去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用。一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂，其特征在于：所述的酶制剂为水溶液或缓冲溶液，包含一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，以及终浓度为0.1-0.3mM的CaCl2，反应体系pH值为6.5-8.0。酶制剂为缓冲溶液时，该缓冲溶液一般为pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。所述的邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量为0.03-0.1mg/mL。本发明的酶制剂通过优选添加金属化合物，使得本发明的酶制剂酶活高，降解ONBA效果优异；所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制备，成本低，有利于大规模推广；采用酶法降解ONBA，不仅效果好，且操作简单、安全、所需反应条件温和，不形成二次污染。
【专利说明】去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用【技术领域】
[0001]本发明属于酶基因工程及酶工程领域，涉及ー种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂及应用。
【背景技术】
[0002]随着我国エ业化进程的加快，有机エ业合成废水的排放量越来越大。有机エ业合成废水是指在生产过程中排放的含有对生物体有毒的エ业废水，这类废水不仅含大量有机物，且存在大量对生物体有毒害作用的物质，已对环境造成了严重的污染，威胁到人类生命健康。參照急性毒性分级标准，邻硝基苯甲醛(o-nitix)benZaldehyde，ONBA)为中等毒性化合物。ONBA是重要的精细有机化工中间体，广泛用于医药、染料和有机合成，如用于合成抗心绞痛药物硝基吡啶(心痛定)、邻硝基苯乙烯类及邻硝基肉桂酸类系列产品等。将其硝基还原成氨基后，所得到的邻氨基苯甲醛还可用于喹啉类化合物的合成，其エ业需求量十分大。但由于其生产过程伴随着大量污染物质的产生，发达国家已将其生产线转移到发展中国家(污染转移)，这ー点在我国东南部地区尤为明显。具不完全统计，东南地区年产邻硝基苯甲醛在70万吨以上，且绝大多数生产废水未经处理就直接排放，对周边环境造成了极大的损害。在一定程度上，可以说这一点源污染已成为面源污染。
[0003]硝基芳香化合物的去除主要有物理法、化学法和微生物降解法三种。物理和化学方法虽然能够有效去除此类物质，但成本高，需要特制的仪器和装备，且酸、碱易腐蚀，具有一定的危险性。实际上，硝基芳香化合物在环境中的降解和转化主要是由微生物完成的(微生物对其的代谢多通过一系列酶促反应完成)。因此，如何充分利用好功能微生物资源，去除特异性污染物，成为了修复相关环境的迫切需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供ー种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂。
[0005]本发明的另ー目的是提供该酶制剂的应用。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0007]—种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂，其特征在干:所述的酶制剂为水溶液或缓冲溶液，包含一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及终浓度为
0.1-0.3mM的CaCl2,反应体系pH值为6.5-8.0。酶制剂为缓冲溶液吋，该缓冲溶液一般为pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液。所述的邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量为0.03-0.lmg/mL。进ー步的，所述的CaCl2终浓度为0.2mM。
[0008]一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂的制备方法，其特征在于:取纯化酶液样本20mL和氯化钙，用pH值7.5的80mM磷酸钠缓冲液定容至IL制成酶制剂，酶制剂中氯化钙的终浓度为 0.1-0.3mM.
