专利名称：特效菌ypc－ta3及处理废水的方法
技术领域：
本发明创造涉及特效微生物菌的筛选纯化及处理化工废水的方法。
背景技术：
对苯二甲酸(以下简称PTA)作为石油化工企业的重要产品之一，相应产生的废水排放量也相当大，其废水中COD高达几千甚至上万。由于PTA废水中的污染物多为芳香族化合物，同时PTA也是一种毒害性污染物，而且废水的处理难度较大，属于难生物降解的废水。因此深入研究开发高效廉价大规模工业化降解处理PTA废水的技术及装备具有十分重要的意义。
现有各种处理PTA废水的技术均有一定的缺陷和不足。总的来说有的工艺复杂，构筑物多，基建投资大，出水质量一般有的污泥产量大，占地面积大，运行费用高。其主要的原因之一就是处理装置中有效菌含量低，杂菌含量过高，即缺少对污水中污染物具有高效降解作用的有效菌，尤其是针对PTA废水中具有的高效降解菌。
本发明采用微生物筛选、纯化技术，从自然环境中获得原始菌株，以芳香羧酸为碳源进行纯化培养，获得对芳香羧酸具有高效降解作用的菌株，并测定其对COD及芳香羧酸的降解性能。测定结果，该菌降解性能优良，对芳香羧酸废水的生物处理有很大的应用价值。
三、发明的内容本发明目的为了提供对芳香羧酸，特别是苯二甲酸具有高效降解作用的特效菌，所述特效菌为YPC-TA3，(Clavibacter xyliyzsc，保藏在CGMCC，保藏编号No.1201，保藏日期2004年8月3日)本发明另一目的是一种利用上述特效菌YPC-TA3处理废水的方法。
本发明的技术构思从自然环境中获得原始菌株样本，进行筛选培养，获得初步菌株样本，接种后进行芳香羧酸降解性能测试，选取性能最好的为目标样本既特效菌。
以下对本发明作进一步描述一、菌株分离筛选方法(一)试剂配制1.芳香羧酸贮备液称取40g纯对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)溶于1000ml蒸馏水中，用Na2CO3调节在7.2～7.7之间。
2.富集培养液I牛肉膏0.1g，蛋白胨0.2g，NaCl 0.2g，溶于100ml蒸馏水中。
3.富集培养液II牛肉膏0.5g，蛋白胨0.5g，NaCl 0.2g，溶于100ml蒸馏水中。
4.筛选培养基琼脂4g，Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)贮备液20ml，加蒸馏水至100ml。
5.模拟废水Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)贮备液5ml，加蒸馏水至100ml。
6.富集培养基琼脂0.6g，牛肉膏0.6g，蛋白胨0.6g，NaCl 0.4g，溶于100ml蒸馏水中。
7.保存培养基Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，琼脂2g，对苯二甲酸(或邻苯二甲酸、间苯二甲酸、苯甲酸)贮备液1ml，溶于100ml蒸馏水中。
(二)筛选方法1、初筛第一步取芳香羧酸堆场上某处土壤约1g，用50ml富集培养液I室温摇床培养24小时。
第二步将第一步获得的菌悬液稀释至10-5～10-6，在筛选培养基上涂布，培养48小时，进行驯化。
第三步配制摸拟废水，测其COD，记为初始COD。
第四步从第二步所制筛选培养基上生长的菌落中挑出18个，移入18瓶各含50ml富集培养液II的瓶中，室温摇床培养24小时。
第五步将第四步获得的菌悬液各取10ml，离心12min，弃上清液，将沉淀物移入模拟废水中，在660nm波长处测定其吸光度，确定其菌体浓度。培养48小时，离心12min，取上清液做COD，记为终了COD。
降解率＝(1-终了COD/初始COD)*100计算，降解率大于80％的进行保存。
COD测定方法见GB11914-892、复筛先后使用了两种方法，对初筛获得的菌株作进一步筛选与纯化。
方法一与初筛过程基本相同，区别在于用冰箱中保存的菌株代替芳香羧酸堆场的土壤。
方法二取冰箱保存的菌株，从第四步开始与初筛各步骤相同。
二、菌株YPC-TA3的生物学特性YPC-TA3菌株鉴定菌株鉴定依据为《伯杰氏细菌分类手册》(第八版)，鉴定到属。
对菌株进一步鉴定采用16s rRNA基因全序列分析1.16s rRNA基因全序列分析(1)菌体培养与收集干菌片在含1000mg/L的对苯二甲酸基本液体培养基中(以芳香羧酸为碳源)富集活化，涂布相同的固体平板，待菌落长出后，检查菌落的纯度与形态，YPC-TA3菌落小，呈半透明白色；挑取单菌落，接种于LB平板中。
