专利名称：一株寡养单胞菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株寡养单胞菌及其应用。
背景技术：
Bt (Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性需氧型芽孢杆菌，在其芽孢形成 过程中，能产生一种以上的杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins)。2009年转 基因水稻获取农业部颁发的安全证书，这表明我国向转基因水稻商业化种植迈出了关键性 一步。但转Bt基因作物释放的毒蛋白进入土壤后，可能使Bt蛋白在土壤生态系统中富集， 影响土壤特异生物种群、功能类群以及土壤生物多样性和土壤生态过程。因此，迫切需要一 种高效安全的降解方法消除这类毒蛋白对生态环境及人类的潜在危害。目前，Bt蛋白失活和消除的方法主要有以下几种1、昆虫消耗即土壤中的Bt杀虫蛋白进入昆虫(包括靶标昆虫和非靶标昆虫)体 内后被降解，这种方法不能够降解转Bt植物在收割前后遗留在田间的植株残体中的Bt蛋 白；2、光照的作用Bt杀虫蛋白在阳光中紫外线的照射下降解而失效，但对转Bt植物 的植株残体降解效果有限；3、微生物降解利用土壤微生物降解Bt蛋白，该方法简便、经济、不会产生二次污 染，具有较好的开发应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株寡养单胞菌。本发明所提供的寡养单胞菌为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)FJSB3，其保 藏编号为 CGMCC No. 4344。寡养单胞菌(Stenotrophomonassp. )FJSB3CGMCC No. 4344 在降解抗虫蛋白中的 应用也属于本发明的保护范围。寡养单胞菌(Stenotrophomonassp. ) FJSB3CGMCC No. 4344 在降解转抗虫基因植 物中抗虫蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。寡养单胞菌(Stenotrophomonassp. ) FJSB3CGMCC No. 4344 在降解土壤中抗虫蛋 白中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种降解转抗虫基因植物中抗虫蛋白的方法。本发明所提供的降解转抗虫基因植物中抗虫蛋白的方法，包括如下步骤将寡养 单胞菌(Stenotrophomonas sp.)FJSB3CGMCC No. 4；344、转抗虫基因植物、氮源和水混合，得 到的混合物为发酵原料，再将所述发酵原料进行发酵，使所述转抗虫基因植物中的抗虫蛋 白被降解。上述降解方法中，所述寡养单胞菌Gtenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC No. 4344 与所述转抗虫基因植物的配比为(1. OX 108-2. OX 101°) CFU IOg或(8. 0X IO8-L 6X 101°)CFU IOg,具体为 1. 6 X IO10CFU IOg 或 8. 0 X IO8CFU IOg 或 4. 8 X IO9CFU 10g。上述降解方法中，所述发酵原料的碳氮比为67 1-20 1或25 1-55 1，具 体为 51 1、40 1 或 25 1。上述降解方法中，所述氮源为尿素。上述降解方法中，所述发酵的温度为30°C _37°C，具体为30°C或33°C或37°C。上述降解方法中，所述发酵原料的初始pH值为6. 5-7. 5，具体为6. 5或7. 0或7. 5。上述降解方法中，所述发酵的时间为4天-6天，具体为4天或5天或6天。上述降解方法中，所述转抗虫基因植物为转抗虫基因植物的秸秆。上述降解方法中，所述转抗虫基因植物为转抗虫基因水稻。本发明的最后一个目的是提供一种培养寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC No. 4344 的方法。本发明所提供的培养寡养单胞菌(Stenotrophomonassp. )FJSB3CGMCC No. 4344 的方法，包括如下步骤将寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC No. 4344接种 于培养基中，进行培养；每1升所述培养基由蛋白胨、牛肉膏、NaCl和水组成；所述蛋白胨在所述培养基 中的浓度为0. 