一种以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法

专利名称：：一种以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法
技术领域：
：本发明涉及利用菌群方式处理废水的方法，尤其涉及一种以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，并获得两步处理机制的工艺路线。
背景技术：
：目前全世界的用纸需求量呈现急剧的上升趋势，在发达国家，由于纸衆原料主要为木材，使得大量的森林和木材逐渐减少。木材原料资源的缺乏使得草浆造纸在发展中国家十分广泛，来源于碱法制浆工艺的草浆造纸具有纸张质量好、原料便宜丰富等优点。但众所周知，草浆造纸最大的弊端是由于污染负荷高而对环境的严重污染。不同于木浆废水，草浆造纸废水具有含硅量高、含多聚糖高的特点，从而使得该废水的粘度要高出木浆很多，因此对于木浆废水适用的碱回收的方法对处理草浆造纸废水具有回收率低、成本高等特点，尤其对于我国众多规模较小的造纸厂更不适用。酸析木质素也是一种比较好的处理废水的方法，但需要消耗大量的无机酸使木质素沉淀下来，同时还存在无机酸根离子的二次污染。微生物处理环境污染物因其具有成本低、二次污染小等优点在造纸废水处理上也有一些报道。在造纸废水处理上，白腐菌由于具有较强的木质素降解能力而受到了广泛关注。但白腐菌用于废水处理时，废水处理必须在较低的pH和C0D值下才能进行，因此大量的稀释导致该菌的实际应用受到了很大阻碍。一些细菌也被发现具有处理废水的能力，但也存在不能耐受强碱和高COD的环境而需要预处理的问题。同样的，在利用菌群来处理造纸废水的应用中，虽然活性污泥和氧化塘在造纸废水的二次处理上具有发挥了比较好的作用，但也不能对造纸废水进行直接的处理。也曾有一些专利提出采用产酸菌群处理造纸废水，但对于具体处理效果(如废水最重要的指标之一COD)、菌群特性及菌群构建过程及处理机理未给出明确描述。总之，上述报道和专利在利用菌群处理造纸废水时并没有对微生物处理工艺条件及处理机制进行详细阐述和研究，因此存在处理过程不清楚、难以重复和控制等缺点，从而使得这些工艺的实际开发和应用具有一定的不可控制性和盲目性。
发明内容针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法。本发明所述人工菌群不仅具有直接处理造纸废水的能力，并且还能够使废水的pH由强碱性降低至中性，色度和C0D也有一定的去除。作为一种初级处理方法，本发明对造纸废水后续的处理提供了有利的条件，增强了回收效率，降低了成本并减少了二次污染。本发明所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于选取已于2008年10月29日保藏于"中国典型培养物保藏中心(CCTCC)"的盐单胞菌(VaA^朋as)sp.Y2CCTCCNO:M208188，盐单胞菌(泡乃卿朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192，盐单胞菌(泡Joffl朋as)sp.19-ACCTCCNO:M208186，盐单胞菌(泡Jo層"as)sp.19-DCCTCCNO:M208193菌株与芽孢杆菌(^jcj7J"s)sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌(泡"7仂s)sp.Y5CCTCCNO:M208190，芽孢杆菌(泡"7k)sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(fecW扁sp.17-3CCTCCNO:M208184，芽孢杆菌(fe"77"s)sp.17-4CCTCCNO:M208185，芽孢杆菌(few7k)sp.19-BCCTCCNO:M208187，芽孢杆菌(&cj7^/s)sp.Y6CCTCCNO:M208191菌株中的两种或两种以上的菌株分别无菌培养至OD區m达到10以上，然后以体积比计按泡7o77o朋5"sp.Y2:few77^sp.Y4泡"7ksp.Y5:S脂7ksp.17-1:肠j77i/ssp.17_3:feci7ksp.17_4:〃a7(9啦朋s1sp.17-5:他2coto朋ssp.19_A:5a"'i7t/ssp.19-BAk/owcwassp.19_D:few'"〃ssp.Y6为1—4:1—4:o—i:o-i:1—2:0—1:1—2:1—2:0-1:0—1:1—2的比例将菌液混合，构建人工菌群；将构建的人工菌群以体积比计按照15%30%的接种量接入pH为911,COD为1，000140，000mgr1的造纸废水中，在3538。C条件下静止处理造纸废水，期间间歇搅拌，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和COD指标，当造纸废水pH降至7.08.8之间，处理结束。进一步的，本发明所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法的具体操作步骤为选取盐单胞菌(泡7o膨朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188，盐单胞菌(泡J卿o朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192，盐单胞菌(泡7o鹏朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186和盐单胞菌(泡7o膨/as)sp.19-DCCTCCNO:M208193菌群中的两种或两种以上的菌株分别进行如下操作(1)斜面培养将上述^^0/^/^s菌株接种于含有质量百分比为1.52.0%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，30土rC培养菌体1524小时；(2)—级种子培养将步骤(1)培养的菌体，无菌条件下用接种环接14环于100ml完全液体培养基中，30土rC条件下在120200转/分摇床上振荡培养1524小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5%8%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，30±1'C条件下在120200转/分摇床上振荡培养1524小时至0062^达到1012之间，制得二级种子；(4)收集泡Amo朋s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤34次；之后用生理盐水重新配成0D^达到1012之间的菌悬液，备用；同时，选取芽孢杆菌(fe"'LiAS)sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌(万ac"7"s)sp.Y5CCTCCNO:M208190，芽孢杆菌(泡"'77〃s)sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(fe"7J"s)sp.17-3CCTCCNO:M208184，芽孢杆菌(fe"7扁sp.17-4CCTCCNO:M208185，芽孢杆菌sp.19-BCCTCCNO:M208187，芽孢杆菌(細7k)sp.Y6CCTCCNO:M208191菌群中的两种或两种以上的菌株分别进行如下操作(5)斜面培养将上述5aw7A/s菌株接种于含有质量百分比为1.52.0%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37士rC培养菌体1524小时；(6)—级种子培养将步骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，37土rC条件下在100150转/分摇床上振荡培养1524小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%8%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37±1°。