用途是本领域技术人员众所周知的。 为了方便起见参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本背景中，术语“药学上可接受的盐”意指对患者无害的盐。此种盐包括药学上 可接受的酸加成盐、药学上可接受的金属盐、铵和烷基化铵盐。酸加成盐包括无机盐和有 机酸的盐。合适无机酸的代表性例子包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合适 有机酸的代表性例子包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、柠檬酸、 延胡素酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水杨酸、琥 珀酸、甲磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗坏血酸、扑酸、二亚甲基水杨酸、乙二磺酸、葡糖酸、柠康 酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、EDTA、乙醇酸、对氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸 等。药学上可接受的无机或有机酸加成盐的进一步例子包括引入本文作为参考的J. Pharm. Sci. 1977，66，2中列出的药学上可接受的盐。金属盐的例子包括锂、钠、钾、镁盐等。铵和烷 基化铵盐的例子包括铵、甲铵、二甲铵、三甲铵、乙铵、羟乙铵、二乙铵、丁铵、四甲铵等。在本发明的进一步的实施方案中，组合物进一步包括螯合剂。在本发明的进一步 的实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐及其混合物。在本 发明的进一步的实施方案中，螯合剂以0. lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一 步的实施方案中，螯合剂以0. lmg/ml至2mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步的实施方 案中，螯合剂以2mg/ml至5mg/ml的浓度存在。这些具体螯合剂中的每一种构成本发明的 替代实施方案。螯合剂在药物组合物中的用途是本领域技术人员众所周知的。为了方便起 见参考 Remington :TheScience and Practice of Pharmacy，第 20 片反，2000。在本发明的进一步的实施方案中，组合物进一步包括稳定剂。稳定剂在药物组合 物中的用途是本领域技术人员众所周知的。为了方便起见参考Remington=The Science and Practice of Pharmgicy，H 20 片反，2000。更具体而言，本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，其治疗活性组分包括在 液体药物组合物中的贮存过程中可能显示聚集物形成的蛋白质。“聚集物形成”意指蛋白质分子之间导致形成可以保持可溶的寡聚物或由溶液沉淀的大可见聚集物的物理相互作用。 “在贮存过程中”意指液体药物组合物或组合物制备后，不立即施用于受试者。相反，在制 备后，它包装用于贮存，以液体形式、冷冻状态或干燥形式，用于随后重构成液体形式或适 合于施用于受试者的其他形式。“干燥形式”意指液体药物组合物或组合物通过冷冻干燥 (即，冻干；参见例如 Williams 和 Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38 :48_59)、喷 Masters (1991) ^t Spray-Drying Handbook ψ ( H 5 IK ；LongmanScientific and Technical, Essez, U. K.),第 491-676 页；Broadhead 等人(1992)Drug Devel. Ind. Pharm. 18 1169-1206 ；禾Π Mumenthaler 等人(1994)Pharm. Res. 11 12-20)、或风 干(Carpenter 禾口 Crowe (1988)Cryobiology 25:459—470;禾口 Roser(1991)Biopharm. 4 47-53)进行干燥。在液体药物组合物的贮存过程中通过蛋白质的聚集物形成可以不利地影 响那种蛋白质的生物活性，从而导致药物组合物的治疗功效的丧失。此外，当含蛋白质的药 物组合物使用输注系统进行施用时，聚集物形成可能引起其他问题，例如管道系统、膜或泵 堵塞。 本发明的药物组合物可以进一步包括足以减少在组合物的贮存过程中通过蛋白 质的聚集物形成的氨基酸碱量。“氨基酸碱”意指氨基酸或氨基酸组合，其中任何给定氨基 酸以其游离碱形式或以其盐形式存在。当使用氨基酸组合时，所有氨基酸都可以以其游离 碱形式存在，所有都可以以其盐形式存在，或一些可以以其游离碱形式存在，而其他的以其 盐形式重组。在一个实施方案中，用于制备本发明的组合物的氨基酸是携带荷电侧链的那 些，例如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(甲硫氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨 酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即，L或D同分异 构体或其混合物)，或这些立体异构体的组合或甘氨酸或有机碱例如但不限于咪唑，可以在 本发明的药物组合物中存在，只要特定氨基酸或有机碱以其游离碱形式或其盐形式存在。 在一个实施方案中，使用氨基酸的L-立体异构体。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。 本发明的组合物也可以用这些氨基酸的类似物进行配制。“氨基酸类似物”意指天然存在的 氨基酸的衍生物，其达到在本发明的液体药物组合物的贮存过程中减少通过蛋白质的聚集 物形成的所需作用。合适的精氨酸类似物包括例如氨基胍、鸟氨酸和N- —乙基L-精氨酸， 合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，并且合适的半胱氨酸类似 物包括S-甲基-L半胱氨酸。与其他氨基酸一样，氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐形 式掺入组合物内。在本发明的进一步的实施方案中，氨基酸或氨基酸类似物以足以阻止或 延迟蛋白质聚集的浓度使用。 在本发明的进一步的实施方案中，当充当治疗剂的蛋白质是包括对氧化易感的至 少一个甲硫氨酸残基的蛋白质时，可以加入甲硫氨酸(或其他硫氨基酸或氨基酸类似物)， 以抑制甲硫氨酸残基至甲硫氨酸亚砜的氧化。“抑制”意指随着时间过去甲硫氨酸氧化种 类的最小积累。抑制甲硫氨酸氧化导致蛋白质以其正确分子形式的更大保留。可以使用甲 硫氨酸(L或D同分异构体)的任何立体异构体或其任何组合。待加入的量应是足以抑制 甲硫氨酸残基氧化的量，从而使得甲硫氨酸亚砜的量对调节作用是可接受的。一般地，这意 味着组合物包含不超过约10%至约30%的甲硫氨酸亚砜。一般地，这可以通过加入甲硫氨 酸来获得，从而使得加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的比是约1 1至约1000 1，例如 10 1 至约 100 1。