5% -1. 5%，具体为0. 5%或或1. 5% ；所述牛肉膏在所述培养基中的浓 度为0. 2 % -0. 5 %，具体为0. 2 %或0. 3 %或0. 5 %，所述NaCl在所述培养基中的浓度为 0. 3% -0. 7%，具体为0. 3%或0. 5%或0. 7%，所述百分含量均为质量百分含量；所述培养 基的PH值为7. 2-7. 4，具体为7. 2或7. 3或7. 4。上述培养方法中，所述培养的温度为30°C 37°C，具体为30°C、33°C或37°C ；上述培养方法中，所述培养在振荡条件下进行，振荡速度为ISOrpm 200rpm，具 体为180rpm或190rpm或200rpm，旋转半径为20mm 26mm。上述培养方法中，所述培养的时间为16h 20h，具体为16h或18h或20h。实验证明，本发明的寡养单胞菌Gtenotrophomonas sp. ) FJSB3CGMCC Na 4344 可 降解纯Bt蛋白和降解转Bt水稻秸秆中的Bt蛋白。因此本发明菌株在土壤中Bt蛋白降解 和改良土壤环境领域中具有良好的应用前景。
图 1 为寡养单胞菌(Menotrophomonas sp. ) FJSB3CGMCC Na 4344 的具体形态。(扫 描电镜)图 2 为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCCNs 4344 的平板菌落形态。图 3 为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) FJSB3CGMCC Ns 4344 的鞭毛形态。(透 射电镜)图 4 为寡养单胞菌 Gtenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC Na 4344SDS-PAGE 对粗 Bt 蛋白的降解的结果图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
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实施例1、菌的分离与鉴定一、菌的分离2010年3月，在超净工作台中，将福建省农科院水稻所所取的土壤放在无菌蒸馏 水中振荡15min制备菌悬液，摇床转速为ISOrpm ；将菌悬液用无菌水倍比稀释后涂布在NA 培养基平板上，37°C条件下培养，约24h后，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上的若 干个不同的菌落置于NA液体培养基中，震荡培养20h。然后将离心上述发酵液得到的菌体 应用于降解粗Bt蛋白实验，从而筛选出对Bt蛋白降解能力最强的菌株，进行革兰氏染色。 染色具体过程如下在一块干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环挑取单菌落，轻轻在无 菌水中涂布均勻，待水分干燥后，载玻片于火焰上停留l_2s，以固定菌体；在菌体上滴加结 晶紫染色液Imin后，用清水冲洗，干燥后显微镜下观察。将得到的对Bt蛋白降解能力最强 的一株菌命名为FJSB3。NA液体培养基蛋白胨1%，牛肉膏0. 3%, NaCl 0. 5%，其余为水；所述百分含量 均为质量百分含量；NA固体培养基在NA液体培养基中加入琼脂(琼脂质量占液体培养基质量的 1.5% )，得到NA固体培养基。二、鉴定按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙 英等编著，北京科学出版社，2001. 中描述的方法，对菌株FJSB3进行形态特征、培养特 性和生理生化特性鉴定，具体结果如下(1)菌体的形态特征该菌株细胞呈直杆状，端生鞭毛，革兰氏阴性。菌株的具体形态如图1所示。菌的 鞭毛形态如图3所示。(2)培养特性菌落呈浅黄色、光滑、圆形、边缘整齐、菌落直径l_2mm、好氧、菌落软而湿润、质地 均勻容易挑取。该菌株的平板菌落培养形态见图2。(3)生理生化特性葡萄糖+ ；淀粉+ ；甲基红实验_ ；明胶水解+。注“ + ”表示阳性反应，“_”表示阴性反应。(4) 16S rDNA 试验以FJSB3的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长 度为1.51Λ的扩增产物，测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。