条件下在100150转/分摇床上振荡培养1524小时至0D咖，达到1012之间，制得二级种子；(8)收集泡"77"s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤34次；之后用生理盐水重新配成0D62,达到1012之间的菌悬液，备用；(9)构建人工菌群以体积比计，按盐单胞菌(泡7a770朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188:芽孢杆菌(泡w77"s)sp.Y4CCTCCNO:M208189:芽孢杆菌(5a"77w)sp.Y5CCTCCNO:M208190:芽孢杆菌(泡"77"s)sp.17-1CCTCCNO:M208183:芽孢杆菌(feci""s)sp.17-3CCTCCNO:M208184:芽孢杆菌(fec历"s)sp.17-4CCTCCNO:M208185:盐单胞菌(泡7o膨/as)sp.17-5CCTCCNO:M208192:盐单胞菌(泡j画腊)sp.19-ACCTCCNO:M208186:芽孢杆菌(泡"77"s)sp.19-BCCTCCNO:M208187:盐单胞菌(泡Amo朋s)sp.19-DCCTCCNO:M208193:芽孢杆菌(feci^"s)sp.Y6CCTCCNO:M208191为l-4:1-4:0-1:0-1:1-2:0-1:1-2:1-2:o-i:o-i:1-2的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群；(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照15°/。30%的接种量接入pH为911，COD为1,000140,000mgT的造纸废水中，在3538。C条件下静止处理造纸废水，期间间歇搅拌，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和COD指标，当造纸废水pH降至7.08.8之间，处理结束。上述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法中所述菌株培养使用改良的完全液体培养基，其配方(质量百分比)为1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1-3%的NaCl，1ml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNa0H调至8.0;其中所述金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Na2Mo042H200.lg;CuCl22H200.05g;Na2W042H200.05g;HC1120mmol;所述固体斜面培养基的配方是含有质量百分比为1.52.0%琼脂粉的完全液体培养基。上述培养基在115。C条件下灭菌20分钟后使用。上述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法中所述构建人工菌群，以体积比计，进一步优选按盐单胞菌(他7o鹏朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188:芽孢杆菌(few7J"s)印.Y4CCTCCNO:M208189:芽孢杆菌(fe"7扁sp.Y5CCTCCNO:M208190:芽孢杆菌(fe"7k)sp.17-1CCTCCNO:M208183:芽孢杆菌(万aciL"s)sp.17-3CCTCCNO:M208184:芽孢杆菌(泡cj77m)sp.17-4CCTCCNO:M208185:盐单胞菌sp.17-5CCTCCNO:M208192:盐单胞菌(泡Jo历o朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186:芽孢杆菌(5acj'Wus)sp.19-BCCTCCNO:M208187:盐单胞菌(泡J師腦)sp.19-DCCTCCNO:M208193:芽孢杆菌(泡"77"s)sp.Y6CCTCCNO:M208191为4:2:1:1:2:1:1:2:1:1:2的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合。若应用本发明所述不完全的菌株构建人工菌群，优选以体积比计，按盐单胞菌(〃a〗,朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188:芽孢杆菌(feci"iAS)sp.Y4CCTCCNO:M208189:芽孢杆菌(fecj'7hs)sp.17-3CCTCCNO:M208184:盐单胞菌(泡7o卿朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192:盐单胞菌(泡7謹腦)sp.19-ACCTCCNO:M208186:芽孢杆菌sp.Y6CCTCCNO:M208191为2:1:1:1:1:1的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合。上述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法中步骤(10)所述构建的人工菌群优选以体积比计按照20%的接种量接入造纸废水中，在37t:条件下静止处理造纸废水。其中步骤(10)所述间歇搅拌的搅拌时间优选1530分钟，转速为50120转/分；间歇时间为48小时。实验测定pH、色度和COD指标的结果表明本发明的人工菌群对纸废水具有明显降低pH、脱除部分色度和COD的能力；结合polymerasechainreaction-denaturinggradientgelelectrophoresis(PCR-DGGE)分析废水处理过程中的菌群变化，也证实本发明所述菌群为一组相对稳定具有直接处理造纸废水能力的菌群；将处理前后的造纸废水分别用乙酸乙酯和氯仿萃取三次，采用氮吹的方法使有机溶剂全部挥发后用1ml溶剂重溶，GC-MS(气质联用)分析造纸废水被处理前后的化合物组分变化，其中一些天然的化合物如杜松醇、十四碳烯酸及木质素的单体化合物如愈创木酚、香兰素等被检测出来，这些化合物在被菌群处理后均有很大程度的降低，说明本发明的人工菌群具有降解这些化合物的能力。造纸废水是一种微生物难以直接处理的废水，经过本发明构建的完全菌群处理后的废水，大约有7.5g广甲酸、8.9gr'乙酸及2.5g广乳酸产生，使pH能够从ll.O降低到8.0以下；同时大约35%的色度和18.5%C0D。r的废水色度被脱除，废水由黑色变为棕色。处理后的废水其粘度明显降低，经检测粘度由处理前的8.68CP降低为处理后的4.3CP左右。进一步利用降解曲线和PCR-DGGE分子生态学分析方法检测菌群处理废水过程中各个菌株的动态变化，显示本发明的处理过程为两步处理方式的机制即初期^a^^朋assp.在产酸降低废水pH值上发挥重要作用，同时具有一定的脱色作用；后期^a^77^sp.在一些木质素单体化合物降解中发挥了重要作用，在COD降低的同时色度进一步被脱除，原因可能在于木质素中含有的一些发色团被降解。本发明的显著效果及优点在于(1)构建的菌群具有显著的直接处理高pH、高C0D造纸废水的能力，废水不需要稀释，使该菌群具有开发应用的潜力；(2)釆用好氧和兼性厌氧菌的组合方式构建人工菌群，兼顾了好氧和兼性厌氧菌对造纸废水的不同作用，提高了可生化性，避免了单一菌株处理能力的局限；(3)不同于活性污泥和氧化塘等驯化菌群，本发明构建的人工菌群结构简单，容易控制，重复性好，且选用菌株易于培养。(4)经PCR-DGGE实验证明的两步处理造纸废水机制将对所述菌群在废水处理的实际应用发挥重要的指导作用，提高构建菌群的应用潜力。总之，该构建菌群在造纸废水的直接初级处理中具有很大的应用潜力，对废水的后期处理提供了有利条件。本发明提供的泡7ov7ra朋ssp.Y2，他J。卿"assp.17-5,泡J。历。朋ssp.19-A，〃aZ。膨朋51sp.19-D菌株与泡cj77iAsp.Y4，泡c!7A/51sp.Y5，5aw7化51sp.17-1，jfecj2iAsp.17-3，5acj"ssp.17-4，fe"X/iASsp.19-B，；9aw7J肪sp.Y6菌株已于2008年10月29日保藏于"中国典型培养物保藏中心(CCTCC)"，保藏地址武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮政编码430072，其保藏编号为CCTCCNO:M208183CCTCCNO:M208193。图l菌群降解pH11.0、COD140,000mgl—1的原始废水的降解曲线。其中A，处理废水的pH值变化(O);pH7.6对照的色度变化(口)；处理废水的色度变化(B);处理废水的COD(A);B，废水处理过程中的乳酸浓度(A);废水处理过程中的甲酸浓度(O);废水处理过程中的乙酸浓度(令)。图2PCR-DGGE图谱检测废水处理过程中的菌群动态变化。