专利名称：一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物技术处理领域，涉及一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用。
背景技术：
目前，畜禽养殖业集约化、规模化的快速发展，随之而带来的环境污染问题也越发严重。其中畜禽养殖废水中氮污染问题最为突出，多数养殖场废水中的氨氮都超标，超标率为80%以上，氮超标所引起水体的富营养化以及严重的生态环境污染已经成为世界性的问题。因此，对畜禽养殖废水中氮降解的研究，就显得尤为迫切。目前，在水污染环境处理方面微生物脱氮法与物理、化学法相比较，以它高效率、 低成本、无二次污染等不可比拟的优点已被人们所广泛认可，成为环境科学和水处理领域关注和研究的主要内容。同时硝化反硝化(Simultanous nitrification and denitrification，SND)可使硝化和反硝化反应在同一反应器内同时完成，节省反应空间，缩短反应时间，平衡了反应条件，还克服了传统生物脱氮的很多弊端，被认为是在废水生物脱氮中具有很大的研究价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用。本发明提供的嗜吡啶红球菌(Iihodococuus pyridinivorans)，命名为CPZ-24，分离自浙江萧山养猪场氧化塘的废水，已于2010年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为 CGMCC No. 4401。嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401简称嗜吡啶红球菌CPZ-M，是一种新型异养硝化好氧反硝化菌。嗜吡啶红球菌CPZ-M是采用极限稀释和GN显色培养基显色相结合的方法筛选得到的，具体筛选过程如下(1)通过多次富集培养含有氨氧化菌的最优富集液；(2)采用极限稀释筛选法从最优富集液中筛选异养硝化菌；(3)采用GN显色培养基显色的筛选方法筛选好氧反硝化菌；(4)对异养硝化好氧反硝化菌株进行分离纯化进行保藏。嗜吡啶红球菌CPZ-M可应用于水体脱氮。嗜吡啶红球菌CPZ-M可应用于废水脱氮。所述废水具体可为畜禽养殖废水。嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于制备废水处理菌剂。所述废水具体可为畜禽养殖废水。本发明还保护一种废水处理菌剂，它的活性成分为嗜吡啶红球菌CPZH所述废水具体可为畜禽养殖废水。
嗜吡啶红球菌CPZ-M可应用于富营养化水体处理。嗜吡啶红球菌CPZ-M可应用于制备富营养化水体处理菌剂。本发明还保护一种富营养化水体处理菌剂，它的活性成分为嗜吡啶红球菌 CPZ-M。本发明针对传统生物脱氮的弊端，提供了一株新功能菌，嗜吡啶红球菌CPZ-M。该菌具有异养硝化作用和好氧反硝化作用，且具有同步硝化反硝化功能，可独立高效完成脱氮的全过程。该菌在脱氮过程中，产生99%的气体为队，1%的气体为队0、而、NO2,利于环境保护。本发明为更有效、更经济、更快速地去除畜禽养殖废水中的氮提供了基础，对于治理水体富营养化，恢复健康的生态环境具有深远意义。
图1为未接菌的GN显色培养基。图2为接入嗜吡啶红球菌CPZ-M培养3天的GN显色培养基。图3为嗜吡啶红球菌CPZ-M的扫描电镜照片(8000 X)。图4为嗜吡啶红球菌CPZ-M的透射电镜照片(8000 X)。图5为嗜吡啶红球菌CPZ-M异养硝化生长曲线。图6为嗜吡啶红球菌CPZ-M异养硝化效果图。图7为嗜吡啶红球菌CPZ-M好养反硝化生长曲线。图8为嗜吡啶红球菌CPZ-M好养反硝化效果图。图9为嗜吡啶红球菌CPZ-M同步硝化反硝化功能实验的硝化产物曲线图。图10为嗜吡啶红球菌CPZ-M同步硝化反硝化功能实验的反硝化产物曲线图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。氨氮浓度的检测方法纳氏试剂光度法(GB 7479-87)。亚硝酸盐氮浓度的检测方法N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493-84)。硝酸盐氮浓度的检测方法紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)。总氮浓度的检测方法过硫酸钾氧化-紫外分光光度法(GB 11894-89)。N2 的检测采用 GC-TCD 方法；参考文献Su J. J.，Liu B. Y.，Chang Y. C.， 2001. Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere byThiosphaera pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2 newlyisolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatmentsystem. J Appl Microbiol. 90，457-462.N2O 的检测采用 GC-ECD 方法；参考文献=Su J. J.，Liu B. Y.，Chang Y. C.，2003. Emission of greenhouse gas from livestock waste and wastewater treatment inTaiwan. Agr. Ecosyst. Environ. 95,253-263.
