专利名称：治理油污土壤的方法及其专用菌群的制作方法
技术领域：
本发明涉及土壤污染治理方法及其专用菌群，特别是涉及治理低温、风化原油油污土壤的方法及其专用菌群。
背景技术：
土壤是生态环境的重要组成部分，也是物质生物地球化学循环的储存库。但近年来，土壤污染现象日益严重，土壤环境质量日益恶化，同时，被污染的土壤通过对地表水和地下水形成二次污染和经土壤-植物系统由食物链进入人体，直接危及人体健康。因此土壤生态环境的保护与治理已引起人们的普遍关注。土壤污染治理技术研究开发已成为当前国内外环保研究的热点，在这些研究中，以油污土壤的治理技术研究最为广泛。
目前，油污土壤的治理方法主要有物理修复法、化学修复法、微生物修复法和自然净化技术等。这些方法各有优缺点，适于不同情况的油污土壤治理，但综合来看，目前以微生物修复法的应用和研究最为广泛，这归因于微生物修复技术的主要优点(1)费用低。约为焚烧处理的1/2～1/3。(2)处理效果好。经过生化处理后，污染物残留量可达到很低水平。(3)对环境影响小，无二次污染。(4)可以就地处理，节约处理费用。(5)不破坏植物生长所需要的土壤环境。
生物修复处理系统主要包括原位生物修复技术(in-situ biological remediation)和异位生物修复技术(ex-situ biological remediation)。原位生物修复是向污染区域投放N、P等营养物质或供氧，促进土壤中依靠有机物作为碳源的微生物生长繁殖，或接种经驯化培养的高效微生物等，利用其代谢作用达到消耗石油烃的目的。该技术适合于遭受大面积污染的土壤，成本较低，主要包括投菌法(Sanjeet Misshra，Jeevan Jyct.In situ bioremediation potential of an oily sludge degrading bacterialconsortium.J.Current Microbiology，2001，43(5)328-335)、生物培养法(李晔，陈新才，王焰新.石油污染土壤生物修复的最佳生态条件研究。环境科学与技术，2004，27(4)17-19)、生物通气法(段云霞，隋红，韩振为，李鑫钢。生物通风修复石油污染土壤的研究进展。环境保护科学，29(120)25-28)、农耕法(张甲耀.生物修复技术研究进展。应用与环境生物学报。1996，2(2)193，199)等。
异位生物修复技术则要求把污染的土壤挖出，集中起来进行生物降解。可以设计和安装各种过程控制器或生物反应器以产生生物降解的理想条件，该技术适于小范围的污染严重的土壤，主要包括预制床法、土壤堆肥法和生物泥浆法(生物反应器法)等。
生物修复技术由于利用了微生物的作用，因此能够影响到微生物活性的所有环境因素以及微生物本身的特性等都是生物修复技术的影响因素。微生物在降解油污土壤的过程中，主要受到微生物本身特性、土壤pH值、温度、湿度、供氧、营养物以及油污染强度及种类、表面活性剂等诸多条件的影响。要提高生物修复技术的效率和效果，需要选择合适的微生物菌种，并选择合适的控制条件来提高微生物的降解效率。
国内外的研究多以轻质原油和汽油、柴油等成品油为主要处理对象，这些油品在实验室研究中即使只采用翻耕、加营养物而不加菌的情况下去除速率也相对较高。如轻质原油84d的去除速率在0.3014～0.3746g/kg.d；汽油80d的去除速率为0.2769g/kg.d，汽油49d的去除速率为0.1253g/kg.d。而原油、重质原油的处理效果相对较低，在上述条件下重质原油364d的去除速率为0.0203～0.0346g/kg.d。在此实验条件基础上加菌处理的原油36d的处理速率仅为0.0327g/kg.d。针对风化原油油污土壤治理技术未见报道。
目前，生物修复一般在高温季节进行，所用微生物菌种适宜在20℃～40℃的温度条件下降解烃污染物。而针对性地筛选适于较低温度条件下(10℃～20℃)的烃降解菌，以用于低温地区或低温季节油污土壤的处理尚未见报道。
虽然目前对于生物修复油污土壤的技术研究颇多，但是，这些研究或者只限于菌种单因素影响或菌种间的协同影响，或者是只针对某一种环境因素如营养物的影响，而对微生物、营养物等多种因素影响进行协同优化的研究未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一组能有效降解土壤油污的微生物降解菌群。