[0009]所述纯化酶液样本的制备方法如下:所述纯化酶液样本的制备方法如下:挑取含有重组质粒的菌株，该重组质粒上含有nbaA基因编码片段，用LB培养基于37°C培养，待A600nm值为0.6吋，加入IPTG至终浓度ImM，随后于20°C过夜表达；离心收集细胞，重悬于80mM pH7.5的磷酸钠缓冲液，在冰水浴中超声破碎细胞——功率为400W超声波破碎5s，暂停15s，共进行60个循环；随后，于4°C，1000Og离心30min去除细胞碎片，上清液即为粗酶提取液；使用ー站式组氨酸标签蛋白纯化试剂盒对所述粗酶提取液进行纯化，获得纯化酶液样本。
[0010] 所述的酶制剂在降解土壌中邻硝基苯甲醛中的应用。应用所述酶制剂降解土壌中邻硝基苯甲醛时，体系温度为18-40°c，pH为6.0-8.5。
[0011]本发明通过克隆Pseudomonas sp.0NBA-17中负责ONBA降解的脱氢酶基因并表达，获得了 ONBA降解酶，为ONBA的降解提供有效的生物降解手段，对于ONBA污染环境的修复具有重要意义。该菌是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2曰在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.8095。保藏単位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为假单胞菌 Pseudomonas sp.。
[0012]本发明采用的NbaA酶对ONBA的酶活力为2442U/mg，分别是NahF酶活力(552U/mg)和NahV酶活力(245U/mg)的442.4%和996.7 %，显著强于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分别为62%和89%。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最終致使酶作用能力产生差异。
[0013]本发明酶制剂的有益效果主要体现在以下几个方面:
[0014](I)通过优选添加金属化合物，使得本发明的酶制剂酶活高，降解ONBA效果优异；
[0015](2)本发明的酶制剂，所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制备，成本低，有利于大规模推广；
[0016](3)本发明的酶制剂，采用酶法降解0NBA，不仅效果好，且操作简单、安全、所需反应条件温和，不形成二次污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA(Genomic DNA)电泳检测图。
[0018]图2是pH值对NbaA酶活力的影响图。
[0019]图3是不同处理土壤样品中ONBA含量变化曲线。
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进ー步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0021]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量単位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
[0022]实施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA (Genomic DNA)的提取
[0023]1.1Pseudomonas sp.0NBA-17 的扩大培养
[0024]在无菌操作环境下，将_70°C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接种针挑取小块，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固体培养基之上。28°C，静置培养3d。挑选单菌落，经2次转接，观察发现平板上菌落形态一致(无杂菌)。这里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固体/液体培养基等均为微生物研究/生产领域常见术语、培养基、技术和方法，具体參见《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，等著.分子克隆实验指南(第三版)[M].黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008)。下文中如无特别备注或说明，均为微生物研究常用技术、方法、培养基、试剂和药品，且均在《分子克隆实验指南》中有所记录。
[0025]1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA 的提取
[0026]菌体总DNA的提取采用SDS高盐沉淀法。挑取LB平板上的单菌落，接至1OOmL的LB液体培养基培养至稳定期。离心收集菌体，加等体积的TEN溶液[IOmMTris-Cl (pH8.0), ImM EDTA(pH8.0),0.1M NaCl]洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于 IOmLTE [IOmM Tris-Cl (pH8.0), ImM EDTA (pH8.0)]溶液中，加入 100 y L 溶菌酶(100mg/mL)，37°C水1h，加入 40 ii L 蛋白酶 K(20mg/mL)，再加入 300 u L20% (w/v% )的 SDS，37°C水浴过夜(约12h)。加入1/2体积饱和NaCl剧烈振荡，12000g离心IOmin,上清用等体积酚:氯仿抽提2次，12000g离心lOmin，收集上清，加入等体积TE溶液(稀释调整NaCl浓度)，0.6倍体积异丙醇沉淀，12000g离心15min，70% (v/v% )こ醇洗涤沉淀，こ醇挥发后溶于1OOu L TE 中。