在本发明的进一步的实施方案中，组合物进一步包括选自高分子量聚合物或低 分子量化合物的稳定剂。在本发明的进一步的实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(例如 PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羟基纤维素或其衍生物(例如，HPC、 HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质例如一硫代甘油、巯基乙酸和2-甲硫基乙醇和不 同盐(例如氯化钠)。这些具体稳定剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。药物组合物还可以包括另外的稳定剂，其进一步增强其中的治疗活性蛋白质的稳 定性。对本发明特别重要的稳定剂包括但不限于，保护蛋白质不受甲硫氨酸氧化的甲硫氨 酸和EDTA，以及保护蛋白质不受与冻融或机械剪切相关的聚集的非离子型表面活性剂。在本发明的进一步的实施方案中，组合物进一步包括表面活性剂。在本发明的进一步的实施方案中，表面活性剂选自去污剂，乙氧基化蓖麻油，聚乙二醇化的甘油酯，乙 酰化单酸甘油酯，失水山梨糖醇脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙 姆，例如Pluronie F68、泊洛沙姆188和407、Triton X_100)，聚氧乙烯失水山梨糖醇脂 肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化和烷氧基化衍生物(tweens，例如Tween-20、 Tween-40, Tween-80和Bri j_35)，单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物，甘油二酯或其聚氧乙 烯衍生物，醇，甘油，凝集素和磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂 酰肌醇、双磷脂酰甘油和鞘磷脂)，磷脂衍生物(例如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂(例如 棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷 酸酯)以及溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)_衍 生物，例如溶血磷脂胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物，二棕榈酰磷脂酰胆碱，和极性首基 的修饰，所述首基是胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇和带正电的D0DAC、 DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸，和甘油磷酸酯(例如脑磷 脂)，甘油糖脂(例如吡喃半乳糖苷(galactopyransoide))，鞘糖脂(例如神经酰胺，神 经节苷脂)，十二烷基磷酸胆碱，鸡蛋溶血卵磷脂，梭链孢酸衍生物_ (例如牛磺二氢梭链 孢酸钠等)，长链脂肪酸及其C6-C12盐(例如油酸和辛酸)，酰基肉碱和衍生物，赖氨酸、精 氨酸或组氨酸的Na -酰化衍生物，或赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物，包括赖氨酸、精 氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任何组合的二蛋白质(diprotein)的Na-酰化衍生 物，包括中性氨基酸和2个荷电氨基酸的任何组合的三蛋白质的Na-酰化衍生物，DSS(多 库酯钠，CAS登记号[577-11-7])，多库酯钙，CAS登记号[128-49-4])，多库酯钾，CAS登 记号[7491-09-0])，SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)，辛酸钠，胆酸或其衍生物，胆 汁酸及其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物，熊去氧胆酸，胆酸钠，去氧胆酸钠，牛磺胆酸钠，甘胆 酸钠，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐，阴离子(烷基_芳基-磺酸盐) 单价表面活性剂，两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N，N-二甲基铵基-1-丙磺酸盐、 3_胆酰胺(Cholamido)-I-丙基二甲基铵基-1-丙磺酸盐，阳离子表面活性剂(季铵碱) (例如十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基氯化吡啶鐺)，非离子表面活性剂(例如十二烷基 β -D-吡喃葡糖苷)，衍生自环氧丙烷和环氧乙烷至乙二胺的顺次加成的四功能嵌段共聚 物的poloxamines (例如Tetronic’ s)，或表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物，或其混合物。 这些具体表面活性剂中的每一种构成本发明的替代实施方案。表面活性剂在药物组合物中的用途是本领域技术人员已知的。为了方便起见参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy，第 20 片反，2000。
其他成分可以存在于本发明的药物组合物中是可能的。此种另外成分可以包括润 湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力改性剂、螯合剂、金属离子、含油载体、蛋白质(例如 人血清清蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨 酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，此种另外成分不应不利地影响本发明的药物组合物的总稳定 性。根据本发明的包含修饰的蛋白质例如修饰的GH蛋白质的药物组合物可以在几个部位处施用于有此治疗需要的患者，例如在局部部位处，例如皮肤和粘膜部位，在绕过吸收 的部位处，例如在动脉、静脉、心脏中的施用，和在涉及吸收的部位处，例如在皮肤中、在皮 肤下、在肌肉中或在腹部中的施用。根据本发明的药物组合物的施用可以通过几种施用途径至需要此种治疗的患者， 所述施用途径例如舌、舌下、口腔、在口中、口部、在胃和肠中、鼻、肺，例如通过细支气管和 肺泡或其组合、表皮、皮的、经皮、阴道、直肠、眼例如通过结膜、输尿管和肠胃外。本发明的组合物可以以几种剂型施用，例如，作为溶液、悬浮液、乳剂、微乳剂、多 层乳齐 、泡沫、油膏齐 、糊齐 、药膏、软膏、片齐 、包衣片、冲洗齐 、胶囊如硬明胶胶囊和软明胶 胶囊、栓剂、直肠用胶囊、滴剂、凝胶、喷雾剂、粉末、气溶胶、吸入剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用 冲洗剂、阴道栓、阴道环、阴道软膏、注射溶液、原位转化溶液例如原位胶凝作用、原位设置、 原位沉淀、原位结晶、输注溶液和移植片。本发明的组合物可以进一步在药物载体、药物递送系统和先进的药物递送系统 中配制，或例如通过共价、疏水和静电相互作用与药物载体、药物递送系统和先进的药物 递送系统附着，以进一步增强修饰的GH蛋白质的稳定性、增加生物利用率、增加可溶性、 减少不利反应、达到本领域技术人员众所周知的时间治疗、且增加患者顺应性或其任何组 合。