测得的序列 如SEQ ID NO 1所示。根据Gen-Bank序列同源性比较，菌株FJSB3与Stenotrophomonas maltophiIia(GenBank 登录号 AJ293470. 1)同源性为 99 %，与 Menotrophomonas sp. (GenBank登录号AB200253. 1)同源性为99 %，初步判定该菌为寡养单胞菌属细菌 (Stenotrophomonas sp.)。基于以上特征，将菌株FJSB3鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)。该菌 株已于2010年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 4344。
实施例2、菌的培养方法I将寡养单胞菌Gtenotrophomonas sp. ) FJSB3CGMCC Na 4344 接种于液体培养基 I 中，在温度为37°C和转速为200rpm(旋转半径20mm)的条件下振荡培养20h，得到菌液，用 血球计数板计数菌液浓度。此培养条件下，菌液中菌的浓度为2. OX 109CFU/mL ；培养容器内 的所有物质记作菌液。1升液体培养基I由蛋白胨、牛肉膏、NaCl和水组成；蛋白胨在所述培养基中的浓 度为1 %，牛肉膏在所述培养基中的浓度为0.3%，NaCl在所述培养基中的浓度为0. 5 %，所 述百分含量均为质量百分含量；所述培养基的PH值为7. 4。方法II将寡养单胞菌Gtenotrophomonas sp. ) FJSB3CGMCC Na 4344 接种于液体培养基 II 中，在温度为30°C和转速为180rpm(旋转半径24mm)的条件下振荡培养16h，得到菌液，用 血球计数板计数菌液浓度。此培养条件下，菌液中菌的浓度为1. OX 10gCFU/mL ；培养容器内 的所有物质记作菌液。每1升液体培养基II由蛋白胨、牛肉膏、NaCl和水组成；蛋白胨在所述培养基中 的浓度为0. 5 %，牛肉膏在所述培养基中的浓度为0. 2%，NaCl在所述培养基中的浓度为 0. 3 %，所述百分含量均为质量百分含量；所述培养基的pH值为7. 2。方法III将寡养单胞菌Gtenotrophomonas sp. ) FJSB3CGMCC Ns 4；344 接种于液体培养基 III中，在温度为33°C和转速为190rpm(旋转半径^mm)的条件下振荡培养18h，得到菌液， 用血球计数板计数菌液浓度。此培养条件下，菌液中菌的浓度为6. 0 X 108CFU/mL ；培养容器 内的所有物质记作菌液。1升液体培养基III由蛋白胨、牛肉膏、NaCl和水组成；蛋白胨在所述培养基中 的浓度为1. 5 %，牛肉膏在所述培养基中的浓度为0. 5%，NaCl在所述培养基中的浓度为 0. 7%，所述百分含量均为质量百分含量；所述培养基的pH值为7. 3。实施例3、菌对粗抗虫(Bt)蛋白的降解苏云金芽胞杆菌蜡螟亚种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(简称ACCC)， 其编号为ACCC 10029。粗抗虫蛋白上清液的制备方法将苏云金芽孢杆菌接种到NB液体培养基中，在 37°C、200rpm摇床上液态培养48h。将500mL的苏云金芽孢杆菌液于5000rpm离心5min，取 沉淀，并向其中加入250mL的裂解液，在4°C冰箱中溶解孢晶混合物4h ；然后5000rpm离心 5min,用HAc将上清液调pH到抗虫杀虫蛋白的等电点4. 5沉降抗虫蛋白，置于4°C冰箱中沉 降晶体蛋白过夜。沉降后于4°C、11000rpm离心lOmin，收集沉淀，用无菌水洗涤沉淀两次， 即得粗提的抗虫蛋白。将粗提的抗虫蛋白溶解于IOOmL溶解液4h，即得粗抗虫蛋白溶液。NB液体培养基组成蛋白胨1%，牛肉膏0. 5%，NaCl 0. 5%，其余为水。裂解液 50mmol/L EDTA, 50mmol/L Nei2CO3, 3%巯基乙醇，pH9. 5。溶解液50mmol/L Na2CO3, Immo 1/L EDTA, ρΗΙΟ. 0。实验组取0. Iml实施例2方法I中得到的菌液置于1. 5ml离心管中，加入0. 9ml 粗Bt蛋白溶液，混合物的pH值为7. 0，37°C水浴锅中温浴4h。