菌株经LB平板活化后，挑取单菌落接种于20mlLB培养液中，28℃恒温振荡(200r/min)培养，在对数生长期离心(4℃，12000rpm，10min)收集菌体。
(2)总DNA的小量提取取1.5ml菌液5000rpm离心4min，去除上清，用1mlTE缓冲液清洗菌体，5000rpm离心4min，去除上清，以270μl TE缓冲液悬浮菌体。加入15μl溶菌酶溶液，于37℃水浴15min。加15μl 10％SDS，混匀。加10μl蛋白酶K，混匀，37℃水浴1h。加200ul 5M保存于4℃的Nacl，剧烈振荡。加500μl酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻振荡均匀，10000rpm离心10min，吸取上清液至新离心管中。加400ulTE缓冲液后，加500ul异丙醇混匀，置于-20℃过夜以充分沉淀DNA。取出后以10000rpm于4℃离心10min，去除上清，用70％于4℃预冷的乙醇洗沉淀3次，风干，溶于50μl TE(PCR反应专用)缓冲液中。
(3)16s rDNA扩增体系的设计用于扩增供试菌株16s rDNA的PCR引物为P1和P6，它们来源于E.coli 16s rRNA基因序列的保守区域。引物P1和P6的序列如下正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′为Ecoli 8-27。
反向引物5′-TACCTTGTTACGACTT-3′，下游序列位于1492-1507碱基位置。
上述引物由上海博亚公司合成。根据该公司产品说明，用无菌重蒸水将引物溶解至终浓度为100μM，于-20℃下保存。
(4)PCR扩增反应依次于0.5ml PCR管中加入ddH2O、扩增缓冲液、dNTP、Taq酶、Mg2+、P1、P6和模板DNA。瞬间离心后置于PCR仪(Biorad icycle)中进行预变性(95℃，10min)，再进行扩增循环。本实验采用的循环条件为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，循环35次，循环结束后72℃延长10min，4℃保存。
(5)PCR产物的检测、回收与纯化取2μl扩增产物与3μl无菌水、1μl上样缓冲液混匀后，在0.75％的琼脂糖凝胶板上进行电泳(5v/cm)。以DNA marker DL2000为标准分子量对照。电泳后经EB染色，于紫外灯下观察，检测扩增片段的长度和浓度，保存扩增成功的样品。
PCR产物的回收纯化采用TaKaRa公司的PCR Fragment Recovery Kit试剂盒。
(6)连接载体采用购自TaKaRa公司的PMD 18-T Vector。构建以下体系pMD 18-T Vector 1ul
Insert DNA 1ulLigation Solution5uldH2O补足到10ul于16℃反应过夜。
(7)培养DH5a感受态细胞接种单菌落至5ml LB试管中，于37℃剧烈振荡培养7h，以1％接种量接种至100ml LB三角瓶中继续培养，随时检测OD值，待OD600为0.35时，迅速将摇瓶冰浴10min，使培养物冷至0℃，4℃于4000rpm离心3min，去除上清，以10ml冰预冷的0.1mol/l CaCl2重悬细胞，冰浴30min，4℃于5000rpm离心3min，去除上清，回收细胞。每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1mol/l CaCl2重悬细胞沉淀，冰浴4h，得到感受态细胞。
(8)转化DNA入感受态细胞用冷却的无菌吸头吸取200ul感受态细胞悬液至无菌2ml离心管，每管加10ul DNA，轻轻混匀，冰浴30min。在预加温至42℃的水浴锅中放置正好90s后，快速转管至冰盒上冰浴1-2min，每管加预热至37℃的LB培养基800ul，在摇床上以低于50rp而速度温育60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。配置如下含相应标记平板每100ml LB中含x-gal(20mg/ml)200ul、IPTG(200mg/ml)12ul、Amp(100mg/ml)100ul。在每块以上平板上涂布200ul已转化的感受态细胞，置于室温直至液体被吸收，倒置于37℃培养，待12-16h后出现菌落。