NO的检测采用NOx分析仪(型号AP1200A，Riken keiki)测定；参考文献 Hung-SooJoo, Mitsuyo Hirai, Makoto Shoda,2006. Piggery wastewater treatment usingAlcaligenes faecalis strain No. 4 with heterotrophic nitrification and aerobicdenitrification. Water Research. 40,3031.NO2的检测采用NOx分析仪(型号AP1200A，Riken keiki)测定；参考文献 Hung-SooJoo, Mitsuyo Hirai, Makoto Shoda,2006. Piggery wastewater treatment usingAlcaligenes faecalis strain No. 4 with heterotrophic nitrification and aerobicdenitrification. Water Research. 40, 3031.细胞内的氮的检测方法参考文献Hung-Soo Joo，Mitsuyo Hirai, Makoto Shoda, 2006. Piggery wastewater treatment using Alcaligenes faecalis strain No. 4 withheterotrophic nitrification and aerobic denitrification. Water Research. 40, 3031.实施例1、嗜吡啶红球菌CPZ-M (异养硝化好氧反硝化菌)的分离和鉴定一、样品的采集实验样品为2008年4月取自浙江萧山养猪场氧化塘的废水。二、嗜吡啶红球菌CPZ-M的分离和筛选1、最优富集液的培养取IOmL水样接入相同的装有90mL已灭过菌的富集培养基中，于30°C、120r/min 摇床培养。经多次富集培养，通过格里斯试剂和二苯胺试剂检测样品中氨氧化菌的存在，并选取镜检下菌落大、数量多的作为最优富集液。富集培养基将(NH4)2SO4 0. 5g、琥珀酸2. 17g、维氏盐溶液50mL溶解后用蒸馏水定容至1L(固体培养基中加入琼脂，使其质量百分含量为2% )。维氏盐溶液将K2HPO4 · 3H20 6. 5g、MgSO4 · 7H20 2. 5g、NaCl 2. 5g、 FeSO4 · 7H200. 05g、MnSO4 · H2O 0. 04g 溶解后用蒸馏水定容至 IL02、异养硝化菌的筛选富集液中分别吸取ImL菌液，加入IOOmL新鲜液体异养硝化培养基中，30°C、120r/ min摇床培养2d。检测氨氮量，将氨氮降低的样品重复以上操作2次。对氨氮降低较明显的样品进行极限稀释，样品分别稀释105、IO6UO7倍，将稀释液移入IOOmL新鲜液体异养硝化培养基中，300C、120r/min摇床培养2d。检测其氨氮降低量，筛选出氨氮降低最多的样品进行多次纯种分离，采用平板涂布法和平板划线分离法进行多次纯种分离。异养硝化培养基将(NH4)2SO4 0. Mg、琥珀酸钠2. 81g、维氏盐溶液50mL溶解后用蒸馏水定容至1L(固体培养基中加入琼脂，使其质量百分含量为2% )。3、好氧反硝化菌的筛选将若干初筛菌再次进行氨氮和总氮降解率的测定，挑选出降解率较高的菌株。将其接种到GN显色培养基上，30°C培养Mh，能使GN培养基由绿色变成蓝色的菌株作为复筛菌，即为异养硝化好氧反硝化菌(见图1和图2)。GN显色培养基(ρΗ7· 0) =KNO3 1. Og，L-天冬酰胺1. Og，用酒精稀释的0. (质量百分含量)百里酚蓝(BTB) 5mL，柠檬酸钠 8. 5g，KH2PO4 1. Og，MgSO4 ·7Η20 1. Og，CaCl2 ·6Η20 0. 2g，FeCl3 · 6H20 0. 05g，溶解后用蒸馏水定容至IL0
4、异养硝化好氧反硝化菌株进行纯化、进行石蜡保藏。将筛选后的复筛菌种，经过多次的平板划线培养后得到不同的单个菌落，直至显微镜下检验无杂菌，即为纯化的菌株，将其命名为CPZ-M。将液体石蜡置于IOOmL的小锥形瓶内，塞上棉塞，外包牛皮纸，高压蒸汽灭菌， 121°C灭菌30min。灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于105 110°C的烘箱内lh，以除去液体石蜡的水分。将菌株CPZ-M接种至斜面培养基上。30°C培养箱内培养48h，使其充分生长。用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入到已长好的斜面上，使菌种CPZ-M与空气隔绝。将已注入液体石蜡的斜面培养物直立，置于4 5°C冰箱保存。三、嗜吡啶红球菌CPZ-M的鉴定1、形态学鉴定将菌株CPZ-M涂于平板上，获得单菌落，观察其菌落形态，用透射电镜和扫描电镜观察其菌体形态等。CPZ-M颜色为橙红色，菌体形态为杆状(见图3和图4)。2、生理生化鉴定依据《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定，结果见表1。表1 菌株CPZ14的生理生化特征
权利要求
1.嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24，其保藏编号为 CGMCCNo. 4401。
2.嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在水体脱氮中的应用。
3.嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在废水脱氮中的应用。
4.嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在制备废水处理菌剂中的应用。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述废水为畜禽养殖废水。
6.一种废水处理菌剂，它的活性成分为嗜吡啶红球菌(lihodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401。
7.如权利要求6所述的废水处理菌剂，其特征在于所述废水为畜禽养殖废水。
8.嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在富营养化水体处理中的应用。
9.一种富营养化水体处理菌剂，它的活性成分为嗜吡啶红球菌 (Rhodococuuspyridinivorans)CPZ-24CGMCC No. 4401。
10.嗜吡啶红球菌(Rhodococuuspyridinivorans) CPZ-24CGMCC No. 4401 在制备富营养化水体处理菌剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株异养硝化好氧反硝化的嗜吡啶红球菌及其应用。本发明提供的嗜吡啶红球菌(Rhodococuus pyridinivorans)，命名为CPZ-24，其保藏编号为CGMCC No.4401。该菌具有异养硝化作用和好氧反硝化作用，且具有同步硝化反硝化功能，可独立高效完成脱氮的全过程。该菌在脱氮过程中，产生99％的气体为N2，1％的气体为N2O、NO、NO2，利于环境保护。嗜吡啶红球菌CPZ-24可应用于水体脱氮、废水脱氮和富营养化水体处理。本发明为更有效、更经济、更快速地去除畜禽养殖废水中的氮提供了基础，对于治理水体富营养化，恢复健康的生态环境具有深远意义。
文档编号C02F3/34GK102154172SQ201110006790
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者李季, 王立刚, 王迎春, 陈昢圳 申请人:中国农业大学