取50 μ 1温浴后溶液至Iml离心管，再加50 μ 1 2 X SDS凝胶上样缓冲液，摇勻，放入开水中加热5min，用移液枪取20 μ 1 进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果显示经电泳后粗Bt蛋白所对应的相对分子量为130kD的 条带消失。对照组不加菌液或加其它种菌的菌液，仅将1. Oml粗Bt蛋白上清液溶液置于 1.5ml离心管中，除此之外，其余步骤均与实验组相同。结果显示经电泳后粗Bt蛋白所对 应的相对分子量为130kD的条带依然存在。实验设3次重复，结果均一致，结果见图4。M 蛋白质Marker ；1 阴性对照(不加 菌液)；2、3、5为对照菌降解结果(2 :ZBS2 ；3 :ZBS7 ；5 =FJSY) 4 本发明菌株FJSB3降解结 果。为细菌，ZBS7为细菌，FJSY为酵母菌。以上实验结果表明，寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)FJSB3CGMCC NO. 4344对 粗Bt蛋白的降解能力很强。实施例4、菌对转抗虫基因水稻秸秆中抗虫蛋白的降解下述各种水稻秸秆降解实验中，尿素作为氮源添加，因为微生物生长需要一定的 碳氮比。检测抗虫(Bt)蛋白的ELISA试剂盒购自美国EnviroLogix公司。转抗虫基因水稻株系MSA(即转基因抗虫水稻株系MSA)在文献“刘雨芳，苏军，尤 民生，汪琼，胡斯琴，刘文海，赵士熙，王锋.转基因抗虫水稻对水稻害虫群落的影响[J].昆 虫学报，2005,48 ) =544-553. ”中公开过，公众可从中国农业科学院农产品加工研究所获得。本实施例中使用的水稻秸秆为转基因抗虫水稻株系MSA的秸秆。一、降解方法I实验组在超净工作台中，称取粉碎之后并过40目筛子的转基因抗虫水稻株系 MSA的秸秆粉10g，将其与40ml无菌水一起置于500ml三角瓶中，再向三角瓶中加入0. 04g 尿素和8ml菌液(菌液中菌浓度为2. OX 109CFU/ml)，所用的菌液按照实施例2中方法I制 备得到；初始发酵体系的碳氮比为51 1，在温度为30°C、初始发酵体系的pH值为7.0的 条件下发酵4d，得到发酵物(三角瓶内的所有物质记作发酵物)。将发酵物烘干至恒重，用 ELISA试剂盒检测烘干后发酵物中抗虫(Bt)蛋白的含量。实验设3次重复，结果取平均值。 结果测定Bt蛋白的含量为0. 130士0. 020 μ g/g发酵物，寡养单胞菌FJSB3对水稻秸秆中 Bt蛋白的降解率达到90. 10士0. 42%。使水稻秸秆中的Bt蛋白含量从1. 33士0. 23 μ g/g 禾吉秆降低到了 0. 130士0. 020 μ g/g烘干发酵物。对照组方法与实验组基本相同，不同的是不加入菌液。结果水稻秸秆中Bt蛋 白的降解率为6. 50 士 0.20%。二、降解方法II实验组与降解方法I中实验组方法基本相同，不同的是向三角瓶中加入8ml菌 液(菌液浓度为1. OX 108CFU/ml)，所用的菌液按照实施例2中方法II制备得到；加入0. Ig 尿素，使初始发酵体系的碳氮比为40 1;发酵温度为331，初始发酵体系的？!1值为6.5; 发酵5天。结果Bt蛋白的含量为0. 201 士0. 030μ g/g，寡养单胞菌FJSB3对Bt蛋白的降 解率达到88. 59 士 1. 77%，可使水稻秸秆中的Bt蛋白含量从1. 33 士 0. 23 μ g/g秸秆降低到 了 0.201 士 0. 030 μ g/g 烘干发酵物。
对照组方法与实验组基本相同，不同的是不加入菌液。结果水稻秸秆中Bt蛋 白的降解率为4. 90 士 0.58%。三、降解方法IIi实验组与降解方法I中实验组方法基本相同，不同的是向三角瓶中加入8ml菌 液(菌液浓度为6. OX 108CFU/ml)，所用的菌液按照实施例2中方法III制备得到；加入
0.23g尿素，使初始发酵体系的碳氮比为25 1 ；发酵温度为37°C，初始发酵体系的pH值 为7. 5 ；发酵6天。结果Bt蛋白的含量为0. 114士0. 018 μ g/g发酵物，寡养单胞菌FJSB3 对水稻秸秆中Bt蛋白的降解率达到91. 48士 1. 48% ；可使水稻秸秆中的Bt蛋白含量从
1.33 士 0. 23 μ g/g秸秆降低到了 0. 114 士 0. 018 μ g/g烘干发酵物。对照组与实验组方法基本相同，不同的是不加菌液。结果测定水稻秸秆中Bt 蛋白的含量为1. 216士0. 015 μ g/g发酵物，水稻秸秆中Bt蛋白的降解率为8. 61 士0. 01%。
权利要求
1.寡养单胞菌Gtenotrophomonas sp.) FJSB3，其保藏编号为 CGMCC No. 4344