其中泳道l,处理前菌群结构图谱；泳道2，44小时处理后图谱；泳道3，68小时处理后图谱；泳道4,92小时处理后图谱；泳道5，116小时处理后图谱；泳道6,140小时处理后图谱；泳道7，180小时处理后图谱。图3使用GC-MS检测菌群处理废水前后废水的组成变化。其中样品采用乙酸乙酯萃取处理后浓縮，使用DB-1的柱子进行检测。图4使用GC-MS检测菌群两步法处理废水前后废水的组成变化。其中样品采用氯仿萃取处理后浓縮，使用DB-5的柱子进行检测。A:处理前对照；B:菌群处理5天。具体实施例方式实施例l:各菌株生长对氧的需求、耐受温度、pH及耐盐度的测定(1)菌种选择选用从各种极端自然环境如强碱高盐等环境分离到并于2008年10月29日保藏于"中国典型培养物保藏中心"的四株盐单胞菌(泡乃卿朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188，盐单胞菌(泡"侧朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192，盐单胞菌(他2o鹏朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186或盐单胞菌(泡7画愿)sp.19-DCCTCCNO:M208193和七株芽孢杆菌sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌(^sci7k)sp.Y5CCTCCNO:M208190，芽孢杆菌(版j7k)sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(5scj'"iA)sp.17-3CCTCCNO:M208184，芽孢杆菌(^scj77"s)sp.17-4CCTCCNO:M208185，芽孢杆菌(fecj'"〃s)sp.19-BCCTCCNO:M208187或芽孢杆菌sp.Y6CCTCCNO:M208191;首先分另U选取上述泡Jo/b。朋51sp.Y2，泡7o历o朋51sp.17-5，泡J。/z/o朋51sp.19-A,泡Jo/no朋ssp.19-D菌群中的菌株分别进行如下操作(2)泡"鹏朋s斜面培养将上述他^m70朋s菌株接种于含有质量百分比为1.6%的琼脂粉、pH为8.0的LB培养基上，3CTC培养菌体20小时；(3)/fe"/bo朋s种子培养将步骤(2)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于含有100mlLB液体培养基的500ml的三角瓶中，30'C条件下在摇床上200转/分振荡培养16小时，制得种子。将菌体5000rpm离心8分钟，分别收集各菌获得的菌体，用生理盐水^t涤3次后用生理盐水悬浮；(4)在确定各个他A^朋^菌株耐温性的实验中，实验培养基使用LB培养基，配方为(质量百分比)1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1°/。的NaCl,加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至9.5，115。C条件下灭菌20分钟。接种量5%，生长温度分别为4。C、l(TC、20°C、25°C、30°C、37°C、45°C、50°C、55°C，在摇床上200rpm振荡培养24小时，测定OU直。0D6。^大于0.3视为阳性。各菌株的耐温性结果如表一所示。泡J卿o/7as的温度生长范围为4-45°C，最佳生长温度为3(TC或37°C。(5)在确定各个WaAMo/7as菌株耐碱性的实验中，实验培养基使用LB培养基，配方为(质量百分比)1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，W的NaCl，加pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0和12.0的KH2P04/K2HP04orNa2C03/NaHC03缓冲液1L配制。115i:条件下灭菌20分钟。接种量5%，3(TC在摇床上200rpm振荡培养24小时，测定OD柳,自值。OD6i大于0.3视为阳性。各菌株的耐碱性结果如表一所示，实验菌株均为耐碱性菌株，且在pHIO左右能够最佳生长。(6)在确定各个^3A)M^as菌株耐盐度的实验中，实验培养基使用LB培养基，配方为(质量百分比)1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，分别加入质量百分比为0%、1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、18%、2(W的NaCl，pH用4MNaOH调至9.5，115。C条件下灭菌20分钟。接种量5%，30。C在摇床上200rpm振荡培养24小时，测定0De陽值。ODe(麵大于0.3视为阳性。实验结果如表一所示，结果表明泡7湖o朋ssp.为中度耐盐菌。其中的Y2、17-5和19-A能够在0-18%的NaCl浓度下生长。(7)在确定各个泡AM/o/7as菌株需氧性的实验中，实验培养基使用LB培养基，配方为(质量百分比)1°/。的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的NaCl，pH分别调节为8.0或10.0。115。C条件下灭菌20分钟，接种量5%(v/v)，30。C在摇床上200rpm振荡培养24小时，测定0De。細值。0D6。，大于0.3视为阳性。结果表明泡J湖o朋s为好氧菌株。再选取上述fe"ksp.Y4，泡"？7i/ssp.Y5，5acj77"ssp.17-1，feci""ssp.17-3，5acj'Wussp.17-4，5aci""ssp.19-B，5aci"〃ssp.Y6菌群中的菌株分别进行如下操作(8)few7^/s菌株斜面培养将上述5aci7^^菌株接种于含有质量百分比为1.6%的琼脂粉、pH为8.0的LB培养基上，37°C、100rpm振荡培养菌体20小时；(9)feci77^种子培养将步骤(8)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于含有100mlLB液体培养基的500ml的三角瓶中，37"C条件下在摇床上100转/分振荡培养24小时，制得种子。将菌体离心8分钟，分别收集各菌获得的菌体，用生理盐水洗涤3次后用生理盐水悬浮；(10)在确定各个5aciW^菌株耐温性的实验中，实验培养基使用LB培养基，配方为(质量百分比)1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，l免的NaCl，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0，115。C条件下灭菌20分钟。接种量5%，生长温度分别为4。C、10°C、20°C、25°C、30°C、37°C、45°C、55°C、60。C与65°C，在摇床上100rpm振荡培养24小时，测定OD,值。OD^大于0.3视为阳性。各菌株的耐温性结果如表一所示。fecWA/s生长温度范围为10-60°C，最佳生长温度为3(TC或42X:。(11)在确定各个^scj77^菌株耐碱性的实验中，实验培养基使用LB培养基配方为(质量百分比)1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，ly。的NaCl，加pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0和12.0的KH2P04/K2HP04orNa2C03/NaHC03缓冲液1L配制。115'C条件下灭菌20分钟。接种量5%，37。C在摇床上100rpm振荡培养24小时，测定ODe(^值。OD^^大于0.3视为阳性。各菌株的耐碱性结果如表一所示，实验菌株均为耐碱性菌株，且在pH8-9能够最佳生长。(12)在确定各个^a^7^^菌株耐盐度的实验中，实验培养基使用LB培养基，配方为(质量百分比)1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，分别加入质量百分比为0%、1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、18%、2(W的NaCl，pH用4MNaOH调至9.5，115。C条件下灭菌20分钟。接种量5%，37。C在摇床上100卬m振荡培养24小时，测定OD,-值。006。。大于0.3视为阳性。实验结果如表一所示，结果表明53"W^大多能在0-1%的NaCl下获得最佳生长。(13)在确定各个^3^77^菌株需氧性的实验中，实验培养基使用LB培养基，配方为(质量百分比)1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的NaCl，pH分别调节为8.0或10.0。