(9)检测挑取白斑菌落，提取质粒，以HindIII和EcoRI进行双酶切(体系外源DNA 5ul，Buffer1ul，dH2O 3ul，HindIII和EcoRI各lul)，在0.75％的琼脂糖凝胶板上进行电泳(5v/cm)，检测片断大小。
2 16S rRNA基因序列的测定和分析将质粒菌株交由Takara公司测序。所测序列进入GenBank数据库进行相似性分析。
3.基于16s rDNA比较的系统发育图所测序列进入GenBank数据库进行相似性分析，并与GenBank中的已知序列在ClustalX(1.8)程序包中进行多重序列匹配排列(Multiple Alignments)分析，最后形成一个多重序列匹配排列阵，其中形成的缺口用横杠“-”填补，在MEGA2程序包中用Neighbor-Joining法构建系统进化树。
从N-J法建立的系统发育树(图)上可以看出YPC-TA3菌株与Clavibacter xyli位于同一分支内，但16s rDNA相似性仅为50％，具有遗传的特异性，因此该菌应为Clavibacter xyli中的一个新亚种，我们称之为Clavibacter xyli yzsc。
在不同地点取苯甲酸或苯二甲酸堆场上的不同土壤进行该菌株的筛选，结果基本相同。证明本菌株的筛选具有再现性。
三、菌株YPC-TA3对苯二甲酸的降解性能本发明的特效菌对芳香羧酸有良好的降解作用，特别是苯二甲酸，如对苯二甲酸、邻苯二甲酸、间苯二甲酸，本课题组对此作了反复研究1、COD/苯二甲酸降解曲线测定自冰箱保存的斜面各接一环菌苔至50ml培养液II，共四瓶，室温180rpm摇床培养24小时，混合后4000rpm离心15min，将所得菌泥平均分配至9瓶模拟废水(50ml)中，使初始吸光度(660nm)在0.4～0.6之间，室温180rpm摇床培养，每4-6小时，取少量菌悬液，4000rpm离心15min，取上清液测定COD及对苯二甲酸，直至COD降到300mg/l(对苯二甲酸在50mg/l左右)以下，做出COD及对苯二甲酸与时间的关系曲线，即为COD、对苯二甲酸降解曲线。
在对苯二甲酸浓度为3550mg/L的模拟废水中，按0.5g/L的接种量接入活化的特效菌。在室温下培养，定时测定对苯二甲酸降解率及菌体浓度，特效菌的对苯二甲酸降解曲线如图1。
特效菌的COD降解曲线如图2COD降解至0后有上升现象，而对苯二甲酸降解则无此现象，这可能是由于对苯二甲酸碳源被利用完后的菌体破碎所致。
2、菌株的COD/对苯二甲酸耐受性方法基本同降解曲线，但改变了模拟废水中的初始对苯二甲酸浓度，测试不同浓度下对苯二甲酸、COD的降解情况。
1)不同初始COD的降解情况时间(小时) COD(mg/L)0641413.5 23003639 220442)不同初始对苯二甲酸的降解情况时间(小时) 对苯二甲酸(mg/L)
0355010 25031922.5 600由表可知1)初始对苯二甲酸与降解时间有相关性，初始对苯二甲酸高，降解时间长，反之亦然。
2)随着初始对苯二甲酸升高后，细菌的降解速度及去除率有所下降。
3)在初筛过程中，曾试验过高于7000mg/L对苯二甲酸模拟废水，菌株亦可承受，经96小时降解后，对苯二甲酸为140mg/L。
3、不同pH值对对苯二甲酸降解菌的降解能力影响选择的pH范围为5.5、6、7、8、9、10、10.5，在相同的36小时培养时间、相同生物量、35℃温度和150rpm震荡速率时进行试验。开始的对苯二甲酸浓度一致，最后测溶液中对苯二甲酸、TOC的浓度和pH值。
对苯二甲酸降解菌对pH有较宽的适应范围，pH在5.5-9的范围内，都有很好的降解能力。pH5.5-8是对苯二甲酸降解菌的最适范围。在低pH时，对苯二甲酸降解过程中，降解菌能提高培养液的对处理pH值，当初始的培养液pH为5.5时，通过微生物处理以后，最终的pH达到9.5，因此，对于正常的废水处理中，没有必要使进水的pH调到中性。而且可使用出水对进水PH进行调节，减少进水PH调节的物质损耗。
4、不同生物量对对苯二甲酸降解菌降解能力的影响方法基本同COD、对苯二甲酸降解曲线，但在将菌泥分配给模拟废水时，形成菌液的初始浓度梯度，观察不同投加量下降解曲线的变化。大量培养对苯二甲酸菌，分别测定培养液中微生物的数量和生物量，然后以一倍，二倍和三倍的生物量加入到培养液中，36小时后观察培养液中对苯二甲酸、TOC浓度和pH值。
