专利名称：一种血红密孔菌gw菌漆酶的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物酶学领域，具体的讲涉及真菌担子菌门的一种血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.)CGMCC NO.1008的新菌株以及通过培养该菌株制备漆酶的方法。
背景技术：
漆酶(p-diphenol oxygen oxidoreductase，EC 1.10.3.2.)是一种蓝色、含有多个铜离子的酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应。漆酶(laccase)可降解木质素中的酚类和非酚类结构，在木质素的生物降解中发挥着重要的作用，同时由于木质素中的许多化学键普遍存在于芳香族化合物中，而漆酶对木质素的降解又是氧化性的和非特异性的，这就使得漆酶也能降解芳香族化合物。漆酶氧化的底物包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。目前通过不断研究，漆酶可氧化的非酚底物范围还在不断扩大。漆酶能把分子氧直接还原为水，在没有H2O2存在下，可催化有机污染物的氧化。漆酶又能使木素类多酚物质以游离基方式进行氧化聚合，替代传统木材工业采用合成树脂胶粘剂或其它化学品。用无污染、低能耗的酶学的方法取代污染严重的化学方法，把污染消除在源头。因此，漆酶在生物技术和环境保护方面有着巨大的应用潜力。
白腐菌是能够将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯一生物。白腐菌还能够产生木质素过氧化物酶(LiP)和锰氧化物酶(MnP)，但其产生的漆酶比木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶更具有热稳定性。因此，这一生物类群引起了世界生物学家的极大兴趣。
白腐菌中的血红密孔菌被认为是研究漆酶的理想菌株。然而，现有已知的菌株其漆酶产率较低，从检索的文献资料来看，国内的产量都较低，而国外的产量较高的也较少。因此，漆酶的高产菌株的研究迫在眉睫，从而需要提供能够以高产率且较易制备漆酶的新菌株。
发明内容
本发明的目的提供一种能产生漆酶的血红密孔菌(Pycnoporussanguineus(LFr)Murr.)的新变异菌株。另一个目的是通过的提供血红密孔菌GW CGMCC NO.1008变异菌株先培养；再从这些培养物中经常规的酶分离技术如离心分离、超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱、凝胶过滤柱、冷冻干燥提供提取制备漆酶的方法。该变异菌株能够产生大量具有高活力的漆酶。根据本发明提供的方法，血红密孔菌GWCGMCC NO.1008的双核菌丝在液体培养基中产生的最高漆酶活力可达到43U/mL。
本发明的新变异菌株血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.)GW已经于2003年9月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国，北京，保藏，并收到保藏登记号血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.)GW CGMCC NO.1008。
本发明的血红密孔菌GW GWCGMCC NO.1008是通过紫外线照射由亲本血红密孔菌G05变异而获得的。
本发明的菌株血红密孔菌GW CGMCC NO.1008具有以下微生物学特性1、形态学特性在显微镜下，本发明菌株在固体培养基上生长的菌丝，菌丝易断裂。
亲本菌株(G05)和本发明菌株血红密孔菌GW CGMCC NO.1008之间的形态学特征差异见于表1。
表1
2、生理特性本发明的菌株是一种需氧菌，在30℃显示出最佳的生长能力，它在发酵培养基中产生漆酶，并伴随着有大量的色素产生，加入小麦麸皮后，漆酶的产量会提高2-3倍。用麦芽糖、蔗糖或葡萄糖作为碳源时菌株生长的速度差别不大，但用麦芽糖比用蔗糖或葡萄糖时产生的漆酶量要多。
使用本发明的菌株制备漆酶的方法包括在含有碳源、氮源、无机物和其他营养物的培养基中培养血红密孔菌GW的方法，固体种子培养基为麦芽汁，2％琼脂；发酵培养基为麦芽糖1.5％，酒石酸铵0.2％，KH2PO40.133％，NaH2PO4·12H2O 0.039％，MgSO4·7H2O 0.05％，琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O 0.118％，FeSO4·7H2O 0.00315％，CaCl2·2H2O0.01％，MnSO4·H2O 0.0035％，CH3COONa·3H2O 0.0408％，CoCl2·6H2O 0.006％，ZnSO4·7H2O 0.0028％，CuSO4·5H2O 0.0168％，上述的“％”百分比是以水为基质的固体重量对水体积的百分比，小麦麸皮6g，Tween-80 1ml，VitaminB1 10μg，VitaminB2 5μg，VitaminB6 5μg，加水至1L。还包括从培养物中回收漆酶的方法。