115。C条件下灭菌20分钟，接种量5%，37'C在摇床上100rpm振荡培养24小时，测定ODe(麵值。006。。大于0.3视为阳性。结果表明5a"'""s为兼性厌氧菌株。表一选择菌株的生长条件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例2:构建人工菌群进行造纸废水处理的方法选取盐单胞菌(泡Jo鹏朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188和盐单胞菌(泡J咖o朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186菌株分别进行如下操作(1)斜面培养将上述他h卿/^菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，30'C培养菌体20小时；(2)—级种子培养将步骤(l)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，3(TC条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，3(TC条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至ODei达到10，制得二级种子；(4)收集泡J側o朋s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0De2,达到10的菌悬液，备用；同时，选取芽孢杆菌(5acj77"s)sp.Y4CCTCCNO:M208189和芽孢杆菌(5aciWus)sp.17-3CCTCCNO:M208184菌株分别进行如下操作(5)斜面培养将上述^^7A/s菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37。C培养菌体24小时；(6)—级种子培养将步骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，37'C条件下在100转/分摇床上振荡培养16小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37'C条件下在100转/分摇床上振荡培养16小时至0De2^达到10，制得二级种子；(8)收集泡c^Aas菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0062。达到10的菌悬液，备用；(9)构建人工菌群以体积比计，按照泡7o历o/assp.Y2:fecj'"^sp.Y4:feci""s印.17-3:泡Amo朋ssp.19-A为1:1:1:1的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群；(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照15%的接种量接入pH为9，COD为1,000mg1—'的造纸废水中，在35。C条件下静止处理造纸废水，期间间歇搅拌(搅拌时间为15分钟，转速为50转/分；间歇时间为4小时)，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和COD指标，当造纸废水pH降至7.0且稳定不变时，处理结束。pH采用奥利龙酸度计检测；有机酸采用HPLC(Agilent1100series,Hewlett-Packard)检测；色度釆用2100分光光度计检测0D在465咖下的光吸收值；COD采用重铬酸钾法检测。实验结果表明pH由9.0降到7.0左右。大约38%色度和70.5。/。C0D被脱除。在上述利用构建菌群处理造纸废水的方法中，菌株培养使用改良的完全培养基，配方为(质量百分比)1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1-3%的NaCl,1.6%琼脂粉，lml的金属离子混合液，加蒸熘水到1L，pH用4MNaOH调至8.0。115'C条件下灭菌20分钟。液体种子培养用改良的完全液体培养基，配方为质量百分比为1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1-3y。的NaCl，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L,pH用4MNaOH调至8.0。115。C条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Na2Mo042H200.lg;CuCl22H200.05g;Na具2H200.05g;HC1120mmol。实施例3:构建菌群进行造纸废水处理的方法选取盐单胞菌(〃a7o/w/a)sp.Y2CCTCCNO:M208188，盐单胞菌(泡7oM/as)sp.17-5CCTCCNO:M208192和盐单胞菌(泡J画膨)sp.19-ACCTCCNO:M208186菌株分别进行如下操作(l)斜面培养将上述Wa7o历o/as菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，3(TC培养菌体20小时；(2)—级种子培养将步骤(l)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，3(TC条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，3(TC条件下在200转/分摇床上振荡培养15小时至0D62她达到11，制得二级种子；(4)收集泡J湖o朋s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0D62^为U的菌悬液，备用；同时，选取芽孢杆菌(fe^7A^)sp.Y4CCTCCN0:M208189,芽孢杆菌(fecj7A/s)sp.17-3CCTCCNO:M208184和芽孢杆菌(Saci77"s)sp.Y6CCTCCNO:M208191菌株分别进行如下操作(5)斜面培养将上述fe"W^菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37'C培养菌体24小时；(6)—级种子培养将步骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，37'C条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37。C条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至0D6、达到10，制得二级种子；(8)收集fe^7A/s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0062。为IO的菌悬液，备用；(9)构建人工菌群以体积比计，按照泡7湖o朋ssp.Y2:few7JiAsp.Y4:fe"7J;/6"sp.17-3:〃a/o膨朋51sp.17-5:〃a7cMo/7assp.19_A:fec!77"ssp.Y6为2:i:i:i:i:i的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群-,(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照30%的接种量接入pH为11、C0D为100，000mg1—'的造纸废水中，在37'C条件下静止处理造纸废水，期间间歇搅拌(搅拌时间为25分钟，转速为120转/分；间歇时间为6小时)，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和C0D指标，当造纸废水pH降至8.4且稳定不变时，处理结束。pH采用奥利龙酸度计检测；有机酸采用HPLC(Agilent1100series,Hewlett-Packard)检测；色度采用2100分光光度计检测0D在465nm下的光吸收值；COD采用重铬酸钾法检测。实验结果表明pH由11.0降至8.4左右。大约29%色度和10.8。/。的C0D被脱除。在上述利用构建菌群处理造纸废水的方法中，菌株培养使用改良的完全培养基，配方为(质量百分比)1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1°/。