YPC-TA3菌株在营养肉汤中培养后，生物量为1.070g/L。取不同的生物量加入的30ml的对苯二甲酸液体中，进行培养。
不同生物量对相同浓度的对苯二甲酸废水产生不同的影响，加入的对苯二甲酸降解菌的数量多，在单位时间内对对苯二甲酸的降解效率高，对TOC降低也有同样的结果。但是，不同生物量对处理后最终出水的pH影响不大，都维持在9.0左右。
5、不同温度对对苯二甲酸降解菌降解能力的影响选择的温度为25、30、35、39℃，在相同的36小时时间、生物量、pH7和震荡速率时进行试验。开始的对苯二甲酸浓度一致。
不同温度对对苯二甲酸降解菌的影响比较大，在25-35℃时都能生长，并随温度升高，对苯二甲酸的去除率提高，对TOC也时同样的结果。在25℃，对苯二甲酸的去除率比TOC的去除率要高。
6、不同振荡速率对对苯二甲酸降解菌降解能力的影响选择0、50、100、150r/Min的振荡速率，在相同的对苯二甲酸浓度，在相同的生物量、pH7时，36小时后观察最后溶液中对苯二甲酸、TOC的浓度和pH值。
不同振荡速率对对苯二甲酸降解菌的处理效果影响较大，提高振荡速率，增加液体的供氧量，使对苯二甲酸的处理效率提高。由于对苯二甲酸降解菌是严格的好氧菌，如果在厌氧状态下，对对苯二甲酸不起降解作用。在相同条件下，最后处理后的培养液中pH都在8.9左右。因此，可以从pH的变化反映对苯二甲酸处理的效果。
以上方法不限于对苯二甲酸，本课题组还试验了间苯二甲酸、邻二苯甲酸、苯甲酸，本发明的特效菌对他们都有良好的降解作用。
7、保存方法依据简单可靠的原则，我们先后试验了两种方法。
1)液体石蜡保存法将保存培养基做斜面，菌株划线培养24小时，注入已灭菌的液体石蜡，保持液面高于斜面上端1cm，置于冰箱4℃保存。
2)Stamp保存法取富集菌体0.5ml，将等体积已灭菌的A、B液混合，然后将混合液与菌体混合成菌悬液，按1∶100加入C液，用灭菌注射器滴加在聚乙烯膜上，置无菌工作台上吹淋48小时，胶带封口，置冰箱4℃保存。
发明创造的效果芳香羧酸是较难降解的化合物，本发明的特效菌YPC-TA3对芳香羧酸有较强的降解能力，在对苯二甲酸浓度为3550mg/L、pH为7的模拟废水中，按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下摇瓶培养，经过20-25小时，对苯二甲酸浓度降为0mg/L，降解时间短、降解效率高。
四
图1 YPC-TA3对对苯二甲酸的降解曲线图2 YPC-TA3对COD的降解曲线本发明的微生物保藏保藏日2004年8月3日，保藏编号No.1201，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址北京海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所。
五具体实施例方式
实施例1菌种采集筛选取对苯二甲酸堆场上某处土壤约1g，置于含50ml富集培养液I的锥形瓶中，室温摇床培养24小时，培养温度25℃；pH为7。
第二步 将第一步获得的菌悬液稀释至10-5～10-6，在筛选培养基上涂布，培养48小时，进行驯化。
第三步 配制摸拟废水，测其COD，记为初始COD。
第四步 从第二步所制筛选培养基上生长的菌落中挑出18个，移入18瓶各含50ml富集培养液II的锥形瓶中，室温摇床培养24小时。
第五步 将第四步获得的菌悬液各取10ml，离心12min，弃上清液，将沉淀物移入模拟废水中，在660nm波长处测定其吸光度，确定其菌体浓度。培养48小时，离心12min，取上清液做COD，记为终了COD。
降解率大于80％的进行保存。
配制培养基，琼脂4g，Na2HPO40.1g，(NH4)2SO40.2g，对苯二甲酸0.8克，加蒸馏水至100ml。倒入培养皿制成固体培养基，涂布培养24小时(培养温度30℃)，即可出现白色菌落。
配制模拟废水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，对苯二甲酸浓度为3550mg/L，用Na2CO3调节pH为5.5，加蒸馏水至100ml。高温灭菌，按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下摇瓶培养，经过20-25小时，对苯二甲酸浓度降为0mg/L。