在本发明的培养基中所使用的主要碳源可包括但不限于麦芽糖。在本发明的培养过程中所使用的氮源可包括但不限于酒石酸铵。本发明在发酵中使用的无机组分可包括硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙、氯化钴等。
第四天加入诱导物2，5二甲基苯胺(2，5-Dimethylaniline)10μM，发酵可在30±0.1℃的需氧条件下进行12天。菌株产生的漆酶产物分泌于细胞外，贮存于培养基中，通过使用常规分离方法(但并不限于这些步骤)从培养基中分离出漆酶。例如离心除去菌丝，使用超滤除去一部分小分子物质并进一步浓缩发酵上清液，硫酸铵分级沉淀，过离子交换柱，过凝胶过滤柱，冷冻干燥。通过这些步骤可以除去大部分的杂蛋白和几乎全部的色素。
已经被本发明人证实，本发明菌在目前的条件下，其双核菌丝发酵得到的漆酶活力可高达43U/ml。而且本发明菌不产生木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，便于漆酶的提取。
按照本发明提供的方法制备的漆酶可以在酚类、芳胺、芳香羧酸及其它们的衍生物的生物降解中的应用。另外在造纸制浆生物漂白和废水处理中和木材加工替代化学胶合剂都可应用。所以，本发明的重要意义在于可以替代传统木材加工工业所采用的具有污染严重的化学方法合成树脂胶粘剂或其它化学品，采用本发明的无污染、低能耗的漆酶取代传统的木材加工工业，在环境保护中有着巨大的应用潜力。
图1血红密孔菌GW CGMCC NO.1008的菌落形态图2血红密孔菌GW CGMCC NO.1008的菌丝形态(x1100)具体实施方式
通过以下实施例将更加进一步地说明本发明，但本发明并非受这些实施例1在本发明中漆酶活力的测定是采用国际通用的方法，用2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(英文简称ABTS){2，2-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}来测定的。酶活力的计算是据酶活力的定义进行的。一个酶活力单位U的定义在特定条件下，每分钟内催化1μM底物的酶量。由朗伯-比尔定律A＝ε·L·C，得到C＝A/ε·L.
根据酶活力的定义得到U＝C·V/T，那么得到酶活力的计算公式为U＝A·V/(ε·L·T).
在以上的公式中，其中C表示底物在T时间内的浓度的变化的量(单位μM)，A表示紫外分光光度计吸收值的变化，V表示反应的体系的体积(单位mL)，ε＝3.6×104M·cm-1＝36(μmol/ml)-1·cm-1，为氧化型ABTS的摩尔消光系数，L为比色皿的光径(单位cm)，T为反应的时间(单位分钟)。
本发明中酶活力测定条件为反应体积V＝1mL，比色皿的光径L＝0.5cm，反应时间T＝30秒。其中反应体系的体积1mL内含有的500μL的50mM的酒石酸缓冲液(pH 4)，390μL的水，100μL的500μM的ABTS，10μL的发酵液，选用波长为420nm。如果发酵液含有漆酶活力太高，可适当稀释。
实施例2将血红密孔菌Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.(GW)接种至固体种子培养基麦芽汁，2％琼脂上。30℃下培养6-8天。取菌落最边沿的菌块(直径1cm，10块)，接种到500ml三角瓶内装100ml的经高压湿热灭菌的发酵培养基麦芽糖1.5％，酒石酸铵0.2％，KH2PO40.133％，NaH2PO4·12H2O 0.039％，MgSO4·7H2O 0.05％，琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O 0.118％，FeSO4·7H2O 0.00315％，CaCl2·2H2O 0.01％，MnSO4·H2O 0.0035％，CH3COONa.3H2O 0.0408％，CoCl2·6H2O 0.006％，ZnSO4·7H2O 0.0028％，CuSO4·5H2O 0.0168％，上述的“％”百分比是以水为基质的固体重量对水体积的百分比，小麦麸皮6g，Tween-80 1ml，VitaminB1 10μg，VitaminB2 5μg，VitaminB6 5μg，加水至1L。8磅高压湿热灭菌30分钟，200rpm，30℃，暗培养，第四天加入诱导物2，5二甲基苯胺(2，5-Dimethylaniline)10μM，培养12天。按照实施例1的方法测定漆酶活力，菌丝发酵得到的漆酶活力可高达43U/ml。
