一种高岭土固定化gy2b菌的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高岭土固定化GY2B菌的制备方法及其应用。所述制备方法包括以下步骤：将GY2B菌活化培养形成菌体，然后将菌体在含苯酚的富集培养液中扩大培养成浓菌液，再用无菌生理盐水离心洗涤浓菌液得到菌体，之后将洗得的菌体悬于无菌生理盐水中得到菌悬液；将灭菌处理后的高岭土溶解于无菌MSM培养液中形成悬浊液，然后按接种量2?8%加入菌悬液，吸附固定1?4小时，制得高岭土固定化GY2B菌。本发明采用华南地区最常见的粘土矿物之一高岭土作为固定材料，可以明显提升降解菌的降解效率和速率，原料廉价，方法操作性强，可循环使用，对实际应用工艺有极佳参考价值，有可观的应用前景。
【专利说明】-种高岭土固定化GY2B菌的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物化固定【技术领域】，具体涉及一种高岭土固定化GY2B菌的制备 方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 苯酚是一种重要的具有特殊气味兼腐蚀性的有机原料，在医药、树脂、灭菌剂等多 方面被广泛应用。苯酚对人体、环境中的大气和水体都会产生极大威胁。与人体直接接触轻 则会导致体内、体外的粘膜、皮肤腐蚀，重则导致中枢神经处于抑制状态、对外界刺激反应 慢以及肝、肾功能损害，急性中毒甚至致命。不仅会污染河流湖泊，破坏生态景观，抑制水生 动植物生长，甚至导致死亡，更能够随食物链迁移而危害人体健康，不仅有使蛋白质变性、 长期饮用导致苯酚积累而引发慢性中毒的低浓度苯酚污染影响人们正常生命活动，更有使 蛋白质凝固、引起肌体组织损伤坏死、导致急性中毒的高浓度苯酚污染威胁生命安全。加之 极高的常见性和极强的流动性，苯酚被列入129种有毒污染物和有限污染物，其处理受到 重大关注。
[0003] 含苯环有机物的如PAHs，苯酚等的微生物降解已成为国内外污染环境修复的重要 手段甚至首选的方法，生物处理法具有成本低廉、对环境干扰轻微、处理形式多样、处理彻 底等优点。GY2B高效降解菌属鞘氨醇假单胞菌，被筛选并证实对包括菲等多种多环芳烃具 有较高或一定的降解能力。降解通过细菌的摄入转化，能有效开环降解，使多种带苯环的有 机污染物转化成简单无害或易处理的物质。除菲等芳烃化合物外，GY2B菌对苯酚也可观的 降解能力。现阶段，对有机污染物的降解多停留在单菌的投加和条件的维稳，菌种降解效率 的保证和提高也多涉及在生物增强剂、体系适宜条件、菌属浓度、和部分协同作用。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术中游离GY2B菌降解过程中适应期较长以及对复杂恶劣环境下调 节能力差等缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种制备高岭土固定化GY2B菌 的方法，该方法能显著提升GY2B菌属降解效率和速率，并在一定恶劣环境下维持降解能 力。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述方法获得的高岭土固定化GY2B菌。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述高岭土固定化GY2B菌的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种高岭土固定化GY2B菌的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)将GY2B菌活化培养形成菌体，将菌体在含苯酚的富集培养液中扩大培养得到 浓菌液，再用无菌生理盐水离心洗涤浓菌液得到菌体，之后将洗得的菌体悬于无菌生理盐 水中得到菌悬液；