的牛肉膏，1_3%的NaCl，1.6%琼脂粉，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0。115。C条件下灭菌20分钟。液体种子培养用改良的完全液体培养基，配方为质量百分比为1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，l-3。/。的NaCl，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0。115'C条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Na2Mo042H200.lg;CuCl22H200.05g;Na2W042H200.05g;HC1120mmol。实施例4:构建菌群进行造纸废水处理的方法选取盐单胞菌(^^o历朋as)sp.Y2CCTCCNO:M208188和盐单胞菌(yfe7o7o/7as)印.19-ACCTCCNO:M208186菌株分别进行如下操作(1)斜面培养将上述〃a&历朋as菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，3(TC培养菌体20小时；(2)—级种子培养将步骤(l)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，30。C条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，3CTC条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至ODe2^达到12，制得二级种子；(4)收集泡7o卿朋s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0062一达到12的菌悬液，备用；同时，选取芽孢杆菌(feciW^)sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌(Aci77"s)sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(5aw77〃s)sp.17-3CCTCCNO:M208184和芽孢杆菌(feciWw)sp.17-4CCTCCNO:M208185菌株分别进行如下操作(5)斜面培养将上述Asw7A^菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37。C培养菌体24小时；(6)—级种子培养将步骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，37'C条件下在100转/分摇床上振荡培养20小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37。C条件下在100转/分摇床上振荡培养20小时至0De2^达到10，制得二级种子；(8)收集few7^^菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成ODe2^达到10的菌悬液，备用5(9)构建人工菌群以体积比计，按照//^，o朋ssp.Y2:^aci^"sp.Y4:^aciW^SP.17-1:fedJtASp.17-4:fe"7JiASSp.17-3:泡7o/Z70/7S51Sp.19-A二l:1:1:1:1:l的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群；(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照30%的接种量接入pH为11、COD为100,000mg1—'的造纸废水中，在37'C条件下静止处理造纸废水，期间间歇撹拌(搅拌时间为15分钟，转速为120转/分；间歇时间为8小时)，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和C0D指标，当造纸废水pH降至8.8且稳定不变时，处理结束。pH采用奥利龙酸度计检测；有机酸采用HPLC(Agilent1100series,Hewlett-Packard)检测；色度采用2100分光光度计检测0D在465nm下的光吸收值；C0D采用重铬酸钾法检测。实验结果表明pH由11.0降至8.8左右。大约28%色度和10.5%的COD被脱除.在上述利用构建菌群处理造纸废水的方法中，菌株培养使用改良的完全培养基，配方为(质量百分比)1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1_3%的NaCl，1.6%琼脂粉，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0。115'C条件下灭菌20分钟。液体种子培养用改良的完全液体培养基，配方为质量百分比为1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，l-3M的NaCl，1ml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0。115。C条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Na2Mo(X2H200.lg;CuCl22H200.05g;Na具2H200.05g;HC1120,1。实施例5:构建菌群进行造纸废水处理的方法选取盐单胞菌(/feJo历o;as)sp.Y2CCTCCNO:M208188，盐单胞菌(泡7oto朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192，盐单胞菌(泡7o膨"as)sp.19-ACCTCCNO:M208186和盐单胞菌(泡7oto朋s)sp,19-DCCTCCNO:M208193菌株分别进行如下操作(1)斜面培养将上述泡7卿朋as菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，3(TC培养菌体20小时；(2)—级种子培养将步骤(l)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，3(TC条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，3(TC条件下在200转/分摇床上振荡培养15小时至0D,达到12，制得二级种子；(4)收集〃aAM7朋as菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0D^达到12的菌悬液，备用；同时，选取七株芽孢杆菌(泡cW7m)sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌(泡"7k)sp.Y5CCTCCNO:M208190，芽孢杆菌(fecj扁sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(S腦7扁sp.17-3CCTCCNO:M208184，芽孢杆菌(ifeci77i^)sp.17-4CCTCCNO:M208185，芽孢杆菌(fe"'7k)sp.19-BCCTCCNO:M208187和芽孢杆菌(fecW7"5)sp.Y6CCTCCNO:M208191菌株分别进行如下操作(5)斜面培养将上述^s^7^^菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37T:培养菌体24小时；(6)—级种子培养将步骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，37。C条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37。C条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至0De2^达到10，制得二级种子；(8)收集fe"'i^^菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成ODe翻达到10的菌悬液，备用；(9)构建人工菌群以体积比计，按照泡2o迈o朋ssp.Y2:5ac///Msp.Y4:feoz77"ssp.Y5:5acj7ksp.17-1:fecj77Msp.17-3:5acj7Jyssp.17_4:泡7o历o朋51sp.17-5:泡J譜o朋51sp.19-A:j9aci77twsp.19-B:泡7ia770朋51sp.19-D:fe"77i/ssp.Y6=4:2:1:1:2:1:1:2:1:1:2的比例(将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群；(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照20%的接种量接入pH为11、C0D为140，000mg1—'的造纸废水中，在37。