实施例3取实施例2中得到的发酵液，进行离心除去发酵沉淀物，取上清液经真空抽滤，获得的抽滤液经PLGC膜(10000D)超滤，进行初步浓缩。随后采用两步硫酸铵沉淀法沉淀，第一步用35％(W/V)的饱和硫酸铵4℃搅拌沉淀，10000rpm离心1小时，弃沉淀，留上清；第二步用第一步所得的上清液加80％(W/V)的饱和硫酸铵4℃温和搅拌沉淀，4℃静至2小时以上，然后10000rpm离心1小时，弃上清，留沉淀。将第二步得到的沉淀用两倍体积的100mM磷酸钾缓冲液(pH 5.7)溶解，然后进行透析，透析液为10mM的磷酸钾缓冲液。其中超滤后漆酶的得率为81.82％，硫酸铵沉淀后的漆酶得率为88.89％，磷酸钾缓冲液透析后的漆酶得率为96.46％。
实施例4在本实施例中，进一步分离纯化漆酶蛋白。取实施例3中的浓缩液10mL用于离子交换柱层析。离子交换介质选用DEAE SepharoseF.F.，缓冲液为20mM的组氨酸缓冲液(pH6.0)，洗脱液为0.1-0.6MNaCl的组氨酸洗脱液，流速为1mL/分。然后冷冻干燥浓缩得漆酶。
权利要求
1.一种由血红密孔菌GW CGMCC NO.1008发酵制备漆酶的方法，该方法包括先培养血红密孔菌GW CGMCC NO.1008；再从这些培养物中通过离心分离、超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱、凝胶过滤柱、冷冻干燥分离技术提取制得漆酶。
2.根据权利要求1所述的方法，先培养使用的碳源为麦芽糖，氮源有酒石酸铵，使用的无机组分有硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙、氯化钴。
3.根据权利要求1所述的方法，固体种子培养基为麦芽汁，2％琼脂；发酵培养基为麦芽糖1.5％，酒石酸铵0.2％，KH2PO40.133％，NaH2PO4·12H2O 0.039％，MgSO4·7H2O 0.05％，琥珀酸钠(CH2COONa)2·6H2O0.118％，FeSO4·7H2O 0.00315％，CaCl2·2H2O 0.01％，MnSO4·H2O 0.0035％，CH3COONa·3H2O 0.0408％，CoCl2·6H2O 0.006％，ZnSO4·7H2O 0.0028％，CuSO4·5H2O 0.0168％，上述的“％”百分比是以水为基质的固体重量对水体积的百分比，小麦麸皮6g，Tween-80 1ml，VitaminB1 10μg，VitaminB2 5μg，VitaminB6 5μg，加水至1L。
4.根据权利要求1所述的方法，血红密孔菌GW CGMCC NO.1008培养经过4天，培养基要加入诱导物，2，5二甲基苯胺2，5-Dimethylaniline，第12天，从培养物中分离并提纯漆酶，产酶活力高达43U/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，先培养是在需氧、暗培养的条件下进行的。
6.根据权利要求4所述的方法，培养基加入诱导物2，5二甲基苯胺2，5-Dimethylaniline的量为10μM。
7.权利要求1-6所述的方法制备的漆酶在降解酚类、芳胺、芳香羧酸及其它们的衍生物中的应用。
8.权利要求1-6所述的方法制备的漆酶在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应用。
9.权利要求1-6所述的方法制备的漆酶在木材加工替代化学胶合剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种血红密孔菌GW(CGMCCNO.1008)菌株与其他已知生产漆酶的同类及其亲本菌株不同。还提供了通过发酵培养该菌制备漆酶的方法。该菌株的双核菌丝产酶能力可以高达43U/mL。漆酶氧化的底物包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，为此，本发明的意义在造纸制浆生物漂白和废水处理中、木材加工行业中替代化学胶合剂发挥着重要的作用。
文档编号C02F3/00GK1621519SQ20031011837
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年11月25日
发明者郭林, 王文惠, 张虎成, 李伟 申请人:中国科学院微生物研究所