一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法
【专利摘要】一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于步骤为：制备稻草秸秆基活性碳；将稻草秸秆基活性碳与种子菌液混合进行吸附直至吸附饱和，形成菌悬液；往上述菌悬液中加入30～40℃的已灭菌的海藻酸钠溶液，混匀后用注射器注入到一定浓度的CaCl2溶液分散成球，并交联12h～24h，得到固定化微生物微球；最后将得到的固定化微生物微球用生理盐水冲洗2～4遍，即为成品。本发明首次将生物基活性碳-改性稻草秸秆添加至海藻酸钠-氯化钙包埋固定化载体中，提高制剂的机械强度和传质性，提高了微生物的活性及降解效率；同时成本低、工艺简单易操作，反应条件温和，制得的修复剂微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量，对石油烃的降解率可达78-89%。
【专利说明】—种固定化微生物溢油修复剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于石油及石油产品污染的生物修复【技术领域】，具体是一种以海藻酸钠-氯化钙-稻草秸杆基活性炭为包埋固定化材料的固定化微生物溢油修复剂的制备方法，用于石油及石油产品污染海洋的微生物修复。
【背景技术】
[0002]随着海上石油开发和海上运输业的发展，由于井喷、运输船舶的石油泄漏、撞沉船以及输油管道的泄漏等造成的溢油事故频发。溢油事故发生后，虽经物理方法(如围栏回收等)、化学方法(喷洒消油剂等)可清除部分表面溢油，但残存的石油烃长期滞留在海洋环境中，对海洋生态系统及人体健康会造成巨大的持久性损害(Pelletier E，Delille D，Delille B.Crude oil bioremediation in sub-Antarctic intertidalsediments: chemistry and toxicity of oiled residues[J].Mar.Environ.Res.,2004,57(4):311-327.)。
[0003]目前石油污染的生物修复技术主要以微生物修复为主(夏文香，林海涛，张英，等.海上溢油的污染控制技术[J].青岛建筑工程学院学报，2004,25(1):54-57.)。国内外研究者发现在海水和淡水中生长有200多种烃类降解微生物，包括细菌、真菌及藻类，其密度及繁殖速度与水域 的油污染程度密切相关(Fingas M.The Basic of Oil SpillClean up (2ndedition) [M].USA:Lewis Publishers, 2001, 39-50.)。微生物治理技术是国际上公认的高效修复石油污染的新技术，基于微生物能适应各种复杂的生态环境，其繁殖代谢能力极强，能快速降解石油中各种有毒物质，而且具有价格低廉、环境友好等诸多优势(Harayama S, KasaiY, Hara A.Microbial communities in oil-contaminatedseawater [J].Curr.0pin.Biotechnol., 2004,15(3):205-214.)。米用该技术处理物理和化学方法无法清除的溢油是恢复生态环境的最佳途径，对保护我国海洋生态环境，维持海洋资源的可持续性发展具有重大的科学意义和应用价值。
[0004]自上世纪七十年代，加入适当的微生物治理石油污染就被认为是一个有力的策略(Atlas RM.Petroleum biodegradation and oil spill bioremediation[J].Mar.Pollut.Bull.，1995，31 (4-12):178-182.)，在野外试验中成功的例子如:1990年利用AlphaBioSea处理德克萨斯州海岸的原油泄漏，2000年利用Terra_zyme (TM)处理日本Nakhodka港口原油泄漏(MakiH, HirayamaN, HiwatariT, etal.Crude oil bioremediation fieldexperiment in the sea of Japan[J].Mar.Pollut.Bull., 2003, 47(1-6):74-77.),1989年夏到1991年应用投加营养剂和高效烃降解菌对阿拉斯加Exxon Valdez王子海湾由于油轮泄露造成的污染进行的处理等，取得了非常明显的效果(Atlad RM.Bioremediation ofPetroleum Pollutants[J].1nt.Biodeter.Biodegrad.，1995,35(3):317-327.)。
