专利名称：一株低温氨氮降解菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株氨氮降解菌。
背景技术：
氨氮(NH3-N)以离子态氨(NH4+)和非离子态氨(NH3)两种形式存在于水中。传统生物去除水中氨氮的方法是在有氧的条件下利用自养型硝化细菌将水中NH3-N氧化成N03_-N，之后在缺氧的条件下利用异养型反硝化细菌将N03_-N还原成N2或N20。这种传统氨氮去除方式存在以下弊端:(I)上述反应需要在两个独立的缺氧和好氧环境条件下才能完成，在工艺中，需要建设有缺氧池和好氧池，增加了占地面积，并使运行维护更复杂；(2)硝化菌对环境条件敏感，最适生长温度20 30°C，15°C以下时，硝化速度下降，难以适应低温环境；(3)硝化细菌可将水中NH3-N转化为N02_-N和N03__N，如果工艺运行不当，会导致出水NO2--N含量升高，危害人体健康。除了上述传统意义上的自养硝化菌外，有些异养微生物也能进行硝化作用，这些菌株被定名为异养硝化菌。目前已分离出大量的异养型硝化菌，如Peseudomonas spp、Alcaligenes faecalis>Thiosphaera pantotropha、Thauera mechernichensis 等，石开究表明，异养硝化菌不但可在异养的条件下进行硝化作用，同时可在有氧的条件下进行反硝化，克服了传统生物脱氮技术需要缺氧、好氧两个环境体系及no2_-n含量易积累等问题。且异养型微生物具有生长速度快，适应性强等优点，使得异养硝化菌受到广泛关注。
发明内容
本发明目的是提供一株低温氨氮降解菌。一株低温氨氮降解菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.7487，保藏日期为2013年4月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为哈工大异养硝化不动细菌L16(Acinet0bacterHeteronitrifihit L16)。哈工大异养硝化不动细菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),菌株的形态特征:它属于短杆菌属，长为0.6 1.0iim,宽为1.2 1.8iim,无鞭毛；革兰氏染色阴性，但不易脱色；无芽孢；菌落圆形，光滑，凸起。哈工大异养硝化不动细菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),菌株的生理生化特征:它为专性好氧菌，可在2 35°C、pH6 8条件下生长；5°C，pH值7.2为最适生长条件，为嗜冷菌；接触酶阴性，氧化酶阴性，可进行硝酸盐的还原，可以乙酸钠为单一碳源进行生长，可利用糊精、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二塘、水 苏糖、D-棉籽糖、a-D-乳糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、果胶、D-半乳糖醛酸、6-磷酸-D-果糖、丙酸、丁酸钠、溴酸钠、L-氨基戊二酸、L-丝氨酸，可抵抗洁霉素，奈啶酸，褐霉素，亚碲酸钾，三乙酰竹桃霉素，万古霉素，氨曲南，四氮唑紫，二甲胺四环素；不能在5%以上NaCl溶液中生长。哈工大异养硝化不动细菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),菌株的分子生物学鉴定结果:16S rRNA序列GenBank注册号为KC843489，与其相近种属不动细菌的鲁菲不动杆菌(Acinetobacter Iwoffii)的相似性为98 %，应用DNA-DNA杂交方法，哈工大异养硝化不动细菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16)与鲁菲不动杆菌(Acinetobacter Iwoffii)进行杂交，同源杂交率为30.2%,为一新种细菌。本发明一株低温氨氮降解菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.7487，保藏日期为2013年4月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为哈工大异养硝化不动细菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16)。本发明一株低温氨氮降解菌，所属分类学“种”为一新种，哈工大异养硝化不动细菌L16 (Acinetoba cter Heteronitrifihit L16),为首次命名的分类学新菌种。G+C45mol%，Genbank 序列注册号为 KC843489。主要脂肪酸组成为 C12:_，C16:lu9c, C16:lu7c,
〇16:0，C18:lu9co本发明一株低温氨氮降解菌，它命名为哈工大异养硝化不动细菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16),进行低温饮用水氨氮降解,在菌株量达到IO7 IO9个/ml，以乙酸钠为碳源，降解30min后测定氨氮降解速率，发现在氨氮初始浓度为55.0mg/L时,氨氮降解速率最高,可达9.56mg NH4+/L h。当初始氨氮浓度为5.0mg/L时，用乙酸钠作为碳源，将C/N比为2，在温度2°C，pH值7.2，150rpm (溶解氧大于5mg/L)条件下，对氨氮降解30min后,测定氨氮降解速率，降解速率可达6.36mg NH4VL h。
图1为具体实施方式
一中哈工大异养硝化不动细菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16)的电子显微结构形态图。
具体实施例方式具体实施方式
