专利名称：一种产pva脱氢酶的基因工程菌及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产 PVA 脱氢酶(polyvinyl alcohol dehydrogenase, ECl. 1. 99. 23，简称PVADH)的基因工程菌及其构建方法，特别是一种高产PVA脱氢酶的基因 工程菌及构建方法与应用，属于遗传工程领域。
背景技术：
PVA (全称polyvinyl alcohol)，即聚乙烯醇，是一种人工合成的水溶性的高分子 化合物，具有如下优良理化特性溶解性好PVA溶于水，水温越高则溶解度越大，但几乎不 溶于有机溶剂；成膜性强PVA易成膜，其膜的机械性能优良，膜的拉伸强度随聚合度、醇解 度升高而增强；粘接性好PVA与亲水性的纤维素有很好的粘接力，一般情况，聚合度、醇解 度越高，粘接强度越强；热稳定性好PVA粉末加热到100°C左右时，外观逐渐发生变化。由 于其特殊的理化性能，目前主要用于纺织行业浆料、织物整理剂、维尼纶纤维原料；建筑装 潢行业的107胶、内外墙涂料、粘合剂；化工行业用作聚合乳化剂、分散剂及聚乙烯醇缩甲 醛、缩乙醛、缩丁醛树脂；造纸行业用作纸品粘合剂；农业方面用于土壤改良剂、农药粘附 增效剂和聚乙烯醇薄膜；还可用于日用化妆品及高频淬火剂等方面。纺织工业中的浆料，以PVA为主要成分，纺织品经过上浆处理，其理化性能更好、 手感更佳。但是，上浆工艺也带来了污染的问题，纺织品经过上浆后，还需要进行退浆处理， 去除纺织品上未结合的PVA，传统的退浆过程是用高温加酸/碱或是用氧化剂来破坏PVA的 长链结构使其降解，但是化学方法会对织物纤维结构造成了较大的损伤，同时退浆废水的 排放会对环境造成极大的污染，如果对污水进行处理，后续处理的费用高昂，又会增加企业 的负担。近年来人们寻求通过生物法降解PVA，提高了纺织品的质量，避免了化学法降解 PVA对植物纤维造成的损伤。目前，国内外尝试通过PVA降解酶降解PVA。PVA降解酶是一 个酶系，它们作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式报道的PVA降解酶主要包含三个种 类PVA脱氢酶(EC1. 1. 99. 23)、PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1. 1. 3. 30)和氧化型PVA 水解酶(β -双酮水解酶)(EC3. 7. 1. 7)。目前对于PVA降解的研究主要集中在三个方面 1.筛选能够降解PVA的微生物；2.纯化PVA降解酶；3.克隆与PVA降解相关的基因。PVA脱氢酶(EC1. 1. 99. 23)以PQQ为电子受体的情况下，将PVA脱氢氧化为酮 基化合物。目前，关于PVA脱氢酶基因的报道不多，1996年Siimao等人在大肠杆菌中用载体 Pucl8构建了 PVA降解菌/ ^ domonas spl VM15C的基因文库。编码PVA脱氢酶基因的蛋 白有639个氨基酸残基，发现有一个血红素结合位点和一个PQQ结合位点，氨基酸序列 表明与其它醌蛋白脱氢酶有较低的相似性(^iimao M et, Cloning and characterization of the gene encoding pyrroloquinoline quinonone- dependent poly (vinyl alcohol) dehydrogenase of Pseudomonas sp . st rain VM15C) ;Mamoto *艮据纯化的 PVA 脱氧酶氨 基酸的N端序列，克隆出PVA脱氢酶的全基因，全长196^p，共655个氨基酸，重组酶与/ ^/ domonas spl VM15C产的PVA脱氢酶有51%的同源性，该酶除了能够降解PVA外，还能够降解二醇类，如聚丙烯醇、1. 3- 丁醇、2. 4-戊二醇等，但该酶不能作用仲醇和叔醇。目前，国外对PVA脱氢酶的研究主要侧重于其基因报道和降解机理上，关于PVA脱 氢酶基因工程菌的研究报道很少，关于高产PVA脱氢酶基因工程菌的报道则更少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种产PVA脱氢酶(polyvinyl alcohol dehydrogenase, ECl. 1. 99. 23，简称 PVADH)的酵母工程菌。所述酵母工程菌染色体上携带有PVA脱氢酶的基因、PVADH\所述PVA脱氢酶核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述PVA脱氢酶基因位于表达载体PPIC9K上。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种PVA脱氢酶基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题提供如下具体步骤 第一步PVA脱氢酶基因设计