本发明所提供的降解菌群由五株菌组成，分别是黄单胞菌(Xanthomonas sp.)dnl、黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dy1和无色菌(Achromobacter sp.)dy3，这些菌株已于2005年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号分别为CGMCC № 1299、CGMCC № 1298、CGMCC № 1297、CGMCC №1296、CGMCC № 1295。
黄单胞菌(Xanthomonas sp.)dn1为短杆菌，长约4μm，直径约Φ1μm；其菌落呈浅黄色，中心深黄，半透明，凸起，平滑，粘稠，直径Φ2.5mm。
黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2为短杆菌，长2μm，直径约Φ0.7μm；其菌落呈浅绿色，凸起，平滑，粘稠，直径Φ2mm。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2为短杆菌，长3μm，直径约Φ1μm；其菌落呈乳白色，凸起，平滑，粘稠，直径Φ4mm。
假单胞菌(Pseudomonas sp.)dy1为杆菌，长5μm，直径约Φ1.2μm；其菌落呈白色并略显粉红色，凸起，平滑，粘稠，直径Φ3mm。
无色菌(Achromobacter sp.)dy3为杆菌，长5μm，直径约Φ0.7μm；其菌落透明，平铺，平滑，粘稠，直径Φ4mm。
本发明的另一个目的是提供一种高效、快速的治理油污土壤的方法。
本发明所提供的治理油污土壤的方法，是在油污土壤中加入本发明的降解菌群来降解油污。
为了使各种菌能更好地发挥协同作用，所述降解菌群中黄单胞菌(Xanthomonassp.)dn1 CGMCC № 1299黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2CGMCC № 1298假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2 CGMCC № 1297假单胞菌(Pseudomonas sp.)dy1CGMCC № 1296无色菌(Achromobacter sp.)dy3 CGMCC № 1295的细胞数之比为3∶3-4∶3-4∶3-4∶3-4。
在土壤修复处理过程中，为了持续保持土壤中含有一定量的投加的五种降解菌，可将所述五种降解菌吸附在多孔载体上，其中，常用的载体为活性炭。
在本发明中，降解菌群的加入量一般为3×108-7×109个细菌/g油污土壤，即可以达到较高的油污去除效果。
为了促进所加入的菌株在土壤中生长，提高处理效率和速度，在所述油污土壤中还加有CO(NH2)2和(NH4)2HPO4，使所述油污土壤中可降解C∶有效N∶有效P的重量比为100∶7-13∶1-1.5。其中，为减少营养物的损失，提高营养物的利用水平，CO(NH2)2还可选用包衣尿素。另外，考虑到实际处理时营养物的流失，以及低温等因素对微生物吸收营养的影响，可适当扩大营养物投加量为计算投加量的2至3倍。
同样，为了促进所加入的菌株在土壤中生长，提高处理效率，在所述油污土壤中还加有0.08-0.1ml维生素溶液/g油，所述维生素溶液包含有下述物质生物素1-3mg，叶酸1-3mg，烟酸4-6mg，泛酸钙4-6mg，对氨基苯甲酸4-6mg，硫辛酸4-6mg，维生素B68-12mg，维生素B24-6mg，维生素B14-6mg，维生素B120.1-0.2mg，加水到1L。
本发明从大庆油田废弃井场的油污土壤中筛选到一组降解菌群，该降解菌群适于较低温度(10℃～20℃)条件下发挥降解作用；本发明治理油污土壤的方法，是应用所筛选得到的降解菌群对油污降解的协同作用，并可在土壤中加入营养物来促进细菌的生长，具有如下优点1、适用于风化原油的油污土壤的治理，对其它成品油及轻质原油等其它类型原油造成的油污土壤的治理效果更好。
2、适用于低温地区或低温季节条件下(10℃～20℃)进行油污土壤的生物修复。
3、通过菌种、营养物的协同优化，使本发明具有较高的处理效率。在低温地区处理风化原油类型的油污土壤，油去除速率均大于0.036g/kg.d，高于现有方法(油去除速率一般在0.0203～0.0346g/kg.d)。
4、本发明菌株培养条件温和，培养方法简单，易于进行大规模培养，以之处理油污土壤时工艺简单适用，可广泛应用于油田、原油炼制企业等地区油污土壤的治理。
图1为实施例2不同实验组土壤含油量随时间的变化图；图2为实施例2不同实验组油去除率的时间变化图；图3为实施例2不同实验组油去除速率的时间变化图；图4为实施例2细菌总量随时间的变化图；图5为实施例2常规处理条件下五种烃细菌种群随时间的变化图；图6为实施例2用缓释营养物处理条件下五种烃细菌种群随时间的变化图；图7为实施例2速效氮随时间变化图；图8为实施例2速效磷随时间变化图；图9为实施例2土壤含水量变化图；图10为实施例2温度变化图。
