一种高效降解烟嘧磺隆的枯草芽胞杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种高效降解烟嘧磺隆的枯草芽胞杆菌及其在土壤修复中的应用。本发明所述枯草芽胞杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.8437。本发明涉及的枯草芽胞杆菌能够在短时间内将烟嘧磺隆完全降解，不污染环境，生态安全，是一株在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中有较高应用价值的菌株，具备实际应用意义和价值。
【专利说明】一种高效降解烟嘧磺隆的枯草芽胞杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物和环境保护领域，特别是涉及枯草芽胞杆菌在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中的应用。
【背景技术】
[0002]磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量最大的一类除草剂，它是由美国杜邦公司于20世纪70年代研究成功，并于1982年首次开发出麦田除草剂氯磺隆，之后又开发出许多的高效、广谱、低毒、高选择性磺酰脲类除草剂。此类除草剂作用于植物的乙酰乳酸合成酶(ALS)，导致无法合成支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)，从而使细胞受到抑制，对许多一年生或多年生杂草有特效，广泛应用于防除稻田、大豆田、玉米田、麦类作物田、油菜田、草坪和其他非耕地杂草。由于该类除草剂对哺乳动物具有低的毒性，使用量很低，除草活性高等优点，在世界范围内普遍应用。不仅如此，磺酰脲之所以快速发展并被很好接受的原因还在于其与环境相容性好，该类除草剂应用面积在不断扩大，新的品种也不断产生，至今已有几十个品种被商品化。我国目前广泛应用的磺酰脲类除草剂品种主要有吡嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、苄嘧磺隆等，能防除大多数禾本科和阔叶杂草。
[0003]磺酰脲类除草剂自问世以来，为世界的农业生产作出了巨大的贡献，由于其具有极高的残留活性和选择性，在其使用过程中已遇到一些难题，最突出的就是对后茬作物的长残留药害问题，由于该类除草剂的迁移淋溶性较弱，当其残留达到一定剂量后就会对后茬作物造成药害。烟嘧磺隆、绿磺隆、甲磺隆已成为我国长残效除草剂品种。该类除草剂具有选择性强、生物活性高的优点，但其对不同作物的敏感性差异很大，例如在土壤中残留的氯磺隆和甲黄隆就很容易对后茬敏感作物产生药害。
[0004]农药在防治病虫害中发挥着重要的作用，随着农药的大量使用，农药特别是化学农药在其生产、运输、贮存、使用过程中对`环境造成的污染也越来越严重。微生物的资源丰富、处理相对简单、容易进行筛选诱变和通过转基因技术构建高效能新菌株或者通过降解酶系统及降解酶的固定化可更有效的处理农药污染。农药的微生物降解研究开始于20世纪40年代末，60年代中后期由于大规模化学农药的使用带来了日益严重的环境污染问题，农药的微生物降解研究越来越受到重视。本课题组研究人员对除草剂、杀虫剂、杀菌剂、杀线虫剂的微生物降解进行了深入细致的研究，通过近几年研究工作，已经确定了土壤和水环境的农药降解中微生物起了主要作用，分离到一批能降解或转化某种农药的微生物类群，在实践生产及环境保护中具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种新的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)菌株，所述菌株对磺酰脲类除草剂有明显的降解作用。
[0006]本发明所述的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)于2013年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8437。[0007]根据《伯杰氏细菌鉴定手册》等方法，采用LB固体培养基培养(培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L)，肉眼观察菌落生长特征、光学显微镜下观察细菌大小、形状、类型等。通过观察发现，在LB固体培养基上菌落呈圆形，边缘不整齐，乳白色，不透明，表面粗糙有褶皱，无光泽。培养至30h，菌体均以休眠体芽孢的形式存在。菌落呈浅黄色。显微观察菌体为单细胞，杆状，单生或双生，有时成链状。革兰氏染色阳性，芽孢椭圆形。VP反应、淀粉水解试验、硝酸盐还原反应、柠檬酸盐利用、明胶液化均为阳性；苯丙酸脱氨酶试验、M.R.、尿酶试验、丙酸盐的利用均为阴性，可以在含6.5% NaCl的LB培养基中生长。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》等方法初步鉴定菌株CGMCC N0.8437为枯草芽胞杆菌属{Bacillus subtilis )。
[0008]进一步地，本发明提供上述枯草芽胞杆菌在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中的应用。
[0009]优选地，磺酰脲类除草剂为烟嘧磺隆。烟嘧磺隆是一种重要的磺酰脲类除草剂，可以防除一年生和多年生禾本科杂草、部分阔叶杂草。研究表明，对药敏感性强的杂草有禆草、狗尾草、野燕麦、反枝苋；敏感性中等的杂草有本氏寥、律草、马齿苋、鸭舌草、苍耳和苘麻、莎草；敏感性较差的杂草主要有藜、龙葵、鸭趾草、地肤和鼬瓣花。
[0010]进一步的，本发明的枯草芽胞杆菌可以制成微生物菌剂，即将本发明的上述菌株接种于LB液体培养基，在25°C -30°c、摇床转数125r/min-150r/min的条件下，培养I天，并调节孢子浓度为IX IO7个/mL，即制得本发明枯草芽胞杆菌的2级培养液；随后进行如下的固体发酵:将麸皮、稻草、玉米粉、稻壳按照12:6:2:1.5的比例添加到IL的三角瓶中，加入适量的水使之湿度达到100%后灭菌备用，将IOmL上述枯草芽胞杆菌的2级培养液加入到三角瓶中在25°C -30°C发酵培养3-4天后制得本发明所述微生物菌剂。