毕赤酵母O0ZcAia pastoris^的表达系统有着特殊的密码子偏好性，如果不对广权所 基因要表达的密码子的进行一定的修饰，毕赤酵母G0ZcAia pastor!S^可能无法正确翻译 /VJi拟基因，且通过软件SignalP 3. 0 Server的分析，/VJi拟基因的前75个碱基为自身的 信号肽。切掉序列的信号肽并根据毕赤酵母的密码子偏好性新设计的/VA //基因其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明设计的/VJi拟基因合成工作委托上海生工生物工程技术 服务有限公司完成。第二步PVA脱氢酶QPVADm重组质粒的构建
为了使/VA拟基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有乙醇氧化酶基因(AOX)的启 动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国hvitrogen公司)，利用合成的广权所 基因序列5'端的I限制性内切酶位点与3'端的I限制性内切酶位点，将合成 的/VJi拟基因克隆入载体pPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列， 这也为PVA脱氢酶基因在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于PPIC9K载体中含 有氨苄青霉素、遗传霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。将含有/VJi拟基因的载体与要连接的表达载体pPIC9K进行I和Λ^ I酶切， 连接得到含有/VJi拟基因的重组质粒PPIC9K-P权所。第三步PVA脱氢酶基因工程菌的构建
将重组质粒pPIC9K-/VJi拟电击转化宿主毕赤酵母GSl 15，构建高效表达PVA脱氢酶的 组成型毕赤酵母重组菌株。本步骤采用的含PVA脱氢酶合成基因的重组表达质粒PPIC9K+权i拟可转化毕赤 酵母O0ZcAia pas tor is GS115, hvitrogen)，成为能分泌表达外源PVA脱氢酶的功能酵母 菌由于含合成基因的重组表达质粒pPIC9K-/VJi拟上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当 重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，PPIC9K+权愿可以定向整合到毕赤酵 母染色体DNA上。在外源诱导物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源/VJi拟基因，信 号肽指导表达产物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产 物，最终将产物分泌至胞外。毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法首先接种活化后的毕赤酵母GS115一环于25 mL YPD液体培养基中，28 °C-30 °C振荡培养过夜，然后将上述培养液转入100 mL YPD (500 mL三角瓶)液体培养基中，28 °C-30 ！振荡培养，每隔1 h测定，培养直至菌 体浓度OD6tw为1. 3-1. 5，在冰水中冷却10 min以上，然后在4°C环境下，8000 r/min离心 收集菌体，用40 mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置10 min，如此重复步骤4三次， 即无菌水洗涤3次，用300 4 1^预冷1 mol/L山梨醇悬浮细胞，从而获得受体菌。然后取 50 80 μ L受体菌和5 90 μ g线性化重组表达质粒DNA混勻，电激(电压1500V 电容 25 μ F ；电阻200 Ω )处理，然后涂布于遗传霉素(10ug/ml)抗性平板筛选重组子。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种PVA脱氢酶基因工程菌的应用方法。为解决上述技术问题，提供如下技术方案 第一步重组菌株的筛选
所述重组表达质粒pPIC9K-/VJi拟上含有遗传霉素抗性基因，如果重组质粒已经整合 到染色体上，重组菌株具有遗传霉素抗性，可在含有遗传霉素的平板上生长；涂布含遗传霉 素抗性平板，挑取阳性转化子，即为产PVA脱氢酶酵母工程菌GS115-/VJI。第二步菌株经培养分泌PVA脱氢酶 培养基组成(g/L):
种子培养基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5_15 ； 发酵培养基酵母氮源基础培养基12-15，生物素0. 0002-0. 0005，甲醇10-50 ；微量元 素溶液，MnSO4 ·4Η20 100，ZnCl2 70，Na2MoO4 ·2Η20 35，H3BO3 60，CoCl2 ·6Η20 200，CuSO4 · 5Η20 29，NiCl2 · 6Η20 25，37% 盐酸 0. 9 mL。优选培养基组成(g/L) 种子培养基