载体、药物递送系统和先进的药物递送系统的例子包括但不限于，聚合物例如纤维素 和衍生物、多糖例如葡聚糖和衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸和甲基丙烯酸聚 合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白质例如清蛋白、凝胶例如热 胶凝系统例如本领域技术人员众所周知的嵌段共聚系统、胶束、脂质体、微球体、纳米微粒 (nanoparticulate)、液晶及其分散体、在脂质-水系统中的相行为领域中技术人员众所周 知的L2相及其分散体、聚合胶束、多层乳剂、自乳化、自微乳化、环糊精及其衍生物、和树状 聚体。本发明的组合物在固体、半固体、粉末和溶液的组合物中有用，用于修饰的蛋白质 例如修饰的GH蛋白质的肺施用，其中使用例如计量剂量吸入器、干粉吸入器和喷洒器，全 都是本领域技术人员众所周知的设备。本发明的组合物在控释、持续释放、延长释放、延迟释放和缓慢释放药物递送系统 的组合物中特别有用。更具体而言但不限于，组合物在肠胃外控释和持续释放系统的组合 物中有用(2种系统都导致在施用次数中的多倍减少)，本领域技术人员众所周知的。更加 优选地是皮下施用的控释和持续释放系统。不限制本发明的范围，有用的控释系统和组合 物的例子是水凝胶、含油凝胶、液晶、聚合胶束、微球体、纳米颗粒。产生用于本发明的组合物的控释系统的方法包括但不限于结晶、缩合、共结 晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压勻浆、胶囊化、喷雾干燥、微囊化、凝聚、相分离、溶剂 蒸发以产生微球体、挤出和超临界流体过程。一般参考Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise, D. L.,编辑 Marcel Dekker, New York,2000)禾口 Drug and thePharmaceutical Sciences 99 ^ :Protein Composition and Delivery(MacNally, E. J.，编辑 Marcel Dekker, New York, 2000)。
肠胃外施用可以借助于注射器任选笔样注射器通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内 注射来执行。可替代地，肠胃外施用可以借助于输注泵来执行。进一步的选择是组合物，其 可以是以鼻或肺喷雾剂形式的溶液或悬浮液，用于施用修饰的蛋白质例如修饰的GH蛋白 质。作为再进一步的选择，包含本发明的修饰的蛋白质例如修饰的GH蛋白质的药物组合物 也可以适合于经皮施用，例如通过无针注射或来自片(patch)，任选离子电渗疗法片或跨粘 膜例如口腔施用。术语“稳定化的组合物”指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物 理和化学稳定性的组合物。如本文所使用的，术语蛋白质组合物的“物理稳定性”指由于蛋 白质暴露于热机械应力和/或与失稳界面和表面例如疏水表面和界面的相互作用，蛋白质 形成生物学上无活性和/或不可溶的蛋白质聚集物的趋势。在使合适容器(例如药液筒或 小瓶)中填充的组合物在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅拌)各个时间段后， 水蛋白质组合物的物理稳定性借助于目测检查和/或浊度测量进行评估。组合物的目测检 查在具有暗背景的锐聚焦光下执行。组合物浊度的特征在于例如在0至3的量表上排列浊 度程度的目测得分(显示无浊度的组合物与目测得分0对应，并且在日光下显示可见浊度 的组合物与目测得分3对应)。当它显示在日光中的可见浊度时，组合物就蛋白质聚集而 言分类为物理不稳定的。可替代地，组合物浊度可以通过本领域技术人员众所周知的简单 浊度测量进行评估。水蛋白质组合物的物理稳定性还可以通过使用蛋白质构象状态的光谱 试剂或探针进行评估。探针优选是与蛋白质的非天然构象异构体优先结合的小分子。蛋白 质结构的小分子光谱探针的一个例子是硫代黄素T。硫代黄素T是已广泛用于淀粉状蛋白 原纤维检测的荧光染料。在原纤维以及可能的其他蛋白质构型的存在下，当与原纤维蛋白 质形式结合时，硫代黄素T产生在约450nm处的新激发最大值和在约482nm处的增强发射。 未结合的硫代黄素T在波长处基本上是无荧光的。其他小分子可以用作蛋白质结构从天然到非天然状态中的改变的探针。例如，“疏 水片”探针优先与蛋白质的暴露疏水片结合。疏水片一般以其天然状态包埋在蛋白质的三 级结构内，但随着蛋白质开始解折叠或变性而变得暴露。这些小分子、光谱探针的例子是芳 族的、疏水性染料，例如蒽(antrhacene)、吖啶、菲咯啉等。其他光谱探针是金属-氨基酸络 合物，例如疏水氨基酸的钴金属络合物，所述疏水氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸和缬氨酸等。如本文所使用的，术语蛋白质组合物的“化学稳定性”指蛋白质结构中的化学共价 改变，其导致与天然蛋白质结构相比较，具有潜在更少生物效力和/或潜在增加的免疫原 性性质的化学降解产物的形成。依赖于天然蛋白质和蛋白质暴露于其的环境的类型和性 质，可以形成各种化学降解产物。化学降解的消除最可能不可完全避免，并且渐增量的化学 降解产物经常在蛋白质组合物的贮存和使用过程中可见，如本领域技术人员众所周知的。 大多数蛋白质易于脱酰胺，其中谷氨酰胺酰基或天冬酰胺酰基残基中的侧链酰胺基团水解 以形成游离羧酸的过程。其他降解途径涉及高分子量转化产物的形成，其中2种或更多种 蛋白质分子通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用彼此共价结合，从而导致共价结合的二聚体、寡聚体和多聚体降解产物的形成(Stability of ProteinPharmaceuticals, Ahern. Τ. J. & Manning Μ. C.，Plenum Press, New Yorkl992)。可以提及氧化(例如甲硫氨 酸残基的)作为化学降解的另一种变化。通过在暴露于不同环境条件后(降解产物的形成 经常可以通过例如增加温度得到加速)在各个时间点时测量化学降解产物的量，可以评估 蛋白质组合物的化学稳定性。经常使用各种层析技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)，通 过依赖于分子大小和/或电荷分离降解产物来测定每种个别降解产物的量。因此，如上文概述的，“稳定化的组合物”指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物理和化学稳定性的组合物。一般而言，组合物在使用和贮存过程中必须是 稳定的(顺应推荐的使用和贮存条件)直至达到到期日。在本发明的一个实施方案中，包括修饰的GH蛋白质的药物组合物对于超过6周的 使用和超过3年的贮存是稳定的。在本发明的另一个实施方案中，包括修饰的GH蛋白质的药物组合物对于超过4周 的使用和超过3年的贮存是稳定的。在本发明的进一步的实施方案中，包括修饰的GH蛋白质的药物组合物对于超过4 周的使用和超过2年的贮存是稳定的。在本发明的更进一步的实施方案中，包括修饰的GH蛋白质的药物组合物对于超 过2周的使用和超过2年的贮存是稳定的。本发明修饰的蛋白质的治疗用涂在修饰的蛋白质是治疗蛋白质的程度上，本发明还涉及本发明修饰的蛋白质在治 疗中的用途，并且特别涉及包括所述修饰的蛋白质的药物组合物。因此，如本文所使用的，术语“治疗”意指患者的处理和护理，用于对抗状况例如疾 病或病症的目的。该术语意欲包括对于患者所患的给定状况的治疗完全范围，例如活性化 合物的施用，以减轻症状或并发症，以延迟疾病、病症或状况的进展，以减轻或缓解症状和 并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或状况以及预防状况，其中预防应当理解为患者的处 理和护理，用于对抗疾病、状况或病症的目的，并且包括活性化合物的施用，以预防症状或 并发症的发作。