[0005]但是在海洋溢油微生物修复过程中，却存在着有效菌株流失严重，修复效率大巾畐度下降等问题(De-Bashan LE, Bashan Y.1mmobilized microalgae for removingpollutants:Review of practical aspects[J].Bioresour.Technol., 2010, 101(6):1611-1627.)。所以，针对海洋溢油修复所特有的处理环境，本专利采用微生物固定化技术。固定化微生物技术与其它生物修复技术相比，能够保持微生物高密度、高活性，减轻或消除微生物的流失，处理效率高，对环境的耐受力强，反应易控制，能够有效提高目标区域内海洋溢油污染微生物菌剂的修复效率(Takeno K, Yamaoka Y, Sasaki K.Treatment ofoil-containing sewage wastewater using immobilized photosynthetic bacteria[J].World J.Microbiol.Biotechnol.，2005，21(8-9):1385-1391.)。
[0006]包埋固定化技术作为固定化方法的一种，与吸附法、交联法、共价结合法等其他固定化技术相比，由于制备方法简单易操作，反应条件温和易实现，微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量(包木太，巩元娇，李一鸣.固定化微生物在降解含油污水中的作用[J].武汉大学学报(理学版)，2010，56 (I):109-144.)，固定化效率能达到70%以上，目前应用较广泛(张秀霞，秦丽姣，吴伟林，等.固定化原油降解菌的制备及其性能研究[J].环境工程学报，2010，4(3):659-664.)。海藻酸钠-CaCl2包埋与聚乙烯醇-H3BO3包埋是最常用的包埋固定化方法(Massalha N, BasheerS，Sabbah 1.Effect of adsorption and bead size of immobilized biomass on therate of biodegradation of phenol at high concentration levels[J].1nd.Eng.Chem.Res.，2007, 46(21):6820-6824.)。相对于海藻酸钠-CaCl2包埋法，聚乙烯醇-H3BO3制备的固定化制剂虽机械强度较高、使用寿命较长，但聚乙烯醇因附聚作用强而成球较为困难，且用于交联聚乙烯醇的饱和硼酸溶液对微生物的毒害大，会显著降低在固定化后微生物的活性。海藻酸钠-CaCl2包埋法虽反应条件温和，包埋材料对生物无毒害，包埋的细胞具有较高的活性，但制剂机械强度较低、传质性较差。
[0007]我国是一个农业大国，2006年的粮食产量达到了约5亿吨，伴随的各种农作物秸杆产量更是多达7亿多吨，除去将其用作燃料、建筑材料、饲料和肥料以及发电外，仍有60%无法有效利用而遭废弃，不但造成了大量的生物质能源浪费，也对环境造成了一定的影响。其中的稻草更是因为热值低、 营养含量低的原因不适于发电和用作饲料，稻草秸杆中所含的纤维素和半纤维素的质量分数约有70%，其中碳元素的质量分数更是达到38.54%，是优良的活性炭制备前驱体(韩彬，周美华，荣达.稻草秸杆活性炭的制备及其表征[J].农业环境科学学报，2009，28 (4):828-832.)。将稻草秸杆基活性碳加入到海藻酸钠_CaC12包埋法中，以提高制剂的机械强度，在国内外还未见报道。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种以海藻酸钠-氯化钙-稻草秸杆基活性炭为包埋固定化材料的固定化微生物溢油修复剂的制备方法，通过添加稻草秸杆基活性碳来提高制剂的机械强度和传质性，具有工艺简单、原材料成本低的特点。
[0009]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于以海藻酸钠-CaCl2-稻草秸杆基活性碳作为载体进行包埋，具体步骤为:
[0010]I)制备稻草秸杆基活性碳；
[0011]2)将适量的稻草秸杆基活性碳与种子菌液质量比1:2~1:5混合进行吸附，直至吸附饱和，形成菌悬液；[0012]3)往上述IOmL菌悬液中加入30~40°C的已灭菌的IOOmL海藻酸钠溶液(浓度为3wt%~4wt%)，混匀后，用注射器吸取并注入到500mL —定浓度的CaCl2溶液(浓度为3wt%~4wt%)中分散成球，交联12h~24h，得到固定化微生物微球；