蛋白胨15 g/L，酵母提取物8 g/L，葡萄糖15 g/L，氯化钠10 g/L； 发酵培养基酵母氮源基础培养基12-15 g/L,生物素0. 0002-0. 0005 g/L,甲醇10-50 g/L ；微量元素溶液，MnSO4 ·4Η20 100 g/L, ZnCl2 70 g/L，Na2MoO4 · 2H20 35 g/L, H3BO3 60 g/ L, CoCl2 · 6H20 200 g/L, CuSO4 · 5H20 29 g/L, NiCl2 · 6H20 25 g/L, 37% 盐酸 0. 9 mL。培养方法种子培养，250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度-30°C，摇床转速 200r/min，培养Mh ；发酵培养，离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量 接入装液量为50mL的三角瓶(500 mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200 r/min，发酵时 间3-4天。PVA脱氢酶酶活测定方法
在37°C条件下，反应液体系中有200 μ 1 PVA1799(10g/L)，1 mM吩嗪乙基硫酸盐，0.2 mM 2. 6-二氯靛酚，ImM 氰化钾，1 mM CaCl2, 3 μ M PQQ, 50 mM 磷酸盐缓冲液(pH 7.2)， 反应体系1 ml。酶活定义为在该条件下，每降低1 ymol PQQ所需要的酶量，单位为mg protein 1O本发明的优点在于构建了一株高效分泌表达PVA脱氢酶的毕赤酵母基因工程菌， 解决了 PVA脱氢酶产量低的问题；应用该菌种生产PVA脱氢酶，产量高、工艺简单、便于工业 化应用，该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，提取过程简单，产品纯度高，发酵结束后 PVA脱氢酶Gd权D活力可达110U/mL。本发明为生物法降解PVA的研究、开发、生产工作 奠定了基础，有利于早日实现纺织品退浆工艺的清洁生产。
具体实施例方式实施例1 :PVA脱氢酶基因的合成
PVA脱氢酶0°权D的基因来源于Sphingopyxis. sp. 113P中含PVA脱氢酶(/VJD基 因的操纵子(GenBank No. AB190288)，其中第3177位到第5141位是编码/VJi拟的基因。在 切掉基因自身信号肽，并对其进行密码子偏好性等修饰，在其5'端及3'端分别加上feo/P I和Λ^ I酶切位点，新设计的/VJi拟基因其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由上海生工 生物工程有限公司合成。实施例2 重组质粒pPIC9K- /VJi拟的构建
带有/VJi拟基因的载体和表达载体pPIC9K分别进行Λ^ I和I双酶切，试剂盒 回收后，使用Τ4连接酶进行连接。连接反应体系为(10 yL):目的基因片断2 yL，载体 DNA 2 μ L，IOX T4 连接酶 Buffer 1 μ L，T4DNA 连接酶 1 μ L, ddH20 4 μ L。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下
(1)无菌状态下取感受态细胞200μ L置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2μ L重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30 min；
(3)42°C热休克90 s (准确)，不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800uL；
(6)用无菌铺菌器将200μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37°C平放20 min直 至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。实施例3 =PVA脱氢酶基因工程菌的构建
将表达载体PPIC9K- PVADHm Sal I酶切线形化。酶切体系(50 μ L体系)重组质 粒 10 μ L，Buffer 5 μ L, Sal I 3 μ L, ddH20 32 μ L。37 °C水浴 3 h，用 PCR 产物纯化 试剂盒对线形化产物进行纯化回收，电击法转化毕赤酵母GS115，具体方法如下
(1)接种活化后的毕赤酵母GS115—环于25mL YPD液体培养基中，28 °C-30 °C振荡 培养过夜；
(2)将上述培养液转入100mL YPD (500 mL三角瓶)液体培养基中，28 °C-30 °C振荡 培养，每隔1 h测定，培养直至菌体浓度0D_为1. 3-1. 5 ；
(3)在冰水中冷却10min以上；
(4)48000 r/min离心收集菌体，用40 mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置 10 min ；
(5)重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次；
(6)用300μ L预冷1 mol/L山梨醇悬浮细胞；
(7)加入10μ L线形化质粒，在冰水中混勻5 min ；
(8)放入冰预冷的无菌电转化杯(0.2 cm)中，在1500 V，电击1_2次；