利用该菌种处理对苯二甲酸化工废水的方法，是将上述处理模拟废水的方法简单放大对苯二甲酸石油化工工业废水，对苯二甲酸浓度为3550mg/L，加入营养盐Na2HPO40.05g/L，(NH4)2SO40.1g/L。用Na2CO3调节pH为5.5，加水一倍，高温灭菌。按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下利用风机曝气加氧培养，经过20-25小时，对苯二甲酸浓度降为0mg/L。
实施例2菌种采集筛选步骤及处理化工废水的方法同实施例1，区别在于用苯甲酸替代对苯二甲酸。培养温度25℃；pH为5.5。
实施例3菌种采集筛选步骤及处理化工废水的方法同实施例1，区别在于培养温度35℃；pH为9；配制模拟废水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.lg，对苯二甲酸浓度为7000mg/L，用Na2CO3调节pH为9，加蒸馏水至100ml。高温灭菌，按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下摇瓶培养，经96小时降解后，对苯二甲酸为130mg/L。
实施例4菌种采集筛选步骤及处理化工废水的方法同实施例1，区别在于培养温度30℃；pH为8；配制模拟废水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，间苯二甲酸浓度为4020mg/L，用Na2CO3调节pH为7的，加蒸馏水至100ml。高温灭菌，按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下摇瓶培养，经96小时降解后，间苯二甲酸为23mg/L。
实施例5菌种采集筛选步骤及处理化工废水的方法同实施例1，区别在于配制模拟废水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，邻苯二甲酸浓度为3850mg/L，用Na2CO3调节pH为7的，加蒸馏水至100ml。高温灭菌，按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下摇瓶培养，经96小时降解后，邻苯二甲酸为20mg/L。
实施例6菌种采集筛选步骤及处理化工废水的方法同实施例1，区别在于配制模拟废水，Na2HPO40.05g，(NH4)2SO40.1g，苯甲酸浓度为4010mg/L，用Na2CO3调节pH为7的，加蒸馏水至100ml。高温灭菌，按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下摇瓶培养，经96小时降解后，苯甲酸为26mg/L。
权利要求
1.一种降解废水中芳香羧酸，特别是降解对苯二甲酸的特效菌株，其特征在于所述菌株为YPC-TA3，Clavibacter xyliyzsc，保藏在CGMCC，保藏编号No.1201，保藏日期2004年8月3日。
2.按权利要求1所述的特效菌株YPC-TA3，其特征在于从含芳香羧酸的堆场中分离得到；该菌株适宜在温度25～35℃，PH值5.5～9条件下培养；以芳香羧酸为碳源。
3.按权利要求1或2所述的特效菌株YPC-TA3，其特征在于从含二羧酸的堆场中分离得到；该菌株适宜在温度35℃，PH值5.5～8条件下培养；以芳香二羧酸为碳源。
4.一种利用利用权利要求1所述特效菌YPC-TA3降解含芳香羧酸废水的方法，步骤如下加入营养盐Na2HPO4，(NH4)2SO4，调节pH为5.5～9，加水一倍，高温灭菌，按0.5g/L的接种量接入活化的高效降解菌，室温下曝气加氧培养，经过20～25小时，即可。
5.按照权利要求4所述的特效菌YPC-TA3降解含芳香羧酸废水的方法，其特征在于所述所述芳香羧酸至少包括苯二甲酸。
6.按照权利要求4所述的特效菌YPC-TA3降解含芳香羧酸废水的方法，其特征在于所述芳香羧酸至少包括对苯二甲酸。
全文摘要
本发明属于处理废水中芳香羧酸的微生物菌株发明及利用该菌株处理废水的用途发明，本发明包括筛选纯化降解芳香羧酸的特效菌YPC－TA3，以芳香羧酸为碳源的培养基筛选获得，为好氧菌，该菌株可降解废水中芳香羧酸，特别是苯二甲酸。本发明的特效菌降解时间短，降解效率高。
文档编号C02F3/34GK1605625SQ20041004180
公开日2005年4月13日 申请日期2004年8月27日 优先权日2004年8月27日
发明者陈俊, 郑国洋, 黄勇, 朱建忠, 章晓春, 王桂林, 周立进, 王洪丽, 陆建华, 罗翔, 喻敬周 申请人:扬子石油化工股份有限公司