[0010] (2)将灭菌处理后的高岭土溶解于无菌MSM培养液中形成悬浊液，然后按接种量 2?8%加入步骤（1)得到的菌悬液，吸附固定1?4小时，制得所述高岭土固定化GY2B菌。
[0011] 优选的，步骤（1)所述GY2B菌活化培养的具体操作为：将平板储存的GY2B菌落挑 1?2环至含苯酚浓度50?200mg/L的无菌MSM培养液中震荡培养，摇床条件为避光25? 35°C、100?200r/min ;8?16小时后取1?2mL菌液至新的含苯酌·浓度50?200mg/L的 无菌MSM培养液中接代培养，待8?16小时生长良好时再取1?2ml菌液至新的含苯酚浓 度50?200mg/L的无菌MSM培养液中再次接代培养，按此重复接代培养2?5次（即把接 待培养的步骤按相同条件重复进行2?5次）即得到具有稳定降解苯酚能力的GY2B菌体， 涂平板保存。
[0012] 优选的，步骤（1)中将菌体在含苯酚浓度50?200mg/L的富集培养液中扩大培养 8?16h得到所述浓菌液。
[0013] 步骤（1)中将菌体在含苯酚的富集培养液中扩大培养，是为了解决在无机盐培养 液中培养得到菌体较少的缺陷，并且在制成浓菌液的同时保持其降解性能。
[0014] 优选的，步骤（1)中得到的菌悬液，于紫外分光光度计600nm处调节浓度，使其吸 光度值为A = 0. 8?1. 5。所得的菌悬液保存在2?KTC冰箱备用。
[0015] 优选的，步骤（1)所述离心洗涤具体条件为：离心温度为2?KTC，离心转速为 6000?12000r/min，离心时间为10?20分钟，离心洗涤次数为2?5次。
[0016] 优选的，步骤（2)所述高岭土的灭菌处理具体操作为：将高岭土于100?150°C下 蒸汽灭菌15?60min，然后于80?150°C烘干分散10?30min。灭菌后的高岭土放于紫外 光照射下冷却备用。
[0017] 优选的，步骤（2)所述高岭土目数为100?300目。
[0018] 优选的，步骤（2)所述吸附固定具体条件为：在恒温震荡培养箱中进行，仪器参数 为100?200r/min、25?35°C以及避光。
[0019] 上述方法获得的高岭土固定化GY2B菌。
[0020] 上述方法获得的高岭土固定化GY2B菌在处理含苯酚废水中的应用。
[0021] 优选的，所述高岭土固定化GY2B菌在处理含苯酚废水时，高岭土在体系中的浓度 为15?30g/L ;所述体系的pH值为7?12,体系中苯酚浓度为0?300mg/L。所述体系包 含用于溶解高岭土的无菌MSM培养液、GY2B菌悬液和含苯酚废水。
[0022] 与GY2B菌单独降解和其他对苯酚的降解方法相比，本发明具有以下优点及有益 效果：
[0023] (1)本发明方法中吸附固定过程简单易行，操作精度不高，且所用原料取材简易， 价格低廉，成本底而降解条件平滑，在实际应用领域有较大优势。
[0024] (2)本发明方法相比游离菌降解，能显著提升降解效率并大大加快降解速率，固定 后能将降解效率提升6?20%左右，降解时间可从10?18小时缩短至5?10小时左右。 并因其微生物降解的特性，二次产物对环境影响微小。
[0025] (3)本发明方法固定GY2B降解菌，除能在降解效率上提供促进外，还能在某些较 恶劣环境条件如高浓度苯酚，碱性环境下保证菌体的降解性能，例如，在体系PH = 9?12、 苯酚浓度为200?300mg/L时，也能保持其促进降解的作用，能将降解效率提升15?20%， 且降解时间大大缩短，对实际应用有很大优势。
[0026] (4)本发明方法中所用的高岭土土样经回收处理可循环利用。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为实施例2中不同高岭土加入量对GY2B菌降解效率和速率的影响。