待治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人类，但它还可以包括动物，例如犬、 猫、牛、羊和猪。然而，应当认识到治疗方案和预防(预防性)方案代表本发明的分别方面。如本文所使用的，本发明修饰的蛋白质的“治疗有效量”意指足以治愈、减轻或部 分抑制给定疾病及其并发症的临床表现的量。足以实现这点的量定义为“治疗有效量”。用 于每个目的的有效量将依赖于例如疾病或损伤的严重程度以及受试者的重量、性别、年龄 和总体状态。应当理解测定合适剂量可以使用常规实验，通过构建值的矩阵且测试在矩阵 中的不同点来达到，这完全在受过训练的医生或兽医的普通技术内。本发明因此提供了用于在治疗中使用的根据本发明的修饰的蛋白质。同样，一般肠胃外剂量在l(T9mg/kg至约100mg/kg体重/施用的范围中。一般施 用剂量是约0. 0000001至约10mg/kg体重/施用。确切剂量将依赖于例如适应症，药物，施 用频率和方式，待治疗的受试者的性别、年龄和总体状况，待治疗的疾病或状况的性质和严 重程度，所需治疗效果和对于本领域技术人员显而易见的其他因素。一般给药频率是每天 2次、每天1次、每2天1次(bi-daily)、每周2次、每周1次或具有甚至更长的给药时间间 隔。由于与相应未缀合的生长激素相比较，本发明的化合物延长的半衰期，具有长给药时间间隔例如每周2次、每周1次或具有甚至更长的给药时间间隔的给药方案是本发明的具体 实施方案。如下文描述的，许多疾病在治疗中使用伴随施用或顺次施用的超过一种药物进 行治疗。因此，在用于治疗下文描述的疾病之一的治疗方法中使用与正常用于治疗所述疾 病的一种或多种其他治疗活性化合物组合的本发明修饰的蛋白质，在本发明的范围内。通 过类比，在用于所述疾病的药物制造中使用与正常用于治疗上述疾病之一的其他治疗活性 化合物组合的本发明修饰的蛋白质，也在本发明的范围内。 胰岛素用于治疗或预防糖尿病，并且在一个实施方案中，本发明因此提供了治疗1 型或2型糖尿病的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的 胰岛素或胰岛素化合物缀合物。因此，在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明修饰的 胰岛素在用于1型或2型糖尿病治疗的药物制造中的用途。GLP-I可以在高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐受不良、1型糖尿病、肥胖、高血压、X 综合征、血脂异常、β-细胞凋亡、β-细胞缺乏、炎性肠病综合征、消化不良、认知病症例如 认知增强、神经保护(neuroprotection)、动脉粥样硬化(atheroschlerosis)、冠心病和其 他心血管病症。在一个实施方案中，本发明因此提供了治疗所述疾病的方法，该方法包括给 有此需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的GLP-I或GLP-I化合物缀合物。因此， 在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的GLP-I或GLP-I化合物缀合物在用于上 述疾病治疗的药物制造中的用途。GLP-2可以在肠衰竭治疗中使用，所述肠衰竭导致营养物在肠中的吸收不良，并且 特别地GLP-2可以在下述疾病的治疗中使用小肠综合征、炎性肠病综合征、Chron氏病、结 肠炎包括胶原结肠炎、放射性结肠炎、放射后萎缩、非热带(谷蛋白耐受不良)和热带口炎 性腹泻、在血管阻塞或创伤后损伤的组织、旅行者腹泻、脱水、菌血症、脓毒症、神经性厌食、 在化学疗法后损伤的组织、早产儿、硬皮病(schleroderma)、胃炎包括萎缩性胃炎、窦切除 术后的萎缩性胃炎和幽门螺杆菌胃炎、溃疡、肠炎、陷凹、淋巴阻塞、血管疾病和移植物抗宿 主、在外科手术后的愈合、放射后萎缩和化学疗法、和骨质疏松症。因此，本发明的目的是 提供治疗上述疾病的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明 的GLP-2或GLP-2化合物缀合物。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的 GLP-2或GLP-2化合物缀合物在用于上述疾病治疗的药物制造中的用途。本发明的化合物还发挥生长激素活性，并且同样可以用于治疗将获益于循环生长 激素量中的增加的疾病或状态。此种疾病或状态包括生长激素缺乏(GHD) ；Turner综合征、 Prader-Willi综合征(PWS) ；Noonan综合征；Down综合征；慢性肾脏疾病、青少年类风湿性 关节炎；囊性纤维化、在接受HAART治疗的儿童中的HIV-感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄 出生的矮小儿童(SGA)；具有极低出生体重出生的儿童但不是SGA中的身材矮小症(VLBW)； 骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成人中的GHD ；长 骨中或长骨的骨折，例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨(matacarpea)、踱 骨(matatarsea)和指；松质骨(spongious bones)中或松质骨的骨折，例如头骨(scull)、 手的底部和足的底部；在例如手、膝或肩中的腱或韧带外科手术后的患者；具有或经历牵 引成骨(distraction oteogenesis)的患者；在髋关节或盘置换、弯月面修复、脊柱融合 或假体固定后的患者，例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中；骨接合术材料例如钉子、螺丝钉和 板已固定到其内的患者；具有骨折不愈合或愈合不良的患者；在从胫骨到第一趾的切骨术(osteatomia)后的患者；在移植物植入后的患者；在由创伤或关节炎引起的膝中的关节软 骨变性；在具有Turner综合征的患者中的骨质疏松症；在男性中的骨质疏松症；在长期透 析中的成年患者(AP⑶)；AP⑶中营养不良相关的心血管病；AP⑶中的恶病质逆转；AP⑶中 的癌症；AP⑶中的慢性抽出性肺疾病；AP⑶中的HIV ；具有AP⑶的老人；AP⑶中的慢性肝 病、APCD中的疲劳综合征；Chron氏病；肝功能受损；具有HIV感染的男性；短肠综合征； 向心性肥胖；HIV相关的脂肪营养不良综合征(HALS)；男性不育症；在大选择性外科手术、 酒精/药物解毒作用或神经学创伤后的患者；衰老；虚弱老人；骨关节炎；外伤性损害的软 骨；勃起机能障碍；纤维肌痛(fibromyalgia)；记忆障碍；抑郁；外伤性脑损伤；蛛网膜下 出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或在儿童中由于糖皮质激素治疗的身 材矮小症。生长激素也已用于加速肌肉组织、神经组织或伤口愈合；对损害组织的血流加速 或改善；或在损害组织中的感染率降低，该方法包括给有此需要的患者施用有效量的治疗 有效量的式I的化合物。本发明因此提供了用于治疗这些疾病或状态的方法，该方法包括 给有此需要的患者施用治疗有效量的根据本发明的生长激 素或生长激素化合物缀合物。一般地，施用的修饰的生长激素量在10_7_10_3g/kg体重、例如10_6_10_4g/kg体重、 例如10-5-10_4g/kg体重的范围中。在另一个实施方案中，本发明提供了生长激素或生长激素化合物缀合物在用于上 述疾病或状态治疗的药物制造中的用途。细胞因子和涉及免疫系统的许多疾病的病因学牵连。具体地，提及IL-20可以与 牛皮癣及其治疗有关，并且1-21与癌症有关并且可以构成对这种疾病的治疗。