具体实施例方式
实施例1、降解菌群的筛选取大庆油田春雷泵站井场和南岗泡井场的油污土壤进行分析，其土壤理化性质如表1所示。
在大庆油田春雷泵站附近废弃井场和南岗泡附近废弃井场的井口周围15m内，分东西南北四个方位分别采取同样量的5～20cm的地表土壤，剔除根、叶及石头后混匀，于无菌样品袋中密封保存。土壤样品在0～4℃低温下保存，按表2对土壤中的微生物进行检测、筛选(杜连祥.工业微生物学实验技术.天津科学技术出版社.1992，93-100)。
表1.供试土壤理化特性分析
表2.微生物指标及检测方法
所采集到的两个地区的土壤样品细菌总数、烃降解菌数及其占细菌总数比例见表3所示。
表3.土壤样品微生物量
在采集含菌样品后，还得进行富集培养(Enrichment Culture)，然后才能进行纯种分离。将所取得的自然菌种样品，用表4的驯化筛选培养基进行富集驯化，然后进行纯种分离。
土壤中各种微生物混杂地生活在一起，要获得某种特殊性能的微生物，必须首先进行纯种分离。可利用常规的平板分离细菌纯种技术进行，所用的纯种分离培养基为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，水1000m L，pH 7.0。
经过上述筛选、富集培养以及纯种分离等步骤，从大庆油田春雷泵站附近废弃井场和南岗泡附近废弃井场的油污土壤中得到黄单胞菌(Xanthomonas sp.)dn1、黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dy1和无色菌(Achromobacter sp.)dy3五株菌。可采用常规细菌培养方法培养上述五种降解菌，培养温度为35～38℃，培养基可为牛肉膏3g/L，
实施例2、大庆油田油污土壤的生物治理一、实验设施及材料1、实验材料筛选分离并通过优化获得的黄单胞菌(Xanthomonas sp.)dn1、黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2、假单胞菌(Pseudomonassp.)dy1和无色菌(Achromobacter sp.)dy3五株原油降解菌。
将上述五株菌在培养基中在35-38℃下培养2天，得到其菌液，菌液中菌体细胞数分别为9.8×1010个细菌/mL菌液、9.7×1010个细菌/mL菌液、9.5×1010个细菌/mL菌液、9.5×1010个细菌/mL菌液、9.7×1010个细菌/mL菌液，所用的培养基为牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，水1000mL，pH 7.0～7.2。
载体柱状活性炭载体。
营养物所用的营养物为尿素、(NH4)2HPO4，和维生素溶液；维生素溶液的配方如表5，加蒸镏水到1L；尿素有两种，一种是普通的尿素，另一种采用缓释的包衣尿素，其缓释期为150天。
表5.维生素溶液组成
实验土壤选择大庆油田南岗泡附近的经5年以上风化的油污土壤区域作为场址，建设规模为大庆市南岗泡附近的油污土壤区域约28m2范围，油污土壤有效处理面积为5m2。实验对象为土壤表层30cm。底部防渗，同时采取防雨、防径流冲刷、防动物破坏等措施。油污土壤处理场分3个区，具体分区规划如表6，每个分区投加营养物、菌液、维生素等情况如表7。在表7中，考虑到现场处理过程中营养物的流失，以及低温条件对微生物营养代谢的影响，常规处理组(Y1)氮营养物采用计算量2倍的量投加，缓释处理组(Y2)氮营养物采用计算量3倍的量投加，各处理组(Y1、Y2)磷营养物采用计算量3倍的量投加。
表6.处理实验分组
注“+”表示投加，“-”表示未投加表7.各处理组各种物质投加量
注1表示尿素分两次均匀投加；2表示投加缓样尿素；二、处理步骤按照表7的用量，将所培养得到的菌液与载体浸泡2天，使载体吸附细菌。然后，进行油污土壤的翻耕处理，向其中喷洒吸附有细菌的载体，营养物以及维生素溶液，然后将土壤混匀处理。在实验过程中，采用人工翻耕、人工管理方式，每3天洒水保湿，并取样检测。
三、土壤检测指标以及检测频率处理过程中各个分区的检测内容及检测方法分别如表8、表9所示，菌体的测定方法如表2，土样的检测频率为半个月。
表8.各分组检测分析项目
注“+”表示采样检测，“-”表示不采样检测；标注a表示试验周期前后各测1次。
表9实验测试方法
1城乡建设环境保护部环境保护局.环境监测分析方法.中国环境科学出版社，1983328-332；2史瑞和.土壤农化分析.农业出版社，198655-76；3中华人民共和国石油天然气行业标准SY/T5119-1995《原油族组分柱层析分析方法》；4劳家圣.土壤农化分析手册.农业出版社，1988126-130。