[0028] 图2为实施例2中不同浓度高岭土对苯酚的吸附作用。
[0029] 图3为实施例3中游离GY2B菌对较高浓度苯酚体系的降解作用。
[0030] 图4为实施例3中高岭土 /GY2B复合体对较高浓度苯酚体系的降解作用。
[0031] 图5为实施例4中游离GY2B菌对不同pH下苯酚的降解作用。
[0032] 图6为实施例4中高岭土 /GY2B复合体对不同pH下苯酚的降解作用。
[0033] 图7为实施例5中高岭土循环利用次数与降解率的关系。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0035] 本发明实施例中所述MSM培养液包含以下浓度的成分：5. OmL/L磷酸盐缓冲液 (8. 5g/L KH2PO4, 21. 75g/L K2HPO4 · H2O, 33. 4g/L Na2HPO4 · 12H20, 5. 0g/LNH4Cl), 3. Oml/ L MgSO4 水溶液（22. 5g/L)，I. Oml/L CaCl2 水溶液（36. 4g/L)，I. Oml/L FeCl3 水溶液 (0· 25g/L)，I. Oml/L 微量元素溶液（39. 9mg/L MnSO4 · H20,42. 8mg/L ZnSO4 · H2O, 34. 7mg/ L (NH4) 6M〇7024 ·4Η20)，pH调为7. 2 ;上述MSM培养液通过高温蒸汽灭菌后得到试验所需的无 菌MSM培养液。其中是ml/L是指已配好的组分液在最终混合液体积为IL时的投加量，例 如5. Oml/L磷酸盐缓冲液是指最终混合液体积为IL时，缓冲液投加量为5mL。
[0036] 本发明实施例中所述含100mg/L苯酚的无菌MSM培养液通过如下步骤制得：称取 一定量苯酚于烧杯中，以上述MSM培养液溶解，并转移至容量瓶中，以上述MSM培养液定容 使苯酚浓度为lg/L ;吸取IOmL此定容后的溶液经过滤灭菌后加入高温蒸汽灭菌后的MSM 培养液中，使苯酚终浓度为l〇〇mg/L，即可得到所述含100mg/L苯酚的无菌MSM培养液。
[0037] 本发明实施例中所述富集培养液包含以下组分：10g蛋白胨，5g牛肉膏，5gNaCl， IL蒸馏水，调pH为7. 0 ;上述富集培养液灭菌之后，加入过滤灭菌后的苯酚溶液，使终浓度 为100mg/L，即得试验所需的含苯酚浓度100mg/L的富集培养液。
[0038] 本发明实施例中GY2B菌由华南地区常见的污染土壤中分离提纯得到。实验用样 品分别采自广州石化厂附近农田土壤（S)、广州油制气厂土壤（Y)及一木材防腐处理厂土 壤（M)(分别即指采了三个样，菌进行了分离提纯富集等步骤，最终得到选取降解效率最佳 的菌）。提纯过程由华南理工大学环境与能源学院党志课题组完成并保存。
[0039] 实施例1
[0040] 一种高岭土固定GY2B菌的方法，包括以下步骤：
[0041] (1)GY2B菌的活化培养：将平板储存的GY2B菌落挑一至两环至含苯酚浓度为 100mg/L的无菌MSM培养液中震荡培养，摇床条件为避光30°C、150r/min ; 12小时后取少量 菌液（接种量4% )至新的含100mg/L苯酚的无菌MSM培养液中接代培养，以此重复接代培 养3次，即得到具有稳定降解苯酚能力的GY2B菌，涂平板保存；
[0042] (2)菌悬液制备：将步骤⑴活化培养制得的菌落挑取一至两环至含苯酚浓度 100mg/L的富集培养液中，相同条件培养12小时，得到浓菌液；得到的浓菌液用生理盐水离 心洗涤三次，离心条件为4°C、8000r/min、离心15分钟；洗得菌体悬于生理盐水中，得到菌 悬液，并于紫外分光光度计下600nm处调节菌悬液浓度，使其吸光度值为A = I ;菌悬液保 存在4°C冰箱备用；