[0027]将提取到的菌体总DNA适当稀释后，经0.75% (w/v% )琼脂糖电泳检测其质量(如图1所示)，发现所提取的总DNA大部分集中在23kb左右，基本上没有RNA存在，纯度较好，浓度较高。
[0028]实施例20NBA降解酶编码基因nbaA的获得
[0029]经过大量的分析实验，从40对自行设计的引物中筛选出一对有效扩增引物(分别记为 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)。
[0030]nbaA-f，5’ -ACGACCATATGAAGGTACAACTGGTGAT-3?(下划线为 NdeI 酶切位点，基因序列为 SEQ ID N0.3)；
[0031 ] nbaA-r，5 ’ -CATCAAAGCTTGAAGGGATAAGGCTGGCC-3 ’(下划线为 HindII I 酶切位点，基因序列为SEQ ID N0.4)。
[0032]25 ii L 扩增体系:10 X Taq DNA 聚合酶反应缓冲液 2.5 y L ;dNTP (25mM) 2 y L ;引物(25pmol/ ii L)各 0.5 ii L ；Mg2+ 缓冲液(25mM) 2.5 u L ;实施例1 中所得总 DNA0.5 y L (1OOng) ;Taq 酶(5U/u L)0.3u L ；ddH2016.2 u L0 反应參数:95 °C 预变性 5min，94 °C 变性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸lmin，扩增25个循环，最后72°C终延伸5min。
[0033]扩增产物经0.75% (w/v% )琼脂糖电泳检测，发现扩增片段与预期大小(1.4kb左右)相符。切取含有nbaA基因扩增片段的凝胶，放入无菌1.5mL离心管中称重，使用B10MIGA胶回收纯化试剂盒进行目的片段回收，4°C保存备用。
[0034]參照《分子克隆实验指南》，用Nde I和HindIII消化上述回收片段，再将片段插入到用上述同种内切酶消化过的pET21b(+)载体中。挑取质粒，经琼脂糖凝胶电泳验证插入片段后，挑取克隆子交上海生エ测序。所得nbaA编码基因序列如SEQ ID N0.2所示(由1446个核苷酸组成)，其相应氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(482个氨基酸组成)。基因序列比对先是登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，再经BLAST搜索引擎搜寻GenBank完成。结果显示，同nbaA编码基因序列同源的功能基因最高序列同源性仅为90% (GQ848198.1)，且GQ848198.1指代基因未见其关于ONBA降解的报道。而同NbaA氨基酸序列同源的蛋白(水杨醛脱氢酶，YP_006536128.1)最高序列同源性不足90 %，且YP_006536128.1指代蛋白未见其关于ONBA降解的报道。
[0035]实施例3表达载体的构建、表达与纯化
[0036]用NdeI和HindIII消化上述实施例2中的nbaA基因扩增产物，再将片段插入到用上述同种内切酶消化过的pET21b(+)载体中。在重组质粒中，nbaA基因由17启动子启动，表达产物C端带有6个组氨酸标签，氨苄青霉素为筛选标记。联入片段经上海生エ测序验证，以确保PCR过程中没有引入突变。
[0037]重组质粒转入Escherichia coli BL21 (DE3),随后挑取含有重组质粒的的菌株(编号为K-7)，经上海生エ测序验证外源基因导入情况，证实外源基因导入成功。
[0038]K-7用LB培养基于37°C培养，待A6tltol值为0.6时，加入IPTG至终浓度ImM，随后于20°C过夜表达，以避免包涵体产生。离心收集细胞，重悬于80mM的磷酸钠缓冲液(pH7.5)，在冰水浴中超声(功率为400W)破碎细胞——超声波破碎5s，暂停15s，共进行60个循环。随后，于4°C，10000g离心30min去除细胞碎片。上清液即为粗酶提取液，低温保存。该步骤实验进行同时，设置未转入重组质粒的E.coli BL2KDE3)作为对照，并同样进行诱导、离心、破碎和收集粗酶提取液等步骤。
[0039]使用ー站式组氨酸标签蛋白纯化试剂盒(N1-NTA Spin Kit, QIAGEN)对上述粗酶提取液进行纯化，获得纯化酶液样本(其中邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量为3.5mg/mL)，所有操作均在低温环境下进行。
[0040]实施例4NbaA蛋白对ONBA的作用效果