[0013]4)最后将得到的固定化微生物微球用生理盐水冲洗2~4遍，即为成品。
[0014]作为改进，所述稻草秸杆基活性碳的制备过程为:
[0015]A、将原料稻草秸杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过25~35目筛，备用；
[0016]B、称取上述粉碎好的稻草秸杆，加入到质量分数为30-50%的氯化锌活化剂溶液(稻草基活性碳与氯化锌溶液的质量比为1:2~1:5)，搅拌混匀，将混匀的料液在室温下浸溃约0.5~1.5h ;
[0017]C、将浸溃好的料液放入马福炉中进行活化；
[0018]D、将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入盐酸溶液(11~13mol/L的浓盐酸与水体积比为1:8~10)中浸泡15-30min，再将样品用70~80°C热水洗涤至pH中性；
[0019]E、将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，在100~120°C烘3~5h，取出后放在干燥器中冷却；
[0020]F、将制得的活化后的样品粉碎过150~250目筛，制得稻草秸杆基活性碳。
[0021]作为改进，所述步骤C中活化温度为500~700°C，从室温升至所需活化温度的升温速率为40~60°C /min，保温30~90min。
[0022]作为优选，所述种子菌液是以短短芽孢杆菌D-1作为石油烃降解菌(种子菌液的浓度为 5 ~8.5 X 109cel 1/g)。
[0023]最后，所述使用海藻酸钠的浓度为3wt%~4wt%，CaCl2溶液浓度为3wt%~4wt%，稻草秸杆基活性碳所占固定化微球的质量百分比浓度为0.6-1.8%，所述固定化微生物溢油修复剂中包埋的微生物浓度为2X 107-5X 108cell/g。
[0024]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0025]1、首次将生物基活性碳一改性稻草秸杆添加至海藻酸钠一氯化钙包埋固定化载体中，提闻了提闻制剂的机械强度，且由于稻草稻杆基活性碳的多孔结构，可大大提闻其传质性，使营养物质更容易被微生物摄取，极大的提高了微生物的活性及降解效率。
[0026]2、改性稻草基活性碳与一般的活性碳相比，原料来源更为广泛，价格更为低廉，且使固定化微生物的性能更优。
[0027]3、制备方法简单易操作，反应条件温和，制得的修复剂微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量，对石油烃的降解率可达78-89%。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明的固定化微生物溢油修复剂的的制作工艺流程图；
[0029]图2是本发明的扫描电镜照片，其中a为稻草秸杆基活性碳扫描电镜照片，b为包埋固定化空白微球扫描电镜照片，c为包埋固定化微生物微球扫描电镜照片，d为包埋固定化微生物微球的外观照片(直径4-5mm)。
【具体实施方式】[0030]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0031]实施例子I
[0032]一种以海藻酸钠-氯化钙-稻草秸杆基活性炭为包埋固定化材料的固定化微生物溢油修复剂的制备方法，具体步骤为:
[0033]1、稻草秸杆基活性炭的制备
[0034]I)将原料稻草秸杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过30目筛，备用。
[0035]2)称取上述粉碎好的稻草秸杆，加入到质量分数为40%的氯化锌活化剂溶液(稻草基活性碳与氯化锌溶液的质量比为1:3)，搅拌混匀，将混匀的料液在室温下浸溃约Ih ；[0036]3)将浸溃好的料液放入高温马福炉中，从室温升至所需活化温度600°C，升温速率为 50°C /min,保温 60min。
[0037]4)将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入盐酸溶液(12mol/L的浓盐酸与水体积比为1:9)中浸泡20min，再将样品用70~80°C热水洗涤至pH中性。
[0038]5)将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，110°C烘4h，在干燥器中冷却。