[0043] (3)高岭土灭菌处理：选取华南地区极常见的天然高岭土，粉碎研细过200目筛； 称取2g高岭土于250mL锥形瓶中，120°C高温蒸汽灭菌30min后，取出放于烘箱120°C烘干 分散15分钟，再于无菌操作台中紫外照射下冷却至室温备用；
[0044] (4) GY2B菌吸附固定：往步骤（3)灭菌处理后的高岭土中加入86mL无菌MSM培养 液（步骤（1)所述的MSM培养液经高温蒸汽灭菌制得），充分摇匀分散得到高岭土的悬浊 液，而后加入4mL步骤（2)中制得的菌悬液；放于恒温震荡培养箱中避光震荡2小时达到高 岭土与GY2B菌的吸附平衡即得所需的复合体系（即高岭土固定化GY2B菌），恒温震荡培养 箱工作条件与步骤（1)GY2B菌的活化培养的条件一致。
[0045] a.步骤（1)活化培养之后的GY2B降解菌对苯酚降解率的检测：
[0046] 于250mL中依次装入经高温蒸汽灭菌的MSM培养液、菌液、经过滤灭菌的苯酚母 液，使得最终体系体积为lOOmL，菌液投加量为4%即4mL，苯酚浓度为100mg/L。而后放入 恒温震荡培养箱，30°C，150r/min震荡培养。定时每两小时取样测定体系中的苯酚残留浓 度。样品处理lOOOOr/min离心后取上清液稀释到适当倍数，与紫外分光光度计下测定，条 件为270nm波长处。由标准曲线计算得苯酚浓度。测得体系浓度不在变化时即达到降解平 衡。
[0047] 最终检测到步骤（1)活化培养之后的GY2B降解菌能够在12小时完成对苯酚的降 解作用，降解率在86%?88%之间。苯酚的降解率Φ由以下公式计算得到 ：
[0048] Φ =(体系苯酚初始浓度CO-体系苯酚终浓度Cl) /初浓度C0*100%
[0049] b.步骤（4)制得的高岭土固定化GY2B菌对苯酚降解率的检测：
[0050] 准确称取2g高岭土高温蒸汽灭菌并120度烘箱干燥，紫外光下冷却至室温。而后 依次加入经灭菌的MSM培养液、菌液，放入恒温震荡培养箱中30°C，150r/min震荡2小时使 细菌与高岭土吸附结合达到平衡。而后再加入经过滤灭菌的苯酚母液，使得最终体系体积 为100ml，菌液投加量为4%即4ml，苯酚浓度为100mg/L。放入恒温震荡培养箱震荡培养， 后续步骤与游离GY2B菌苯酚降解率的检测一致。
[0051] 最终检测到步骤（4)制得的高岭土固定化GY2B菌只需6小时左右即能完成降解， 远快于游离菌的12小时。体系中苯酚完成降解时间的记录方法如下：定时取样测定体系中 苯酚的残留量，前期苯酚浓度呈现明显下降趋势，当体系中苯酚浓度保持在较低的浓度并 在之后的时间里不再继续下降。即说明降解过程已完成，此时刻即为苯酚降解的降解时间。
[0052] 可见，GY2B降解菌具备较好的降解效果。然而，步骤（4)制得的高岭土固定化GY2B 菌对体系环境具有更强的适应能力，也能在降解过程中提供更稳定的降解环境。本发明高 岭土的加入大大缩短了 GY2B降解菌的适应期，因而在实际反应中复合体系能更快地完成 苯酚的降解进程。
[0053] 实施例2
[0054] 本实施例GY2B菌的活化培养、菌悬液制备和高岭土灭菌处理具体步骤与实施例1 相同，不同之处在于，本实施例在GY2B菌吸附固定通过加入不同质量的高岭土，以说明高 岭土对GY2B菌降解效率和速率的影响。具体操作如下：
[0055] 按实施例1步骤（1)、（2)的方法完成GY2B菌的活化培养和菌悬液制备后，分别准 确称量〇g、〇. 〇lg、〇. 2g、0. 5g、lg、2g、3g的200目高岭土于250mL锥形瓶中，并按实施例I 步骤（3)的方法对各组高岭土进行灭菌前处理；然后，对每个瓶各加入86mL无菌MSM培养 液，摇匀分散形成高岭土悬浊液；再对每组悬浊液各加入4mL菌悬液，最后将7组样品放入 恒温震荡培养箱中震荡2小时（仪器参数为30°C、150r/min避光），待二者完成吸附固定作 用达到平衡，制得7组试验所需的高岭土固定化GY2B菌。