C条件下静止处理造纸废水并间歇搅拌(搅拌时间为30分钟，转速为60转/分；间歇时间为4小时)处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和C0D指标，当造纸废水pH降至7.8且稳定不变时，处理结束。每隔四小时间隔取样测定pH、有机酸、色度和C0D指标。图l所示结果表明该菌群具有直接处理造纸废水产酸降低pH、脱除部分色度和C0D的能力。pH采用奥利龙酸度计检测；有机酸采用HPLC(Agilent1100series,Hewlett-Packard)检测;色度采用2100分光光度计检测0D在465nm下的光吸收值；COD采用重铬酸钾法检测。通过观察pH值的变化曲线可以发现(图1)，整个处理过程分成了两个阶段第一阶段为0-68h处理阶段，有机酸主要产生在这一阶段，大约3.5gI—1乳酸、6.7gl—1甲酸和6.5g1—1乙酸产生，使得pH由11.0降低至7.8。在这一阶段，约达18%色度和16,000mgI—1C0D。r(11.5%)被脱除；第二阶段为68-180处理阶段，在这一阶段处理乙酸增加了2.2g1—1以外，甲酸和乳酸浓度基本没有变化，这一阶段大约有17.5%的色度和10，000mgl-1C0Dcr(7.0%)被进一步去除。总体而言，大约35%色度和18.5%C0D在整个处理过程被脱除。在上述利用构建菌群处理造纸废水的方法中，菌株培养使用改良的完全培养基，配方为(质量百分比)1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1-3%的NaCl，1.6%琼脂粉，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNa0H调至8.0。115'C条件下灭菌20分钟。液体种子培养用改良的完全液体培养基，配方为质量百分比为1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，l-3。/。的NaCl，1ml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNa0H调至8.0。115。C条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Na2Mo042H200.lg;CuCl22H200.05g;Na2W042H200.05g;HC1120mmol。实施例6:PCR-DGGE检测处理废水过程中菌群的动态变化选取盐单胞菌(泡7o卿/as)sp.Y2CCTCCNO:M208188,盐单胞菌(泡J卿was)sp.17-5CCTCCNO:M208192，盐单胞菌(y^A^o朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186和盐单胞菌(他7湖o朋5")sp.19-DCCTCCNO:M208193菌株分别进行如下操作(1)斜面培养将上述他"历o"as菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，3(TC培养菌体20小时；(2)—级种子培养将步骤(l)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，3(TC条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5。/。的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，3(rC条件下在200转/分摇床上振荡培养15小时至0D咖m达到12，制得二级种子；(4)收集^^側o朋s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0D^达到12的菌悬液，备用；同时，选取七株芽孢杆菌(few7^ys)sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌(泡w77tA)sp.Y5CCTCCNO:M208190,芽孢杆菌(5aci""s)sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(fe"7k)sp.17-3CCTCCNO:M208184，芽孢杆菌(few'"""sp.l7-4CCTCCNO:M208185，芽孢杆菌(feci"^)sp.19-BCCTCCNO:M208187和芽孢杆菌(fe"77"s)sp.Y6CCTCCNO:M208191菌株分别进行如下操作(5)斜面培养将上述5sw77^菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37t:培养菌体24小时；(6)—级种子培养将步骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，37'C条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37'C条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至OD62^达到10,制得二级种子；(8)收集feci^^s菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0Dw达到10的菌悬液，备用；(9)构建人工菌群以体积比计，按照泡AMo/7assp.Y2:5acj7^ssp.Y4:feci77"ssp.Y5:fecj7Ji/ssp.17-1:fecj'JJu51sp.17-3:万aciJJi/51sp.17-4:/feJawo朋61sp.17-5:〃aJoT70朋51sp.19-A:5aw72w51sp.19-B:他/ooto朋51sp.19-D:泡cj'j7〃51sp.Y6=4:2:1:1:2:1:1:2:1:1:2的比例(将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群；(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照20%的接种量接入pH为11、C0D为140，000ragT的造纸废水中，在37。C条件下静止处理造纸废水，期间间歇搅拌(搅拌时间为30分钟，转速为60转/分；间歇时间为4小时)；(11)结合polymerasechainreaction-denaturinggradientgelelectrophoresis(PCR-DGGE，Bio-Rad，Hercules,CA)分析废水处理过程中的菌群变化，从而确定该菌群为一个相对稳定具有直接处理造纸废水能力的菌群。PCR-DGGE图谱(图2)表明在废水分批处理过程中，^Wo/zw/7as菌株在前期处理时具有优势生长的能力，但在后期相对稳定。Aac277^菌株前期不活跃后期具有较强的生长处理能力，这与实施例4中的降解曲线得出的结论是符合的。据此，该构建菌群在处理造纸废水时存在一个两步处理机理前期处理当氧气、多聚糖等条件比较充足的时候，四株泡2OT朋^作为一类在严格好养条件下生长旺盛的菌株处于优势生长状态，通过消耗各种糖类物质产酸使废水的pH降低到微碱性；当pH降低到一定程度时为兼性厌氧5sw77m菌的生长提供了比较理想的条件，七株^ac/wm菌在废水处理中开始发挥作用，消耗一些较难降解的废水组分使COD和色度进一步降低。在上述利用构建菌群处理造纸废水的方法中，菌株培养使用改良的完全培养基，配方为(质量百分比)1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1_3%的NaCl，1.6%琼脂粉，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNa0H调至8.0。115t:条件下灭菌20分钟。液体种子培养用改良的完全液体培养基，配方为质量百分比为1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5。/。的酵母膏，1%的牛肉膏，1-3。/。的NaCl，lral的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNa0H调至8.0。