[0039]6)将制得的活化后的样品粉碎过200目筛，制得稻草秸杆基活性碳，稻草秸杆基活性碳的扫描电镜照片见图2 (a)。
[0040]2.采用的石油烃降解菌
[0041]包埋用的石油烃降解菌为从某海洋样品中筛选出的菌种短短芽孢杆菌D-1，在盐度为25-35%。，温度为15-25°C，pH为7.5-8.5的环境中对原油(浓度l_5g/L)的降解率可达 35-55%。
[0042]3、包埋(工艺流程见图1)
[0043]I)将适量的稻草秸杆基活性碳与种子菌液质量比1:3混合进行吸附，直至吸附饱和，形成菌悬液；
[0044]2)往上述IOmL菌悬液中加入30~40°C的已灭菌的IOOmL海藻酸钠溶液(浓度为3wt%~4wt%)，混匀后，用注射器吸取并注入到500mL —定浓度的CaCl2溶液(浓度为3wt%~4wt%)中分散成球，交联12h~24h，得到固定化微生物微球；
[0045]3)将得到的固定化微生物微球用生理盐水冲洗3遍，即为成品；
[0046]4)最后将制得的固定化微生物溢油修复剂在O~4°C的条件下保存备用。
[0047]实施例子2
[0048]一种以海藻酸钠-氯化钙-稻草秸杆基活性炭为包埋固定化材料的固定化微生物溢油修复剂的制备方法，具体步骤为:
[0049]1、稻草秸杆基活性炭的制备
[0050]I)将原料稻草秸杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过30目筛，备用。
[0051]2)称取上述粉碎好的稻草秸杆，加入到质量分数为50%的氯化锌活化剂溶液(稻草基活性碳与氯化锌溶液的质量比为1:2)，搅拌混匀，将混匀的料液在室温下浸溃约
0.5h ；
[0052]3)将浸溃好的料液放入高温马福炉中，从室温升至所需活化温度500°C，升温速率为 50°C /min，保温 90min。
[0053]4)将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入盐酸溶液(13mol/L的浓盐酸与水体积比为1:10)中浸泡15min，再将样品用80°C热水洗涤至pH中性。[0054]5)将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，110°C烘4h，在干燥器中冷却。
[0055]6)将制得的活化后的样品粉碎过200目筛，制得稻草秸杆基活性碳，稻草秸杆基活性碳的扫描电镜照片见图2 (a)。
[0056]2.采用的石油烃降解菌
[0057]包埋用的石油烃降解菌为从某海洋样品中筛选出的菌种短短芽孢杆菌D-1，在盐度为25-35%。，温度为15-25°C，pH为7.5-8.5的环境中对原油(浓度l_5g/L)的降解率可达 35-55%。
[0058]3、包埋(工艺流程见图1)
[0059]I)将适量的稻草秸杆基活性碳与种子菌液质量比1:5混合进行吸附，直至吸附饱和，形成菌悬液；
[0060]2)往上述IOmL菌悬液中加入30~40°C的已灭菌的IOOmL海藻酸钠溶液(浓度为3wt%~4wt%)，混匀后，用注射器吸取并注入到500mL —定浓度的CaCl2溶液(浓度为3wt%~4wt%)中分散成 球,交联12h,得到固定化微生物微球；
[0061]3)将得到的固定化微生物微球用生理盐水冲洗4遍，即为成品；
[0062]4)最后将制得的固定化微生物溢油修复剂在O~4°C的条件下保存备用。
[0063]实施例子3
[0064]一种以海藻酸钠-氯化钙-稻草秸杆基活性炭为包埋固定化材料的固定化微生物溢油修复剂的制备方法，具体步骤为:
[0065]1、稻草秸杆基活性炭的制备
[0066]I)将原料稻草秸杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过30目筛，备用。
[0067]2)称取上述粉碎好的稻草秸杆，加入到质量分数为30%的氯化锌活化剂溶液(稻草基活性碳与氯化锌溶液的质量比为1:5)，搅拌混匀，将混匀的料液在室温下浸溃约
1.5h ；
[0068]3)将浸溃好的料液放入高温马福炉中，从室温升至所需活化温度700°C，升温速率为 50°C /min，保温 30min。
[0069]4)将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入盐酸溶液(llmol/L的浓盐酸与水体积比为1:8)中浸泡30min，再将样品用70°C热水洗涤至pH中性。
[0070]5)将洗涤好的样品放入电热鼓风烘箱中，110°C烘4h，在干燥器中冷却。