[0011]本发明的效果
在400mg.L-1烟嘧磺隆的LB固`体平板中，本发明的枯草芽胞杆菌株对烟嘧磺隆有较强的降解作用，在37°C条件下培养8-16 h后，产生透明圈，如图1所示。
[0012]【专利附图】
【附图说明】
图1本发明的枯草芽孢杆菌菌株对烟嘧磺隆圈。
【具体实施方式】
[0013]本发明公开了一种对烟嘧磺隆有较高降解作用的枯草芽胞杆菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都被视为包括在被发明内。本发明所述的枯草芽胞杆菌已经通过较规范的实施例进行了描述，相关人员明显能在不摆脱本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动和适当的变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0014]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0015]实施例1本发明枯草芽胞杆菌株的分离 水样中微生物的驯化处理与富集培养
向供试水样中添加烟嘧磺隆，使其含量为400 !!^?171，将其置于301:、150 r* HiirT1条件下驯化培养14 d，取5 mL经驯化的水样加入到50 mL含400 mg ? L—1烟嘧磺隆的富集培养基中，置于30°C、150 r ^mirT1条件下振荡培养7 d，然后再取5 mL培养液，转移到50 mL含400 mg ? L—1烟嘧磺隆的富集培养基中振荡培养，如此重复，共计5次。
[0016]可降解烟嘧磺隆微生物的菌株筛选
取上述驯化后的含有水样微生物的培养基，将其均匀涂布到含有400 mg -r1烟嘧磺隆的LB平板上，在30°C条件下培养8-16 h后，挑取能产生透明圈的单菌落继续在LB平板上纯化培养并保存菌种，结果如图1所示。
[0017]实施例2本发明所述枯草芽胞杆菌株的鉴定 I形态学鉴定
根据《伯杰氏细菌鉴定手册》等方法，采用LB固体培养基培养(培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15g/L)，肉眼观察菌落生长特征、光学显微镜下观察细菌大小、形状、类型等。通过观察发现，在LB固体培养基上菌落呈圆形，边缘不整齐，乳白色，不透明，表面粗糙有褶皱，无光泽。培养至30h，菌体均以休眠体芽孢的形式存在。菌落呈浅黄色。显微观察菌体为单细胞，杆状，单生或双生，有时成链状。革兰氏染色阳性，芽孢椭圆形。VP反应、淀粉水解试验、硝酸盐还原反应、柠檬酸盐利用、明胶液化均为阳性；苯丙酸脱氨酶试验、M.R.、尿酶试验、丙酸盐的利用均为阴性，可以在含6.5% NaCl的LB培养基中生长。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》等方法初步鉴定菌株ND2为枯草芽胞杆菌属{Bacillus subtilis )。
[0018]2分子生物学鉴定
16S rDNA鉴定:将筛选得到的菌株接入LB液体培养基中，30°C摇床培养16 h，取IyL菌液作为模板，以27F和1492R引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为25 U 1，反应体系为:菌液 I U L, 10XPCR buffer 2.5 u L, NSl 引物 I y L, NS8 引物 I y L, dNTPs 2 u L, Taq酶 0.25 ii L，ddH20 17.25u L0 反应条件为:94°C 5 min，94°C 30 s，57°C 50 s，72°C 50s ;循环30次；72°C 10 min。PCR扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列，输入NCBI，用Blast程序与`数`据库中的所有序列进行比较分析。经过序列分析显示，与其同源的序列均是枯草芽胞杆序列，且同源性菌在96%以上，试验结果进一步说明本发明所分离的菌株属于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。
[0019]实施例3本发明枯草芽胞杆菌对烟嘧磺隆的降解效率
将分离纯化的菌株分别接种于LB液体中，在30°C培养I d后，用LB液体培养基制备成菌悬液，使其浓度为IX IO8 CFU ? mL'然后再添加400 mg ? L—1烟嘧磺隆，以培养基中只加入烟嘧磺隆不接种菌体的为对照处理。将其置于30°C、150 r MirT1摇床上振荡培养，待培养5 d后4000 r.HiirT1离心，弃上清，沉淀用20 mL 二氯甲烷萃取沉淀，重复萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠脱水后经40°C旋转蒸发浓缩至2 mL，氮吹仪吹干，甲醇定容至5mL，采用HPLC法测定各处理中的烟嘧磺隆含量，按下列公式计算各菌株对烟嘧磺隆的降解率。经试验测得3天后400 mg ? L—1烟嘧磺隆可被完全降解掉。
[0020]具体条件为:Agilent1200LC 高效液相色谱；色谱柱:Zorbax Eclipse XDB-C18,柱长125 mmX4.0 mm,内径5 ii m ;柱温:30°C;检测波长:240 nm ;流动相:乙睛:水:冰乙酸=30:70:0.05 (V/V);流量:1.0 mL ? mirT1 ;进样量:2 ML。标准品为烟嘧磺隆。
【权利要求】
1.一种枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，保藏编号为CGMCC N0.8437，其于2013年11月6日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的枯草芽胞杆菌在受磺酰脲类除草剂污染土壤修复中的应用。
3.根据权利要求2的用途，其特征在于，所述磺酰脲类除草剂为烟嘧磺隆。
【文档编号】B09C1/10GK103756927SQ201310557361
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】张越 申请人:张越, 赵斌