一:本实施方式一株低温氨氮降解菌，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.7487，保藏日期为2013年4月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为哈工大异养硝化不动细菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16)。本实施方式中一株低温氨氮降解菌，它使用常规的分离、纯化和筛选方法获得，过程如下:取冬季松花江水样5ml,接种至50ml筛选培养基中，在2°C、150rpm/min下富集7 IOd,梯度稀释后,接种于固体培养基上,在2°C下培养3 5d,选取典型的单一菌落进行纯化培养，将最终获得的纯培养菌株进行氨氮降解试验，选取30min内对氨氮降解率达到50%以上的菌株。筛选培养基为:NH4Cl0.1 0.5g/L, CH3CH2ONa0.2 1.0g/L, MgSO4 7H200.01 0.05g/L, K2HPO40.05 0.2g/L, NaCl0.05 0.12g/L, MnSO4 4H200.0lg/L, FeSO40.0lg/L,维生素C0.002g/L, NADPH0.001g/L和余量的蒸馏水，pH值7.0 7.4。结果:所得到的菌，其菌体形态如图1所示，它属于短杆菌属，长为0.6 1.0y m，宽为1.2 1.8 y m，无鞭毛；革兰氏染色阴性，但不易脱色；无芽孢；菌落圆形，光滑，凸起；参照“常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2001.东秀珠，蔡妙英”进行生理生化特征测定；它为专性好氧菌，可在2 35°C、pH6 8条件下生长；5°C，pH值7.2为最适生长条件，为嗜冷菌；接触酶阴性，氧化酶阴性，可进行硝酸盐的还原，可以乙酸钠为单一碳源进行生长，可利用糊精、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二塘、水苏糖、D-棉籽糖、a-D-乳糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、果胶、D-半乳糖醛酸、6-磷酸-D-果糖、丙酸、丁酸钠、溴酸钠、L-氨基戊二酸、L-丝氨酸，可抵抗洁霉素，奈啶酸，褐霉素，亚碲酸钾，三乙酰竹桃霉素，万古霉素，氨曲南，四氮唑紫，二甲胺四环素；不能在5%以上NaCl溶液中生长。所得到的菌进行分子生物学鉴定:16S rDNA测序方法，提取细菌基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增，用于扩增的PCR反应引物为通用引物:正向引物5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ’ ；反向引物 5 ’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ’。PCR 反应体系如下:模板DNA50 100ng，25iiL Taq酶混合液，0.5 y L正向引物，0.5 y L反向引物，加入无菌去离子水至50 u L0 PCR扩增条件:94°C预变形5min，之后94°C变性lmin，50 55°C扩增lmin，72°C延伸1.5min，经过30次循环后，72°C延伸5min。将获得片段用于测序。参见 SEQ ID No:3。结果:16S rRNA序列GenBank注册号为KC843489，与其相近种属不动细菌的鲁菲不动杆菌(Acinetobacter Iwoffii)的相似性为98 %，应用DNA-DNA杂交方法“具体参照文献方法(常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2001.东秀珠，蔡妙英.)”，哈工大异养硝化不动细菌L16 (Acinetobacter Heteronitrifihit L16)与鲁菲不动杆菌(Acinetobacter Iwoffii)进行杂交，同源杂交率为30.2%,为一新种细菌。
—株低温氨氮降解菌，它为哈工大异养硝化不动细菌L16 (AcinetobacterHeteronitrifihit L16),低温饮用水氨氮降解工艺:将哈工大异养硝化不动细菌L16培养至IO7 IO9个/ml，取50ml在6000g离心IOmin获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2 3次，将菌体转入50ml、氨氮浓度为55.0mg/L的降解溶液中，用乙酸钠作为碳源，降解30min后测定氨氮降解速率，发现在氨氮初始浓度为55.0mg/L时,氨氮降解速率可达9.56mg NH4VL h。当初始氨氮浓度为
5.0mg/L时，用乙酸钠作为碳源，C/N比为2，在温度2°C，pH值7.2，150rpm (溶解氧大于5mg/L)条件下，对氨氮降解30min后,测定氨氮降解速率，降解速率可达6.36mgNH4+/L h ；可见，哈工大异养硝化不动细菌L16的降解时间仅为30min，更符合在饮用水处理工艺中，微生物的降解时间(20 40min)，能够满足饮用水处理的时间要求。
权利要求
1.一株低温氨氮降解菌，其特征在于它已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.7487，保藏日期为2013年4月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路I号院3号，它命名为哈工大异养硝化不动细菌L16 (AcinetobacterHete ronitrifihit L16)。
全文摘要
一株低温氨氮降解菌，它涉及一株氨氮降解菌。一株氨氮降解菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7487，保藏日期为2013.4.18，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，它命名为哈工大异养硝化不动细菌L16(Acinetobacter Heteronitrifihit L16)。本发明哈工大异养硝化不动细菌L16进行低温饮用水氨氮降解，在菌株量达到107～109个/ml，初始氨氮浓度为5.0mg/L时，用乙酸钠作为碳源，C/N比为2，在温度2℃，pH值7.2，150rpm(溶解氧大于5mg/L)条件下，对氨氮降解30min后，降解速率可达6.36mg NH4+/L·h。
文档编号C02F3/34GK103243050SQ20131019204
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月22日 优先权日2013年5月22日
发明者李伟光, 黄晓飞, 张多英, 秦雯 申请人:哈尔滨工业大学