[0071]6)将制得的活化后的样品粉碎过200目筛，制得稻草秸杆基活性碳，稻草秸杆基活性碳的扫描电镜照片见图2 (a)。
[0072]2.采用的石油烃降解菌
[0073]包埋用的石油烃降解菌为从某海洋样品中筛选出的菌种短短芽孢杆菌D-1，在盐度为25-35%。，温度为15-25°C，pH为7.5-8.5的环境中对原油(浓度l_5g/L)的降解率可达 35-55%。
[0074]3、包埋(工艺流程见图1)
[0075]I)将适量的稻草秸杆基活性碳与种子菌液质量比1:2混合进行吸附，直至吸附饱和，形成菌悬液；
[0076]2)往上述IOmL菌悬液中加入30~40°C的已灭菌的IOOmL海藻酸钠溶液(浓度为3wt%~4wt%)，混匀后，用注射器吸取并注入到500mL —定浓度的CaCl2溶液(浓度为3wt%~4wt%)中分散成球，交联24h，得到固定化微生物微球；
[0077]3)将得到的固定化微生物微球用生理盐水冲洗2遍，即为成品；
[0078]4)最后将制得的固定化微生物溢油修复剂在O~4°C的条件下保存备用。
[0079]上述3个实施例子中包埋固定化微生物微球的扫描电镜照片见图2 (C)，外观照片见图2 (d)。经测试制得的固定化微生物溢油修复剂包埋的微生物浓度为6X 107-8X 108cell/g，在盐度为5-55%。，温度为10_30°C，pH为6.5-9.0的环境中对石油烃的降解率可达78-89%，与游离的微生物相比，其降解率提高33%-45%，且对环境的耐受性增强。
[0080]下面将本发明制得的固定化微生物微球与其他未添加改性稻草秸杆基活性碳的固定化微生物微球以及普通无机活性碳进行比较，比较结果如下表所示:
[0081]表1不同固定化微生物微球的性能比较
[0082]
【权利要求】
1.一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，其特征在于以海藻酸钠-CaCl2-稻草秸杆基活性碳作为载体进行包埋，具体步骤为: .1)制备稻草秸杆基活性碳； . 2)将适量的稻草秸杆基活性碳与种子菌液质量比1:2~1:5混合进行吸附，直至吸附饱和，形成菌悬液； . 3)往上述IOmL菌悬液中加入30~40°C的已灭菌的100mL、浓度为3(wt)%~4 (wt)%的海藻酸钠溶液，混匀后，用注射器吸取并注入到500mL、浓度为3(wt)%~4(wt)%的CaCl2溶液中分散成球，交联12h~24h，得到固定化微生物微球； . 4)最后将得到的固定化微生物微球用生理盐水冲洗2~4遍，即为成品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述稻草秸杆基活性碳的制备过程为: A、将原料稻草秸杆清理、筛拣、干燥、粉碎，过25~35目筛，备用； B、称取上述粉碎好的稻草秸杆，加入到质量分数为30-50%的氯化锌活化剂溶液，稻草基活性碳与氯化锌溶液的质量比为1:2~1:5，搅拌混匀，将混匀的料液在室温下浸溃约.0.5 ~1.5h ; C、将浸溃好的料液放入马福炉中进行活化； D、将活化好的样品从马福炉中取出，冷却后，将样品倒入11~13mol/L的浓盐酸与水体积比为1:8~10的盐酸溶液中浸泡15-30min，再将样品用70~80°C热水洗涤至pH中性。 E、将洗漆好的样品放入电热鼓风烘箱中，在100~120°C烘3~5h,取出后放在干燥器中冷却； F、将制得的活化后的样品粉碎过150~250目筛，制得稻草秸杆基活性碳。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤C中的活化温度为500~.700°C，从室温升至所需活化温度的升温速率为40~60°C /min，保温30~90min。
4.根据权利要求1所述种子菌液是以短短芽孢杆菌D-1作为石油烃降解菌，种子菌液的浓度为5~8.5X 109cell/g。
5.根据权利要求 1所述的制备方法，其特征在于所述使用海藻酸钠的浓度为3(wt)%~.4 (wt) %，CaCl2溶液浓度为3 (wt)%~4 (wt) %，稻草秸杆基活性碳所占固定化微球的质量百分比浓度为0.6 -1.8 %，所述固定化微生物溢油修复剂中包埋的微生物浓度为.2X 107-5X 108cell/g。
【文档编号】C02F103/08GK103923905SQ201310016817
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月16日 优先权日:2013年1月16日
【发明者】陈庆国, 刘梅, 胡海燕, 赵晟 申请人:浙江海洋学院