2.寡养单胞菌Gtenotrophomonassp.) FJSB3CGMCC No. 4；344在降解抗虫蛋白中的应用；和/或，寡养单胞菌Gtenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC No. 4；344在降解转抗虫基因 植物中抗虫蛋白中的应用；和/或，寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC No. 4；344在降解土壤中抗虫 蛋白中的应用。
3.一种降解转抗虫基因植物中抗虫蛋白的方法，包括如下步骤将寡养单胞菌 (Stenotrophomonas sp.)FJSB3CGMCC No. 4344、转抗虫基因植物、氮源和水混合，得到的混 合物为发酵原料，再将所述发酵原料进行发酵，使所述转抗虫基因植物中的抗虫蛋白被降解。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.) FJSB3CGMCC No. 4344与所述转抗虫基因植物的配比为(1. OX 108_2· OX 101°) CFU IOg 或(8. O X IO8-L 6 X IO10) CFU IOg,具体为 1. 6 X IOiciCFU IOg 或 8. OX IO8CFU IOg 或 4. 8X IO9CFU =IOg0
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵原料的碳氮比为 67 1-20 1或25 1-55 1，具体为51 1,40 1或25 1 ；所述氮源为尿素。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为30°C-37 具体为30°C或33°C或37°C ；所述发酵原料的初始pH值为6. 5-7. 5，具体为6. 5或7. 0或 7. 5。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的时间为4天-6天， 具体为4天或5天或6天。
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述转抗虫基因植物为转抗虫 基因植物的秸秆；所述转抗虫基因植物为转抗虫基因水稻。
9.一种培养寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC No. 4；344 的方法，包括如 下步骤将寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.) FJSB3CGMCC No. 4344接种于培养基中，进 行培养；每1升所述培养基由蛋白胨、牛肉膏、NaCl和水组成；所述蛋白胨在所述培养基中 的浓度为0. 5% -1. 5%，具体为0. 5%或或1. 5% ；所述牛肉膏在所述培养基中的浓 度为0. 2% -0. 5%，具体为0. 2%或0. 3%或0. 5%，所述NaCl在所述培养基中的浓度为 0. 3% -0. 7%，具体为0. 3%或0. 5%或0. 7%，所述百分含量均为质量百分含量；所述培养 基的PH值为7. 2-7. 4，具体为7. 2或7. 3或7. 4。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述培养的温度为30°C 37°C，具体为 30°C、33°C或 370C ο
全文摘要
本发明公开了一株寡养单胞菌及其应用。本发明所提供的寡养单胞菌为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)FJSB3，其保藏编号为CGMCC No.4344。实验证明，本发明的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)FJSB3CGMCC№4344可降解纯Bt蛋白和降解转Bt水稻秸秆中的Bt蛋白。因此本发明菌株在土壤中Bt蛋白降解和改良土壤环境领域中具有良好的应用前景。
文档编号B09C1/10GK102115726SQ20101059227
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者刘阳, 赵辉欣, 邢福国 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所