在一个实 施方案中，本发明提供了用于治疗牛皮癣的方法，其包括施用治疗有效量的根据本发明的 IL-20缀合物。在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的IL-20缀合物在用于牛皮癣治疗 的药物制造中的用途。在另一个实施方案中，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括给有此需要的受 试者施用治疗有效量的本发明的IL-21缀合物。在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的IL-21缀合物在用于癌症治疗中的药 物制造中的用途。TTF蛋白质可以用于增加受试者中的粘膜(muscus)层粘性，减少唾液分泌，例如 其中唾液分泌增加由照射治疗、用抗胆碱能药物治疗或Sj0gren氏综合征引起，治疗变应 性鼻炎，在创伤、休克、大手术、肾病或肝病、用NSAID例如阿司匹林、类固醇或酒精治疗后 继发的应激诱导的胃溃疡。TTF蛋白质还可以用于治疗Chron氏病、溃疡性结肠炎、角结膜 炎、慢性膀胱感染、肠膀胱炎、乳头状瘤和膀胱癌。在一个实施方案中，本发明因此涉及治疗 上述疾病或状态的方法，该方法包括给有此需要的受试者患者施用治疗有效量的根据本发 明的TTF缀合物。在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的TTF缀合物在用于治疗上述疾病或状 态的药物制造中的用途。黑皮质素受体改性剂且特别是黑皮质素4受体激动剂已和肥胖和相关疾病的治 疗和预防牵连。在一个实施方案中，本发明提供了用于预防或延迟葡萄糖耐受不良(IGT) 至不需要胰岛素的2型糖尿病的进展，用于预防或延迟不需要胰岛素的2型糖尿病至需要 胰岛素的糖尿病的进展，用于治疗肥胖和用于调节食欲的方法。糖皮质激素4受体激动剂也已和选自下述的疾病治疗牵连动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、2型糖尿病、葡萄糖耐受 不良(IGT)、血脂异常、冠心病、胆囊疾病、胆石、骨关节炎、癌症、性功能障碍和早产儿死亡 的危险。在一个实施方案中，本发明因此提供了治疗上述疾病或状态的方法，该方法包括给 有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的黑皮质素4受体激动剂缀合物。
在另外一个实施方案中，本发明涉及本发明的黑皮质素4受体激动剂缀合物在用 于上述疾病或状态治疗的药物制造中的用途。因子VII化合物也已和与凝固相关的疾病治疗牵连，并且生物活性的因子VII化 合物特别已和治疗血友病患者、具有针对因子VIII和IX的抑制剂的血友病患者、具有血小 板减少症的患者、具有血小板病例如Glanzmann氏血小板机能不全(thrombasthenia)血小 板释放缺陷和存储池缺陷的患者、具有von Willebrand氏病的患者、具有与创伤或外科手 术相关的肝病和出血问题的患者牵连。生物学无活性的因子VII化合物已牵连于治疗处于 凝固性过高的(hypercoagluable)状态中的患者，例如具有脓毒症、深部静脉血栓形成的 患者，处于心肌感染或血栓形成中风、肺栓塞的危险中的患者，具有急性冠状动脉综合征的 患者，经历冠心病、心脏事件的预防和关于接受血管成形术的患者的再狭窄的患者，具有周 围血管疾病和急性呼吸窘迫综合征的患者。在一个实施方案中，本发明因此提供了用于治 疗上述疾病或状态的方法，该方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明 的因子VII化合物缀合物。在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的因子VII化合物缀合物在用于 上述疾病或状态治疗的药物制造中的用途。许多疾病在治疗中使用伴随施用或顺次施用的超过一种药物进行治疗。因此，在 用于治疗上文描述的疾病之一的治疗方法中使用与正常用于治疗所述疾病的一种或多种 其他治疗活性化合物组合的本发明修饰的蛋白质，在本发明的范围内。通过类比，在用于所 述疾病的药物制造中使用与正常用于治疗上述疾病之一的其他治疗活性化合物组合的本 发明修饰的蛋白质，也在本发明的范围内。如上所述，根据本发明的方法的治疗修饰的蛋白质可以在治疗中使用，并且这也 是本发明的一个实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的修饰的蛋白质在诊断中的用途。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此整体引入本文作为 参考，并且其程度与每个参考文献个别且特别指出引入作为参考，并且在本文中整体阐述 (至由法律允许的最大程度)相同。所有标题和小标题在本文中仅为了方便而使用，并且不应解释为以任何方式限制 本发明。本文提供的任何和所有例子或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意欲更好地 举例说明本发明，并且不对本发明的范围造成限制，除非另有说明。在说明书中的语言不应 解释为指示如实践本发明所必需的任何非具体化的要素。本文专利文件的引用和引入仅为了方便而完成，并且不反映此种专利文件的任何 有效性、专利性和/或可实施性观点。本发明包括如由可应用法律允许的在此附加的实施方案中引用的主题的所有修 饰和等同方案。
本发明通过下述非限制性例子进一步举例说明。 实施例实施例中使用的TGase是根据US5156956来自茂原链轮丝菌 (Streptoverticillium mobaraense)的微生物转谷氨酰胺酶。实施例还包含下述一般方法毛细管电泳毛细管电泳使用 Agilent Technologies 3DCE 系统(AgilentTechnologies)来执 行。数据采集和信号处理使用Agilent Technologies3DCE ChemStation来执行。毛细管 是来自 Agilent 的 64. 5cm(56. 0cm 有效长度)50 iim 内径(i. d.) "Extended Light Path Capillary”。UV检测在200nm(16nm Bw，参考380nm和50nm Bw)处执行。运行电解质是磷 酸盐缓冲液50mM pH7 (方法A)。毛细管用0. 1M NaOH 3分钟，随后用Milli-Q水2分钟并 且用电解质3分钟进行调整(conditioned)。在每次运行后，毛细管用Milli-Q水2分钟， 随后用磷酸2分钟并且用Milli-Q水2分钟进行冲洗。流体动力注射在50mbar下4. 0秒 完成。电压是+25kV。毛细管温度是30°C，并且运行时间是10. 5分钟。Maldi-Tof质谱分析法分子量使用Autoflex Maldi-Tof仪器(Bruker)进行测定。样品使用a-氰 基-4-羟基-肉桂酸作为基质进行制备。RP-HPLCRP-HPLC 分析在 Agilent 1100 系统上使用 Vydac 218TP54 4. 6mm x250mm 5 u m C-18 硅柱(silica column) (The S印arations Group, Hesperia)来执行。检测是通过 UV 在214nm、254nm、280nm和301nm处。柱用0. 1 %三氟乙酸/H20进行平衡，并且样品通过0 至90%乙腈的合适梯度针对0. 三氟乙酸/H20进行洗脱。LC-MSLC-MS分析在PE-Sciex API 100或150质谱仪上执行，所述质谱仪配备2个 Perkin Elmer Series 200 微量泵(Micropumps)、Perkin ElmerSeries 200 自动进样器、 Applied Biosystems 785A UV 检测器和 Sedex 75Evaporative 光散射检测器。