115。C条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Na2Mo042H200.lg;CuCl22H200.05g;Na2W042H200.05g;HC1120画l。实施例7:GC-MS检测菌群处理前后废水组成的变化选取盐单胞菌(^^o历朋as)sp.Y2CCTCCNO:M208188，盐单胞菌(vfeAMo/as)sp.17-5CCTCCNO:M208192，盐单胞菌(泡7咖o朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186和盐单胞菌(泡2湖o朋s)sp.19-DCCTCCNO:M208193菌株分别进行如下操作(1)斜面培养将上述^^ot朋m菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，3(TC培养菌体20小时；(2)—级种子培养将步骤(l)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，3CTC条件下在200转/分摇床上振荡培养16小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，30匸条件下在200转/分摇床上振荡培养15小时至0062。达到12，制得二级种子；(4)收集泡J湖o/7^菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0062。达到12的菌悬液，备用；同时，选取七株芽孢杆菌(few'""s)sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌sp.Y5CCTCCNO:M208190，芽孢杆菌(&"77〃s)sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(fecj7扁sp.17-3CCTCCNO:M208184，芽孢杆菌(fe"77i/s)sp.17-4CCTCCNO:M208185,芽孢杆菌(feci""s)sp.19-BCCTCCNO:M208187和芽孢杆菌(泡c7'Wm)sp.Y6CCTCCNO:M208191菌株分别进行如下操作(5)斜面培养将上述^^7A^菌株接种于含有质量百分比为1.6%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37'C培养菌体24小时；(6)—级种子培养将歩骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接2环于100ml完全液体培养基中，37X:条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37。C条件下在100转/分摇床上振荡培养18小时至0Dw达到10，制得二级种子；(8)收集泡ciW^菌体在5000rpm条件下离心8分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤3次；之后用生理盐水重新配成0D6i达到10的菌悬液，备用；(9)构建人工菌群以体积比计，按照泡7咖o朋ssp.Y2:&ci""ssp.Y4:few77"sp.Y5:5aci77ussp.17-1:5acj'7Ji/ssp.17-3:fecj7hssp.17-4:sp.17-5:泡J。膨朋51sp.19-A:5acjJ〃51sp.19-B://aZ湖。朋ssp.19-D:泡t^77"ssp.Y6=4:2:1:1:2:1:1:2:1:1:2的比例(将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群；(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照20%的接种量接入pH为11、C0D为140，000mgT的造纸废水中，在37"条件下静止处理造纸废水，期间间歇搅拌(搅拌时间为30分钟，转速为60转/分；间歇时间为4小时)；(11)样品分离处理将处理前后的100ml废水分别用乙酸乙酯和氯仿萃取三次，采用氮吹的方法使有机溶剂全部挥发后用1ml溶剂重溶，用于GC-MS分析。(12)GC-MS(气质联用)检测GC-MS分析废水被处理前后的化合物组分变化。乙酸乙酯处理的废水及不加菌的对照废水用GC-MS(DB-1色谱柱，ShimadzuGCMS-QP2010)检测，处理前后废水组分图谱如图3所示；氯仿处理的废水及不加菌的对照废水用GC-MS(DB-5色谱柱，VARI認Saturn2000)检测。处理前后的废水组分变化如图4所示。图3表明废水中含有很多的天然化合物如杜松醇等并且很多天然化合物都能够被菌群降解。图4表明一些木质素的单体化合物能够通过氯仿萃取、GC-MS分析出来，一些化合物如香兰素等几乎能够完全被降解。在上述利用构建菌群处理造纸废水的方法中，菌株培养使用改良的完全培养基，配方为(质量百分比)1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1_3%的NaCl，1.6%琼脂粉，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0。115'C条件下灭菌20分钟。液体种子培养用改良的完全液体培养基，配方为质量百分比为1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1°/。的牛肉膏，1-3M的NaCl，lml的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0。115。C条件下灭菌20分钟。金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Na2Mo042H200.lg;CuCl22H200.05g;Na2W042H200.05g;HC1120躍ol。权利要求1、一种以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于选取已于2008年10月29日保藏于“中国典型培养物保藏中心”的盐单胞菌(Halomonas)sp.Y2CCTCCNOM208188，盐单胞菌(Halomonas)sp.17-5CCTCCNOM208192，盐单胞菌(Halomonas)sp.19-ACCTCCNOM208186，盐单胞菌(Halomonas)sp.19-DCCTCCNOM208193菌株与芽孢杆菌(Bacillus)sp.Y4CCTCCNOM208189，芽孢杆菌(Bacillus)sp.Y5CCTCCNOM208190，芽孢杆菌(Bacillus)sp.17-1CCTCCNOM208183，芽孢杆菌(Bacillus)sp.17-3CCTCCNOM208184，芽孢杆菌(Bacillus)sp.17-4CCTCCNOM208185，芽孢杆菌(Bacillus)sp.19-BCCTCCNOM208187，芽孢杆菌(Bacillus)sp.Y6CCTCCNOM208191菌株中的两种或两种以上的菌株分别无菌培养至OD620nm达到10.0以上，然后以体积比计按Halomonassp.Y2∶Bacillussp.Y4∶Bacillussp.Y5∶Bacillussp.17-1∶Bacillussp.17-3∶Bacillussp.17-4∶Halomonassp.17-5∶Halomonassp.19-A∶Bacillussp.19-B∶Halomonassp.19-D∶Bacillussp.Y6为1-4∶1-4∶0-1∶0-1∶1-2∶0-1∶1-2∶1-2∶0-1∶0-1∶1-2的比例将菌液混合，构建人工菌群；将构建的人工菌群以体积比计按照15％～30％的接种量接入pH＝9-11，COD1,000-140,000mgl-1的造纸废水中，在35～38℃条件下静止处理草浆造纸废水，期间间歇搅拌，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和COD指标，当造纸废水pH降至7.0～8.8之间，处理结束。