四、实验结果本试验过程共进行了94d，其间主要检测了各实验组的处理效果，细菌总量的变化，各种高效菌种群的变化以及营养物的变化等。土壤初始pH值为7.7左右，经过94天的处理，各处理组pH下降至7.5左右。处理过程中，速效氮随时间变化如图7，由图可见，常规处理试验(Y1)和缓释处理试验(Y2)速效氮供应充足，随着时间变化，常规处理试验(Y1)速效氮含量逐渐减小(处理64d因二次投加氮源而增高)，而缓释处理试验(Y2)速效氮含量波动不大。速效磷随时间变化如图8，由图可见，常规处理试验(Y1)和缓释处理试验(Y2)速效磷供应充足。随着处理时间变化，速效磷含量逐渐减小。土壤含水量变化如图9，各处理组土壤饱和含水量约为28％，处理过程中，各处理组含水量基本为饱和含水量的50％左右，水分供应充足。在整个处理过程中，温度变化见图10。
处理过程中，不同实验组土壤含油量随时间的变化如图1；不同实验组油去除率的时间变化如图2；不同实验组油去除速率的时间变化如图3；细菌总量随时间的变化如图4；五种烃细菌生长量随时间的变化如图5、图6。
从图1可见常规处理组(Y1)和缓释营养处理组(Y2)，其含油率从初始的11.87g/kg土壤和11.33g/kg土壤，分别降低到7.29g/kg土壤和7.82g/kg土壤，具有很明显的处理效果。
从图2可见在整个实验过程中，常规处理试验组(Y1)和缓释处理试验组(Y2)最终去除率分别达到了38.58％和30.98％，不处理翻耕组(YCK1)去除率达到24.5％，说明仅翻耕供氧也一定程度地促进油的去除。
从图3可见微生物对油的去除速率在15d后基本趋于稳定，说明易生物降解石油污染物在初期处理阶段(30d左右)被大量去除。常规处理试验(Y1)初期的去除速率较大，达到了0.60g/kg.d。
本现场油污土壤处理在寒冷地区进行，处理难降解的风化的原油，初始油含量为1.1％，处理94天，常规处理原油去除速率达到0.048g/kg.d以上，缓释处理原油去除速率达到0.036g/kg.d以上。
从图4可见各处理组实验过程中其细菌总量都是先增长，然后慢慢降低。这是由于在开始阶段，微生物可以利用土壤中的石油烃作为碳源，进行新陈代谢和增殖，但是随着时间的延长，微生物易于利用的饱和烃等物质含量越来越低，微生物的活性受到了限制。另外，温度在细菌的生物量变化过程中也起到重要的影响作用(温度变化见图10)，处理到63d后，因气温下降到5℃以下，而导致细菌生物量明显降低。
从图5可见常规处理组(Y1)中，各菌种在不同的处理时间范围生长繁殖，这是由于处理温度变化(温度变化见图10)引起的。由此说明，在土壤中其它微生物竞争作用的影响下dn1菌受投菌的影响初始菌量较大，而后急剧下降，但至处理63d菌量出现高值，说明其更适于在现场温度10℃～15℃条件下降解烃污染物。
dn2菌种适于在现场温度10℃～20℃条件下降解烃污染物。
dc2菌和dy1菌适应较广温度范围，在现场温度10℃～25℃的条件下降解烃污染物。
dy3菌种适于在现场温度15℃～20℃的条件下降解烃污染物。
从投菌处理后各菌种的反应强度来看，dy1菌作用最为持久，反应最为强烈，其它各种菌反应强度稍弱并基本一致，说明各种菌对烃污染物的降解能力除dy1稍大外基本相同。
从图6可见缓释处理组(Y2)中，各菌种在不同的处理时间范围生长繁殖，这是由于处理温度变化(温度变化见图10)引起的。由此说明，在土壤中其它微生物竞争作用的影响下dn1更适于在现场温度10℃～15℃条件下降解烃污染物。
dn2菌种更适于在现场温度15℃～20℃条件下降解烃污染物。
dc2菌和dy1菌适应较广温度范围，在现场温度10℃～25℃的条件下降解烃污染物。
dy3菌种更适于在现场温度15℃～20℃的条件下降解烃污染物。
从投菌处理后各菌种的反应强度来看，dy1菌最为强烈，其它各种菌反应强度稍弱并基本一致，说明各种菌对烃污染物的降解能力除dy1稍大外基本相同，与常规处理组的规律相同。
以上结果表明，本发明的降解菌群在低温地区(10-20℃)处理风化原油类型的油污土壤，油污去除效果良好，去除率高达38％，油去除速率最高能到0.60g/kg.d，均大于0.036g/kg.d，高于现有方法(油去除速率一般在0.0203～0.0346g/kg.d)。
权利要求