Waters Xterra 3. 0mm x 50mm 5 y C-18硅柱以1. 5ml/分钟在室温下进行洗脱。它用5%乙腈 /0. 三氟乙酸/H20进行平衡，并且用5%乙腈/0. 三氟乙酸/H20 1.0分钟，并且随后 用在7分钟内至90%乙腈/0. 1 %三氟乙酸/H20的线性梯度进行洗脱。检测是通过在214nm 处的UV检测和Evaporative光散射。将柱洗脱物的级分引入PE-Sciex API 100质谱仪的 离子喷射界面内。在运行过程中每2秒扫描质量范围300-2000amu。蛋白质定量蛋白质浓度通过使用NanoDrop ND_1000UV_分光光度计测量在280nm下的吸光度 进行估计。用于测定一个或多个衍牛位点的酶促肽作图肽作图使用还原和烷基化的蛋白质的Asp-N消化来执行。首先，蛋白质根据标准 程序用DTT (二硫苏糖醇)和碘乙酰胺进行处理。烷基化的产物使用HPLC进行纯化。随后， 烷基化的纯化产物用内切蛋白酶Asp-MBoehringer)以1 100的酶底物比消化过夜。消化物使用C-18柱和标准三氟乙酸/乙腈缓冲系统进行HPLC分离。所得到的肽图与未衍 生的hGH的那种进行比较，并且收集具有不同保留时间的级分，并且使用Maldi-tof质谱分 析法进行进一步分析。SDS pageSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳使用 NuPAGE 4 % -12 % Bis-Tris 凝胶(Invitrogen NP0321B0X)来执行。凝胶进行银染色(InvitrogenLC6100)或考马斯染色(Invitrogen LC6065)，并且相关时还就PEG用碘化钡进行染色，如由M. M. Kurfurst在Anal. Biochem. 200(2) :244_248，1992 中所述。蛋白质层析蛋白质层析在来自GE Health Care的AktaExplorer层析系统和柱上执行。阴离 子交换使用Q-S印harose HP 26/10柱完成。起始缓冲液是20mM三乙醇胺缓冲液pH 8.5， 并且洗脱缓冲液是起始缓冲液+0. 2MNaCl。化合物一般用0-75%洗脱缓冲液梯度经过15 柱体积进行洗脱。脱盐和缓冲液更换使用HiPr印26/10柱来执行。实施例实施例中使用的TGase是根据美国专利号5，156，956来自茂原链轮丝菌的微生物
转谷氨酰胺酶。实施例还包含下述一般方法毛细管电泳毛细管电泳使用 Agilent Technologies 3DCE 系统(AgilentTechnologies)来执 行。数据采集和信号处理使用Agilent Technologies3DCE ChemStation来执行。毛细管是 ^tg Agilent^64. 5cm(56. 0cm W^^iS) 50 u m Extended Light Path CapillEffy，，。 UV检测在200nm(16nm Bw，参考380nm和50nm Bw)处执行。运行电解质是磷酸盐缓冲液 50mM pH7(方法A)。毛细管用0. 1M NaOH 3分钟，随后用Milli-Q水2分钟并且用电解质 3分钟进行调整。在每次运行后，毛细管用Milli-Q水2分钟，随后用磷酸2分钟并且用 Milli-Q水2分钟进行冲洗。流体动力注射在50mbar下4.0秒完成。电压是+25kV。毛细 管温度是30°C，并且运行时间是10. 5分钟。Maldi-Tof质谱分析法分子量使用Autoflex Maldi-Tof仪器(Bruker)进行测定。样品使用a-氰 基-4-羟基-肉桂酸作为基质进行制备。RP-HPLCRP-HPLC 分析在 Agilent 1100 系统上使用 Vydac 218TP54 4. 6mm x250mm 5 u m C-18 硅柱(The S印arations Group, Hesperia)来执行。检测是通过 UV 在 214nm、254nm、 280nm和301nm处。柱用0. 1 %三氟乙酸/H20进行平衡，并且样品通过0至90 %乙腈的合 适梯度针对0. 三氟乙酸/H2O进行洗脱。LC-MSLC-MS分析在PE-Sciex API 100或150质谱仪上执行，所述质谱仪配备2个 Perkin Elmer Series 200 微量泵、Perkin Elmer Series 200 自动进样器、Applied Biosystems 785A UV 检测器和 Sedex 75 Evaporative 光散射检测器。Waters Xterra 3. 0mm x 50mm 5 u C-18硅柱以1. 5ml/分钟在室温下进行洗脱。它用5%乙腈/0. 三氟乙酸/H2O进行平衡，并且用5%乙腈/0. 1 %三氟乙酸/H2O 1. 0分钟，并且随后用在7分钟 内至90%乙腈/0. 三氟乙酸/H2O的线性梯度进行洗脱。检测是通过在214nm处的UV检 测和Evaporative光散射。将柱洗脱物的级分引入PE-Sciex API 100质谱仪的离子喷射 界面内。在运行过程中每2秒扫描质量范围300-2000amu。蛋白质定量蛋白质浓度通过使用NanoDrop ND-1000 UV-分光光度计测量在280nm下的吸光 度进行估计。用于测定一个或多个衍牛位点的酶促肽作图肽作图使用还原和烷基化的蛋白质的Asp-N消化来执行。首先，蛋白质根据标准 程序用DTT (二硫苏糖醇)和碘乙酰胺进行处理。烷基化的产物使用HPLC进行纯化。随后， 烷基化的纯化产物用内切蛋白酶Asp-N(Boehringer)以1 100的酶底物比消化过夜。 消化物使用C-18柱和标准三氟乙酸/乙腈缓冲系统进行HPLC分离。所得到的肽图与未衍 生的hGH的那种进行比较，并且收集具有不同保留时间的级分，并且使用Maldi-tof质谱分 析法进行进一步分析。SDS pageSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳使用 NuPAGE 4 % -12 % Bis-Tris 凝胶(Invitrogen NP0321B0X)来执行。凝胶进行银染色(InvitrogenLC6100)或考马斯染色(Invitrogen LC6065)，并且相关时还就PEG用碘化钡进行染色，如由Μ. M. Kurfurst在Anal. Biochem. 200(2) :244_248，1992 中所述。蛋白质层析蛋白质层析在来自GE Health Care的AktaExplorer层析系统和柱上执行。阴离 子交换使用Q-S印harose HP 26/10柱完成。起始缓冲液是20mM三乙醇胺缓冲液pH 8.5， 并且洗脱缓冲液是起始缓冲液+0. 2MNaCl。化合物一般用0_75 %洗脱缓冲液梯度经过15 柱体积进行洗脱。脱盐和缓冲液更换使用HiPr印26/10柱来执行。实施例1修饰的人生长激素(化合物1)的制备<formula>formula see original document page 42</formula>
化合物1如图3中所述，制备20mM三乙醇胺缓冲液，pH 8，5。(TEA-缓冲液)；(a)使20mg hGH溶解于TEA-缓冲液(0，5ml)中，和(b)使68mg Z-Gln-Gly-OH溶解于TEA-缓冲液(Iml) 中；禾口 (c)使200mgAktiva WM TGase制剂(包含 0. 5% TGase蛋白质)溶解于TEA-缓冲液(ImL)中。使㈧和⑶混合，并且加入10 μ 1(C)。在室温下19小时后，通过离子交 换层析分离主要产物，并且肽作图和序列分析显示产物在Lysl45中选择性衍生化。实施例2N-碳酰氧苯甲基_谷氨酰胺酰_甘氨酰_ (4-氨基-苯丙氨酸)[Z-Gln-Gly- (4_氨 基-Phe) -0H]，化合物2的制备
<formula>formula see original document page 43</formula>