2、如权利要求1所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于所述方法的具体操作步骤为选取盐单胞菌(泡乃膨朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188,盐单胞菌(泡乃衡朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192，盐单胞菌(泡Jo历o朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186和盐单胞菌(泡J哪o朋s)sp,19-DCCTCCNO:M208193菌群中的两种或两种以上的菌株分别进行如下操作(1)斜面培养将上述^^o历朋as菌株接种于含有质量百分比为1.52.0%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，30士rC培养菌体1524小时；(2)—级种子培养将步骤(1)培养的菌体，无菌条件下用接种环接14环于100ml完全液体培养基中，30士rC条件下在120200转/分摇床上振荡培养1524小时至对数生长期中期，制得一级种子；(3)扩大培养以体积比为5%8%的接种量，接一级种子于1000ral完全液体培养基中，30±rC条件下在120200转/分摇床上振荡培养1524小时至0062。皿达到1012之间，制得二级种子；(4)收集泡J卿o朋s菌体在5000rpm条件下离心58分钟，分别收集步骤(3)制得的菌体，并用生理盐水洗涤34次；之后用生理盐水重新配成ODw达到1012之间的菌悬液，备用；同时，选取芽孢杆菌(5aw7hs)sp.Y4CCTCCNO:M208189，芽孢杆菌(泡cj'7乃s)sp.Y5CCTCCNO:M208190，芽孢杆菌(泡w7k)sp.17-1CCTCCNO:M208183，芽孢杆菌(fe"7i"s)sp.17-3CCTCCNO:M208184，芽孢杆菌(泡w77iAS)sp.17-4CCTCCNO:M208185，芽孢杆菌(fecj7k)sp.19-BCCTCCNO:M208187，芽孢杆菌(fecj.W"s)sp.Y6CCTCCNO:M208191菌群中的两种或两种以上的菌株分别进行如下操作-(5)斜面培养将上述5aw7A/s菌株接种于含有质量百分比为1.52.0%琼脂粉，pH为8.0的固体斜面培养基上，37土rC培养菌体1524小时；(6)—级种子培养将步骤(5)培养的菌体，无菌条件下用接种环接14环于100ml完全液体培养基中，37土rC条件下在100150转/分摇床上振荡培养1524小时至对数生长期中期，制得一级种子；(7)扩大培养以体积比为5%8%的接种量，接一级种子于1000ml完全液体培养基中，37±rC条件下在100150转/分摇床上振荡培养1524小时至0D,。^达到1012之间，制得二级种子；(8)收集泡ci^"s菌体在5000卬m条件下离心58分钟，分别收集步骤(7)制得的菌体，并用生理盐水洗涤34次；之后用生理盐水重新配成ODei达到1012之间的菌悬液，备用；(9)构建人工菌群以体积比计，按盐单胞菌(泡"7z70/7m)sp.Y2CCTCCNO:M208188:芽孢杆菌(fecj，s)sp.Y4CCTCCNO:M208189:芽孢杆菌sp.Y5CCTCCNO:M208190:芽孢杆菌(泡c!7J"s)sp.17-1CCTCCNO:M208183:芽孢杆菌("scj7M)sp.17-3CCTCCNO:M208184:芽孢杆菌(肠Wi/s)sp.17-4CCTCCNO:M208185:盐单胞菌(泡^搬/a9)sp.17-5CCTCCNO:M208192:盐单胞菌(泡"卿朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186:芽孢杆菌(泡ci^"^)sp.19-BCCTCCNO:M208187:盐单胞菌(泡2卿o朋5)sp.19-DCCTCCNO:M208193:芽孢杆菌sp.Y6CCTCCNO:M208191为1-4:1-4:0_1:0-1:1-2:0-1:l-2:1-2:o-i:o-i:1-2的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合，构建人工菌群；(10)处理造纸黒液将构建的人工菌群以体积比计按照15%30%的接种量接入pH=911,COD1,000140，000mgl—1的草浆造纸废水中，在3538'C条件下静止处理草浆造纸废水，期间间歇搅拌，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和C0D指标，当造纸废水pH降至7.08.8之间，处理结束。3、如权利要求2所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于所述完全液体培养基的配方为(质量百分比)1%的葡萄糖，1%的蛋白胨，0.5%的酵母膏，1%的牛肉膏，1-3。/。的NaCl，1ral的金属离子混合液，加蒸馏水到1L，pH用4MNaOH调至8.0;其中所述金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g;FeCl20.5g;MnCl24H200.5g;Mo042H200.lg;CuCl22H200.05g;Na2W042H200.05g;HC1120mmol;所述固体斜面培养基的配方是含有质量百分比为1.52.0%琼脂粉的完全液体培养基。4、如权利要求2所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于所述构建人工菌群，以体积比计，按盐单胞菌(泡7o卿朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188:芽孢杆菌(fec辺"s)sp.Y4CCTCCNO:M208189:芽孢杆菌(脸Y77"s)sp.Y5CCTCCNO:M208190:芽孢杆菌(5aci7A/s)sp.17-1CCTCCNO:M208183:芽孢杆菌(5ac/W"s)sp.17-3CCTCCNO:M208184:芽孢杆菌(feci""s)sp.17-4CCTCCNO:M208185:盐单胞菌(泡Jo历o朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192:盐单胞菌(泡Jo历o朋s)sp.19-ACCTCCNO:M208186:芽孢杆菌(5a"7k)sp.19-BCCTCCNO:M208187:盐单胞菌(他_/師鹏)sp.19-DCCTCCNO:M208193:芽孢杆菌(泡"7扁sp.Y6CCTCCNO:M208191为4:2:i:i:2:i:i:2:i:i:2的比例将步骤(4)和步骤(8)帝ij得的菌液混合。5、如权利要求2所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于所述构建人工菌群，以体积比计，按按盐单胞菌(泡7o鹏朋s)sp.Y2CCTCCNO:M208188:芽孢杆菌(泡cj7k)sp.Y4CCTCCNO:M208189:芽孢杆菌(泡"7扁sp.17-3CCTCCNO:M208184:盐单胞菌(泡7oto朋s)sp.17-5CCTCCNO:M208192:盐单胞菌(泡"膨"as)sp.19-ACCTCCNO:M208186:芽孢杆菌(泡cj7/m)sp.Y6CCTCCNO:M208191为2:1:1:1:1:1的比例将步骤(4)和步骤(8)制得的菌液混合。6、如权利要求2所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于步骤(10)所述构建的人工菌群以体积比计按照20%的接种量接入草浆造纸废水中，在37°C条件下静止处理草浆造纸废水。7、如权利要求2所述以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，其特征在于步骤(10)所述间歇搅拌的搅拌时间为1530分钟，转速为50120转/分；间歇时间为48小时。全文摘要本发明公开了一种以构建人工菌群方式处理造纸废水的方法，包括选取盐单胞菌(Halomonas)sp.菌群与芽孢杆菌(Bacillus)sp.菌群中的两种以上的菌株分别无菌培养至OD_620nm达到10.0以上，然后以体积比计按比例将菌液混合，构建人工菌群；将构建的人工菌群接入pH为9～11，COD为1,000～140,000mgl^-1的造纸废水中，在35～38℃条件下静止处理一定时间，期间间歇搅拌，处理过程中间隔取样测定造纸废水pH、色度和COD指标，当废水pH降至7.0～8.8之间，处理结束。本发明方法具有构建菌群结构简单，直接处理效果明显，可控性强，重复性强等特点，在造纸废水治理等废水处理方面具有很大的应用前景。文档编号C02F103/28GK101407362SQ20081015863公开日2009年4月15日申请日期2008年11月4日优先权日2008年11月4日发明者阳李,杨春玉,王照华,苏海军,平许,马翠卿申请人:山东大学