(9)加入1mL预冷的1 mol/L的山梨醇溶液；
(10)取上述100-200μ L涂布YNB平板(或离心涂布100 μ L)；
(11)28 0C -30 °〇倒置培养1-2天，挑选白色菌落。
实施例4 酵母工程菌的筛选 1、酵母工程菌的G418筛选
接种毕赤酵母GS115转化子于25 mL YPD液体培养基中，28°C _30°C振荡培养过夜，离 心收集菌体，无菌水悬浮，取100 μ L分别涂布于含G418终浓度为0. 5、1、2 mg/mL的YPD 平板培养基上，筛选阳性转化子。2、阳性重组质粒PCR验证(25 μ L体系)
体系重组质粒 0. 1 μ L，Buffer 2. 5 μ L，引物(20 mmol/L)各 2 μ L，dNTP (各 2. 5 mmol/L) 2 μ L，TagOM 聚合酶 0· 4 μ L, ddH20 18 μ L。反应条件94°C预变性4 min，变性94 °C 1 min、退火55°C 1 min、延伸 72°C Imin 35个循环，最后72°C延伸10 min。凝胶电泳验证。3、双酶切验证提取转化子质粒，进行EcoR I和Afco I双酶切，对产物进行电泳验 证。4、酵母工程菌的培养及诱导表达
(1)阳性转化子和空载体PPIC9K转化的毕赤酵母GS115分别接种于20mL YPD液体 培养基，30°C振荡培养过夜(稳定期)；
(2)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入100mL MGY培养基(加入1 mLlOOX生 物素)中；30°C，200 r/min振荡培养48 h ；
(3)离心收集菌体，生理盐水洗涤2次，转入30mL匪液体培养基(加入300 yL甲 醇，300 μ L100X生物素)中；30°C，200 r/min振荡培养7天；定时进行酶活测定。产物用 SDS-PAGE蛋白电泳分析。实施例5 发酵生产PVA脱氢酶
培养基组成种子培养基，蛋白胨15 g/L，酵母提取物8 g/L，葡萄糖15 g/L，氯化钠10 g/L ；发酵培养基，酵母氮源基础培养基12-15 g/L,生物素0. 0002-0. 0005 g/L,甲醇10-50 g/L ；微量元素溶液，MnSO4 ·4Η20 100 g/L, ZnCl2 70 g/L，Na2MoO4 · 2H20 35 g/L, H3BO3 60 g/ L, CoCl2 · 6H20 200 g/L, CuSO4 · 5H20 29 g/L, NiCl2 · 6H20 25 g/L, 37% 盐酸 0. 9 mL。培养方法种子培养，250mL三角瓶，装液量50mL，培养温度-30°C，摇床转速 200r/min，培养Mh ；发酵培养，离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量 接入装液量为50mL的三角瓶(500 mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200 r/min，发酵时 间3-4天，PVA脱氢酶0°权D活力可达110U/mL。实施例6 =PVA水溶液处理 种子培养基同实施例5。酵母工程菌接种于250mL三角瓶，装液量50mL的种子培养基，培养温度 280C -30°C，摇床转速200r/min，培养Mh。按5-10%的比例接入以PVA为唯一碳源的培养 基90小时，能将lg/L的PVA完全降解。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
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江南大学
一种产PVA脱氢酶的基因工程菌及其构建方法与应用 1
PatentIn version 3. 3 1
1901 DNA
人工合成序列
根据基因序列设计，用于基因表达。
〈400〉 1gaattctccggtaccgtggccgaaactgctcctcaatccggtcacgcagtaccagcagac60cagctggacggcgagactctgtacaaggcaCgttgtgCCgcttgccatgataacgctgaa120ggtcgtactccttctcgtgaggtactgtccaagaatccagcctccttcatcctggcttct180atgcgtactggcgctatggtcccaatggccgaaggtctgacgctggaagagatgactgct240attgcccgtgcagtcggcaaggcagatgctaaaactgacgatggtattgatctgcgtcgt300atttggggtaattccgtggaaggcactccactggacgctcctcagtgttcttctgcacct360acgcctgttgacctgggcgctgctaatcaatggaatggttggtctaccgaaaaggataat420ggccgttttcagcgtaaaccagccctggacgttgccgatatccctaagctgaaactgaag480tgggccttccaatacccaggttccaaaaacggtcaggccacggttatcggcgatcgtctg540ttcaccacttccacctctggtgctgtttacgccctgaacgcaaagactggttgtgtgtac600tggcgtcacgcagctgaaggtgccactcgtacttctccagtaatcgctgccctgcctgaa660ggcgccccagcaaaaactgcactgttcttttctgatttcaccaaggccgccgtagccctg720gatgctgaaacgggtaagcaactgtggaagactgttgtcgatgatcagccagctctgcaa780atgactggctctatcacctattgggatggcaaaatctatgtgcctatctcttccggtact840gaggccttcgctcaaattccaacttgggagtgttgcaaatttcgtggcgctctggttgct900ctggatgctgcaaccggcaagattctgtggaagcgttacactaccgagcaagagccacgt960ccttttaaactgaacaaagctggccgtcaaatgtggggtccatctggcggtgctatttgg1020gtcactccaacggtggacgaggcacgtcgtctgatttatgtcggcacgtccaactcctac1080actgacgttccatacgataattctgactccgtcatggccattgacgccgatactggtgct1140gttcgttggactgtccaactgctggctgacgacaactatattgacggttgttggcagaaa1200ggtaaagaacatgccaactgtccaaatcctctgggtcctgatttttccattggcgctgca1260ccaatttatcgtaaaatggctgatggtaaggagttcctgctggtgggtcaaaaatccggt1320atgatctacgctctggaccctgctaacaagggtgctaaaatttgggagcgtcagctgtct1380ctgggttctgCCCtgggtggcatcgaatttggtactgcagcagacgacggtaaagtttat1440gctggtgtctctgatattgcttctcaagctaaggatcgtggcaaacctggtctgtgggct1500ctggacatccgtactggtgaggtcgcttggaactttctgaacgctcctgacaccaagtgt1560cgttggaataactggtggtgccacggcgcattttcccaagctatttctgttattcctggt1620gcaatcttcg ccggttctta cgatggccat ttccgtgcct ttgacaccgc tactggtaag1680
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tctggttacg ctggtcgttc ttccgaatct ggtggccgtg atctgcgtgg cactgatggt1860
aatatcctga tggccttttc tgttgatggt aaggcggccg c190权利要求
1.一种产PVA脱氢酶的酵母工程菌，其特征在于染色体上携带有PVA脱氢酶基因。
2.权利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述PVA脱氢酶基因根据毕赤酵母密码 子偏好设计，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.权利要求1或2任一所述的酵母工程菌，其特在在于所述PVA脱氢酶基因位于表达 载体PPIC9K上。
4.一种权利要求1-3任一所述酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤 第一步根据酵母密码子偏好型设计PVA脱氢酶基因，克隆到中间载体；第二步克隆设计的PVA脱氢酶基因到表达载体PPIC9K ；第三步将所得的表达载体电击转化宿主毕赤酵母O0ZcAia pastor is GS115)，构建高 效表达PVA脱氢酶的组成型毕赤酵母工程菌。
5.权利要求1所述酵母工程菌在PVA脱氢酶生产中的应用。
6.权利要求1所述酵母工程菌处理PVA中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种产PVA脱氢酶(polyvinylalcoholdehydrogenase,EC1.1.99.23，简称PVADH)的基因工程菌及其构建方法与应用，属于遗传工程领域。本发明通过将优化后的PVA脱氢酶基因连接到毕赤酵母GS115(Pichiapastoris)染色体上，构建了一株高效分泌表达PVA脱氢酶的基因工程菌，解决了PVA脱氢酶产量低的问题。应用该菌种生产PVA脱氢酶，产量高达110U/mL，工艺简单、便于工业化应用。
文档编号C02F3/00GK102080054SQ20101058133
公开日2011年6月1日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者堵国成, 张东旭, 贾东旭, 陈坚 申请人:江南大学