1.一组降解菌群，由黄单胞菌(Xanthomonas sp.)dn1 CGMCC № 1299、黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2 CGMCC № 1298、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2 CGMCC№ 1297、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dy1 CGMCC № 1296、和无色菌(Achromobactersp.)dy3 CGMCC № 1295组成。
2.一种治理油污土壤的方法，是在油污土壤中加入权利要求1所述的降解菌群来降解油污。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述降解菌群中黄单胞菌(Xanthomonas sp.)dn1 CGMCC№1299黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2 CGMCC№1298假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2 CGMCC№1297假单胞菌(Pseudomonassp.)dy1 CGMCC № 1296无色菌(Achromobacter sp.)dy3 CGMCC№1295的细胞数之比为3∶3-4∶3-4∶3-4∶3-4。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述降解菌群吸附在多孔载体上。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述多孔载体为活性炭。
6.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述降解菌群的加入量为3×108-7×109个细菌/g油污土壤。
7.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于在所述油污土壤中还加有CO(NH2)2和(NH4)2HPO4，使所述油污土壤中可降解C∶有效N∶有效P的重量比为100∶7-13∶1-1.5。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述CO(NH2)2为包衣尿素。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述油污土壤中还加有0.08-0.1ml维生素溶液/g油，所述维生素溶液包含有下述物质生物素1-3mg，叶酸1-3mg，烟酸4-6mg，泛酸钙4-6mg，对氨基苯甲酸4-6mg，硫辛酸4-6mg，维生素B68-12mg，维生素B24-6mg，维生素B14-6mg，维生素B120.1-0.2mg，加水到1L。
10.根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于在所述油污土壤中还加有0.08-0.1ml维生素溶液/g油，所述维生素溶液包含有下述物质生物素1-3mg，叶酸1-3mg，烟酸4-6mg，泛酸钙4-6mg，对氨基苯甲酸4-6mg，硫辛酸4-6mg，维生素B68-12mg，维生素B24-6mg，维生素B14-6mg，维生素B120.1-0.2mg，加水到1L。
全文摘要
本发明公开了治理油污土壤的方法及其专用菌群。本发明所提供的菌群，由黄单胞菌(Xanthomonas sp.)dn1 CGMCC № 1299、黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2 CGMCC № 1298、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dc2 CGMCC № 1297、假单胞菌(Pseudomonas sp.)dy1 CGMCC № 1296、和无色菌(Achromobacter sp.)dy3 CGMCC № 1295组成。本发明治理油污土壤的方法，就是在油污土壤中加入上述降解微生物的菌群来降解油污。本发明从大庆油田废弃井场的油污土壤中筛选到一组降解菌群，该降解菌群适于较低温度(10℃～20℃)作用；本发明治理油污土壤的方法，是应用所筛选得到的降解菌群对油污降解的协同作用，并可在土壤中加入营养物来促进细菌的生长。本发明适用于风化原油的油污土壤的治理，对其它成品油及轻质原油等其它类型原油造成的油污土壤的治理效果更好。
文档编号B09C1/10GK1718721SQ20051006834
公开日2006年1月11日 申请日期2005年5月8日 优先权日2005年1月26日
发明者李广贺, 金文标, 张旭, 钟毅 申请人:清华大学