化合物2第一个氨基酸与树脂的附着向2-氯三苯甲基氯树脂(Pi3pChem，2g，1.5mm0l/ g)中加入溶解于DCM(16ml)和二异丙基乙胺(780 μ 1)的混合物中的Fm0C-(4-B0C-氨 基-Phe)-0H(Fluka，2. 26g，4. 5mmol)。使浆搅拌5分钟，随后加入二异丙基乙胺(1540 μ 1)。 搅拌持续1小时的时间段，这之后加入甲醇(5ml)，并且继续搅拌另外15分钟。使树脂排出 并且用二氯甲烷(DCM) (6x30ml)随后为N-甲基吡咯烷酮(NMP) (6x30ml)进行洗涤。Fmoc基团的去除向树脂中加入溶于NMP(20ml)中的20 %哌啶并且使反应进 行15分钟。使树脂排出，并且再次用溶于NMP(20ml)中的20%哌啶处理1小时。使树 脂排出，并且用NMP (6x30ml)洗涤。偶联Z-Gln-Gly-OH 向树脂中加入溶于NMP中的 Z-Gln-Gly-OH(Bachem, 1. 52g,4. 5mmol)和羟基苯并三唑(H0Bt,0. 61g,4. 5mmol)的溶液， 随后为二异丙基碳二亚胺(DIC)(700yl，4.5mmol)。在反应过夜后，使树脂排出，并且用 NMP(6x30ml)随后用 DCM(6x30ml)进行洗涤。从固体支持体切割使树脂排出，以取出大量DCM。它用三氟乙酸(TFA) (12. 6ml)、 水(0. 6ml) ,DCM(5. 8ml)和三异丙基硅烷(0. 8ml)的混合物进行处理。在反应1小时后，树 脂在15分钟内缓慢过滤到二乙醚(IOOml)内，使之搅拌另外30分钟。所得到的沉淀通过 离心进行回收，并且用二乙醚洗涤3次。使固体在真空中干燥过夜。根据1H-NMR和LC-MS， 产物是纯的且同质的。实施例3hGH用Z-Gln-Gly-(4-氨基-Phe)-OH(化合物2)转酰胺基化，以获得 Z-Gln (hGH) -Gly- (4-氨基-Phe) -0H,化合物 3<formula>formula see original document page 44</formula>化合物3制备3种溶液1)使hGH (40mg, 1. 8 μ mol)溶解于Iml 20nM三乙醇胺缓冲 液 pH 8. 5 中；2)使 Z-Gln-Gly-OH(202mg，412 μ mol)溶解于 2ml 20nM 三乙醇胺缓冲液 PH 8. 5中，pH使用10%三乙醇胺溶液(2.4ml)调整至8. 15 ；3)使转谷氨酰胺酶Activa WKAjinomoto)(在具有麦芽糖糊精的固体混合物中1 %，36mg，9nmol)溶解于Iml 20nM三 乙醇胺缓冲液PH 8. 5中。使溶液1和2混合，并且将111 μ 1溶液3加入这种混合物中；pH是8. 2并且体积 是5. 5ml。反应通过CE监控。在室温(r. t.)下5小时反应后，通过的CE分析显示具有增 加的迁移时间的新产物的存在，显示约70%转化至转酰胺基化产物。向反应混合物中加入 IOmM含水N-乙基马来酰亚胺(300 μ 1)，并且将它贮存于5°C过夜。将混合物装载到15ml HiPr印柱(GE Healthcare)，并且使用三乙醇胺缓冲液pH 8. 5洗脱，以取出低分子量物质 和盐。合并相关级分，并且基于UV吸收测量，回收是36. 6mg蛋白质。实施例4Z-Gln (hGH) -Gly- (4-氨基-Phe) -OH (化合物3)的聚乙二醇化，以获得化合物4
<formula>formula see original document page 44</formula>向根据实施例3制备的转酰胺基化hGH溶液中加入冰乙酸(Iml)和水(Iml)的混 合物。PH测量为2，并且随后使用IM NaOH(Iml)调整至3. 3。向这种溶液中加入溶解于三 乙醇胺缓冲液PH 8. 5(1. 2ml)和水(1.2ml)的混合物中的PEG-醛40kDa (120mg，3 μ mol)。 允许它反应1小时时间段，这之后加入溶于水(Iml)中的70 μ 1 NaCNBH3 (7. lmg,8ymol)溶 液。反应持续过夜。通过还原SDSPAGE的分析显示具有预期分子量的产物的存在。混合物 在HiPrep柱上如实施例3那样进行脱盐，从而回收作为20ml的相关合并级分，用20ml水 稀释所述相关合并级分。将这种混合物装载到Q-S印harose HP26/10(GE Healthcare)。起 始缓冲液是三乙醇胺缓冲液PH 8.5。使用在15柱体积中在三乙醇胺缓冲液pH 8. 5中的 0-75% 0. 2M NaCl梯度，随后在5柱体积中在三乙醇胺缓冲液pH 8. 5中的75-100% 0. 2MNaCl洗脱产物。肽作图分析和序列分析证实化合物4是在位置Lysl45中选择性修饰的hGH。实施例5N-碳酰氧苯甲基_谷氨酰胺酰_甘氨酸_2，3- 二羟基丙-1-酰胺，化合物5的制 备
<formula>formula see original document page 45</formula>在氮气氛下制备溶于具有三乙胺(0.41ml)的DMF(20ml)中的 Z-Gln-Gly-OH(Bachem, Ig, 2. 96mmol)溶液，并且冷却至< 20°C。使溶解于 DMF (4ml)中的氯 甲酸异丁酯(407μ 1，0. 42g，3. lmmol)在3分钟时间段内逐滴加入搅拌的溶液中。搅拌在寒 冷中继续另外50分钟，这之后加入溶于具有三乙胺(0.41ml)的DMF(2ml)中的(R)_3_氨 基1，2_丙二醇(0.27g，2.96mmol)悬浮液。去除冷却浴，从而允许溶液缓慢达到室温。继 续搅拌另外16小时，这之后使反应混合物在真空中浓缩至干燥，从而留下粗产物(1.9g)， 其通过反相HPLC进行纯化。根据1H-NMR和LC-MS，产物是纯的且同质的。实施例6N-碳酰氧苯甲基-谷氨酰胺酰-甘氨酰-炔丙基甘氨酸，化合物6的制备
<formula>formula see original document page 45</formula>
化合物6这种化合物类似于化合物2 (实施例2)进行制备，其中使用Fmoc-炔丙基甘氨酸 代替Fmoc-(4-Boc-氨基-Phe)-OH作为待与树脂偶联的第一个氨基酸。虽然本发明的某些特征已在本文中举例说明且描述，但许多修饰、置换、改变和等 同方案目前对于本领域普通技术人员将是显而易见的。因此，应当理解附加实施方案预期 涵盖如落在本发明的真正精神内的所有此种修饰和改变。实施例7hGH用Z-Gln-Gly-2，3-二羟基丙-1-酰胺(化合物5)的转酰胺基化，以获得 Z-Gln (hGH) -Gly-2，3- 二羟基丙-1-酰胺，化合物 7<formula>formula see original document page 46</formula>程序等同于实施例3的那种。25小时时间段后，将65%原材料(hGH)转化成所需 产物7，如通过CE分析测定的。实施例8hGH用Z-Gln-Gly-炔丙基甘氨酸_0H(化合物6)的转酰胺基化，以获得 Z-Gln (hGH) -Gly-炔丙基甘氨酸_0H，化合物8
<formula>formula see original document page 46</formula> 程序等同于实施例3的那种。22小时时间段后，将59%原材料(hGH)转化成所需 产物8，如通过CE分析测定的。序列
SEQ ID NO 1
人生长激素多核苷酸
atggctacaggctcccggacgtccctgctcctggcttttggcctgctctgcctgccctgg
cttcaaqagggcagtgccttcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacgctatg
ctccgcgcccatcgtctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagtttgaagaagcc
tatatcccaaaggaacagaagtattcattcctgcagaacccccagacctccctctgtttc
tcagagtctattccgacaccctccaacagggaggaaacacaacagaaatccaacctagag
ctgctccgcatctccctgctgctcatccagtcgtggctggagcccgtgcagttcctcagg
agtgtcttcgccaacagcctggtgtacggcgcctctgacagcaacgtctatgacctccta
aaggacctagaggaaggcatccaaacgctgatggggaggctggaagatggcagcccccgg
actgggcagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaC3.3.3.C t C3.C3.caacgatgac
gcactactcaagaactacgggctgctctactgcttcaggaaggacatggacaaggtcgag
acattcctgcgcatcgtgcagtgccgctctgtggagggcagctgtggcttctag
SEQ ID NO 2
人生长激素多肽matgsrtsll Iafgllclpw lqegsafpti plsrlfdnam lrahrlhqla fdtyqefeeayipkeqkysf lqnpqtslcf sesiptpsnr eetqqksnle llrisllliq swlepvqfIrsvfanslvyg asdsnvydll kdleegiqtl mgrledgspr tgqifkqtys kfdtnshnddallknyglIy cfrkdmdkve tflrivqcrs vegscgfSEQ ID NO 3；MAAGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRARRLYQLAYDTYQEFNPQTSLCFSESIPTPSNRVKTQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQLLRSVFANSLVYGASDSNVYRHLKDLEEGIQTLMWRLEDGSPRTGQIFNQSYSKFDTKSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
权利要求
一种用于蛋白质的位点选择性修饰的方法，所述方法包括使所述蛋白质与辅助蛋白质和具有下式的性质修饰基团接触R1-Gln-Gly-R2。
2.根据权利要求1的方法，其中Rl和R2是适合于进一步修饰的基团。
3.根据权利要求2的方法，其中Rl包含芳族或杂芳族基团。
4.根据权利要求3的方法，其中Rl是苯甲氧甲酰基(PhCH2OC= 0)。
5.根据权利要求4的方法，其中R2是适合于进一步修饰的基团。
6.根据权利要求5的方法，其中R2是包含选自下述的官能团的基团-CHO、-ONH2, Ar-NH2、炔基、叠氮基、-NHNH2、-CHX-CH2Y或-CHY-CH2X (其中X是0或N和Y是0)、缩醛或 不同潜在醛、-SH、Z-CH2C = 0(其中Z是Cl、Br或I)。
7.根据权利要求6的方法，其中R2是包含选自下述的官能团的基团-CHO、-ONH2, Ar-NH2、炔基、叠氮基、-NHNH2、-CHX-CH2Y或-CHY-CH2X (其中X是0或N和Y是0)、缩醛或 不同潜在醛、-SH、Z-CH2C = 0(其中Z是Cl、Br或I)。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述蛋白质是细胞因子。
9.根据权利要求1-7的方法，其中所述蛋白质属于4-螺旋束蛋白质种类。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述蛋白质是hGH。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其中所述辅助蛋白质是修饰谷氨酰胺残基的酶。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述辅助蛋白质是转谷氨酰胺酶。
13.根据权利要求12的方法，其中所述转谷氨酰胺酶是来自茂原链霉菌的微生物转谷氨酰胺酶。
14.根据权利要求13的方法，其中所述转谷氨酰胺酶是具有80%或更多序列同源性的 来自茂原链霉菌的微生物转谷氨酰胺酶突变体。
15.根据权利要求2的方法，其中所述性质修饰基团选自<image>image see original document page 2</image>
16.一种用于生长激素的位点选择性修饰的方法，所述方法包括使所述蛋白质与辅助 蛋白质和具有下式的性质修饰基团接触R1-Gln-Gly-R2。
17.根据权利要求16的方法，其中Rl和R2是适合于进一步修饰的基团。
18.根据权利要求17的方法，其中Rl包含芳族或杂芳族基团。
19.根据权利要求18的方法，其中Rl是苯甲氧甲酰基(PhCH2OC= 0)。
20.根据权利要求19的方法，其中R2是适合于进一步修饰的基团。
21.根据权利要求20的方法，其中R2是包含选自下述的官能团的基团-CHO、-ONH2, Ar-NH2、炔基、叠氮基、-NHNH2、-CHX-CH2Y或-CHY-CH2X (其中X是0或N和Y是0)、缩醛或 不同潜在醛、-SH、Z-CH2C = 0(其中Z是Cl、Br或I)。
22.<image>image see original document page 0</image>
23.根据权利要求22的方法，其中R2是包含选自下述的官能团的基团-CHO、-ONH2, Ar-NH2、炔基、叠氮基、-NHNH2、-CHX-CH2Y或-CHY-CH2X (其中X是0或N和Y是0)、缩醛或 不同潜在醛、-SH、Z-CH2C = 0(其中Z是Cl、Br或I)。
24.根据权利要求16的方法，其中所述生长激素是人生长激素。
25.根据权利要求16的方法，其中所述辅助蛋白质是转谷氨酰胺酶。
26.根据权利要求25的方法，其中所述转谷氨酰胺酶是来自茂原链霉菌的微生物转谷 氨酰胺酶。
27.根据权利要求26的方法，其中所述转谷氨酰胺酶是具有80%或更多序列同源性的 来自茂原链霉菌的微生物转谷氨酰胺酶突变体。
28.根据权利要求16的方法，其中所述性质修饰基团选自<formula>formula see original document page 3</formula>
29.根据权利要求16的方法，其中所述人生长激素在赖氨酸残基处进行修饰。
30.根据权利要求29的方法，其中所述人生长激素在赖氨酸145处进行修饰。
31.根据权利要求30的方法，其中所述人生长激素在赖氨酸145处进行修饰，并且随后 与和hGH相比较延长缀合物的体内半衰期的延长基团缀合。
32.根据权利要求15的方法，其中所述延长基团是亲水聚合物。
33.根据权利要求31的方法，其中所述延长基团是PEG。
34.根据权利要求31的方法，其中所述延长基团包含与清蛋白可逆结合的部分。
35.根据权利要求31的方法，其中所述延长基团包含脂肪酸残基或脂肪二酸残基。
全文摘要
总的来说，本发明涉及对蛋白质引入性质修饰基团的新方法。具体地，本发明涉及赖氨酸残基的衍生，以及具有改良的药理学性质的生长激素的新缀合物，和用于其制备和在治疗中使用的方法。
文档编号C07K14/61GK101809032SQ200880108349
公开日2010年8月18日 申请日期2008年8月25日 优先权日2007年8月24日
发明者J·布查特, N·兰格兰约翰森 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司