[0041]參照赵化冰等人研究(赵化冰，李永君，陈威，蔡宝立.恶臭假单胞菌ND6菌株中与萘降解相关的新型水杨醛脱氢酶NahV.科学通报，2007，52:1257-1262)，采用上述实施例3中的纯化酶液样本，向0.5mL的反应体系(含80mM的磷酸钠缓冲液，200 y M的NAD+，pH7.5，25°C)中加入终浓度为200iiM的ONBA作为反应底物，并测定NbaA酶活力。一个酶活力単位(U)定义为:25て条件下，毎分钟还原Iymol NAD+所需的酶量。比活力表示为每毫克蛋白的酶活力单位。蛋白浓度以牛血清白蛋白作为标准參照，通过Bradford法測定。ONBA含量测定參照Yu等人报道进行(Yu Fang-Bo, Shen Biao, Li Shun-Peng.1solation and characterization of Pseudomonas sp.strain ONBA-17degradmgo-nitriobenzaldehyde.Current Microbiology，2006，53:457-461)。
[0042]结果显示，上述纯化酶液样本对ONBA的酶活力为2442U/mg (该值为5次实验重复的平均值，标准偏差为5.6U/mg)，对照(实施例3中提到的未转入重组质粒E.coli BL21的粗酶提取纯化物)无ONBA降解能力，这也进一步证实了实施例2中所得基因片段的功能作用。较已有报道，本发明得到的NbaA酶活力分别是NahF酶活力(552U/mg)(该值为5次实验重复的平均值，标准偏差为4.2U/mg)和NahV酶活力(245U/mg)(该值为5次实验重复的平均值，标准偏差为3.6U/mg)的442.4%和996.7%，显著强于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分别为62%和89%。由上可知，基因序列的不同引发了酶的空间构象的差异，并最終致使酶作用能力产生差异。
[0043]将纯化酶液样本在50°C水浴30min后，再通过上述方法测定酶活力。结果表明，在较高温度下NbaA比NahF和NahV更稳定。在50°C保温30min后，NbaA仍保持了 88.4%的酶活力(该值为4次实验重复的平均值，标准偏差为0.6% )，而NahF和NahV仅保存了71.4% (该值为4次实验重复的平均值，标准偏差为0.7% )和11.2% (该值为4次实验重复的平均值，标准偏差为0.2%)的酶活力，差异显著。
[0044]实施例5反应体系pH对酶活性的影响
[0045]參照实施例4准备反应体系,缓冲液仍为80mM的磷酸钠缓冲液(测试pH值分设
5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，以 200 ii M 的 ONBA 为底物，并添加实施例 3 和 4 中提及的纯化酶液样本，结果如图2所示。由图2可知，当反应体系pH值介于6.5和8.0之间时，酶活力保持在较高水平(较高水平指最大酶活性的75%及以上)。
[0046]实施例6添加金属化合物对酶活性的影响
[0047]參照实施例4和5准备反应体系，缓冲液为80mM的磷酸钠缓冲液(pH值7.5)，以200 ii M的ONBA为底物，添加实施例3、4和5中提及的纯化酶液样本，以及终浓度为0.2mM的易溶于水的金属化合物(测试金属离子包括:氯化锂、氯化钙、硝酸银、氯化镍、氯化锌、氯化镉、氯化铜、氯化亚铁、氯化钡和氯化钴)。同吋，设置不添加上述测试金属化合物的处理作为对照。结果如表1所示，镍、银、锂、铜和钴离子对酶活有明显的抑制作用，锌、亚鉄、钡和镉离子对酶活力影响不显著，钙离子添加可使酶活力较对照提高44%，达显著差异水平。
[0048]表1、金属离子对酶活力的影响
【权利要求】
1.一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂，其特征在于:所述的酶制剂为水溶液或缓冲溶液，包含一种邻硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及终浓度为0.1-0.3mM 的 CaCl2,反应体系 pH 值为 6.5-8.0。
2.根据权利要求1所述的酶制剂，其特征在于:所述的邻硝基苯甲醛降解酶的纯酶含量为 0.03-0.lmg/mL。
3.权利要求1所述的酶制剂，其特征在于:所述的CaCl2终浓度为0.2mM。
4.一种去除邻硝基苯甲醛的酶制剂的制备方法，其特征在于:取纯化酶液样本20mL和氯化钙，用pH值7.5的80mM磷酸钠缓冲液定容至IL制成酶制剂，酶制剂中氯化钙的终浓度为 0.1-0.3mM0
5.根据权利要求1所述的酶制剂的制备方法，其特征在于:所述纯化酶液样本的制备方法如下:挑取含有重组质粒的菌株，该重组质粒上含有nbaA基因编码片段，用LB培养基于37°C培养，待A6tltlnm值为0.6时，加入IPTG至终浓度1mm，随后于20°C过夜表达；离心收集细胞，重悬于80mM pH7.5的磷酸钠缓冲液，在冰水浴中超声破碎细胞——功率为400W超声波破碎5s，暂停15s，共进行60个循环；随后，于4°C，1000Og离心30min去除细胞碎片，上清液即为粗酶提取液；使用ー站式组氨酸标签蛋白纯化试剂盒对所述粗酶提取液进行纯化，获得纯化酶液样本。
6.一种权利要求1所述的酶制剂在降解土壌中邻硝基苯甲醛中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:应用权利要求1所述酶制剂降解土壌中邻硝基苯甲醛时，体系温度为18-40°C，pH为6.0-8.5。
【文档编号】B09C1/10GK103497936SQ201310454298
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】虞方伯, 管莉菠, 单胜道, 骆林平 申请人:浙江农林大学