[0056] 将上述制备的7个装有高岭土固定化GY2B菌的锥形瓶取出于无菌操作台中各加 入IOmL浓度为lg/L已过滤灭菌的苯酚溶液，使体系最终体积为IOOmL,摇勻。最终体系中 苯酚的浓度为l〇〇mg/L，GY2B菌接种量为4%。每个样品做三次平行。放入恒温震荡培养 箱中避光培养，仪器参数一致。
[0057] 每两小时取样测定体系中苯酚的残留量，样品处理为：4°C环境下lOOOOr/min离 心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算 得体系中苯酚浓度，根据试验结果作图体现各体系苯酚的实时浓度和高岭土对细菌降解能 力的影响，具体如图1所示，从图中可看到：GY2B菌吸附固定过程中过低的高岭土投加量如 0. lg/L，对GY2B菌的降解能力并无明显的促进作用，甚至在一定程度上会有抑制。而随着 高岭土投加量的增加，降解效果越来越好，说明GY2B降解菌固定作用对其降解能力的提升 与高岭土的投加量成正相关的关系，并在投加量为20g/L时促进作用达到最佳的效果，此 后再增加高岭土的投加量对降解效率和速率再无明显提升。综合效果和材料用量可将高岭 土的投加确定为20g/L。
[0058] 此外，再按照以下操作来说明高岭土本身对苯酚的吸附作用：
[0059] 分别准确称量0g、0. 01g、0. lg、lg、2g的200目高岭土于250mL锥形瓶中按实例1 步骤（3)的方法对高岭土进行灭菌处理；然后对每个瓶加入90mL无菌MSM培养液，摇匀分 散形成高岭土悬浊液后，分别加入IOmL经过滤灭菌浓度为lg/L的苯酚溶液，最终体系总 体积为IOOmL,苯酚浓度为100mg/L。将5组样品放入恒温震荡培养箱中，在条件为30°C， 150r/min，避光下震荡。每两个小时取样测定混合体系中苯酚的残留量，样品处理为：4°C环 境下lOOOOr/min离心5分钟，取上清液稀释测定，以此探索高岭土本身对苯酚的吸附作用。 紫外分光光度计测定波长为270nm。由标准曲线算得苯酚含量，作图体现吸附动态，如图2 所示。
[0060] 从图2中可看到，无论是高投加量的高岭土体系还是低浓度投加量的高岭土体 系，从开始到正常情况下降解完成时间内，体系中的苯酚浓度并无明显变化，说明高岭土本 身对苯酚基本无吸附作用，这也排除了高岭土固定化GY2B菌的复合体系对苯酚处理效果 的提升是因为高岭土对苯酚的吸附作用。因此，高岭土的投加吸附固定GY2B菌能够提升降 解菌的降解效率和降解速率。
[0061] 实施例3
[0062] 本实施例GY2B菌的活化培养、菌悬液制备和高岭土灭菌处理具体步骤与实施例1 相同，不同之处在于，本实施例通过处理不同浓度苯酚，以说明不同苯酚初始浓度尤其是高 浓度下高岭土吸附固定对GY2B菌降解能力的影响。具体操作如下：
[0063] 按实施例1步骤（1)、（2)的方法完成GY2B菌的活化培养和菌悬液制备后，准确称 量4份2g的高岭土，分别装于4个250ml的锥形瓶中，并按照实施例1步骤（3)的方法对 各组高岭土进行灭菌前处理；然后，分别加入无菌MSM培养液86mL、81mL、76mL、71mL，摇匀 分散形成高岭土悬浊液后，分别各加入4mL菌悬液，混匀后放入恒温震荡培养箱震荡2小时 仪器参数为30°C、150r/min避光），待GY2B菌和高岭土完成吸附固定作用达到平衡，制得4 组试验所需的高岭土固定化GY2B菌。
[0064] 完成固定吸附制得试验所需的高岭土固定化GY2B菌后，将4个锥形瓶取出于无菌 操作台中各加入1〇1^、151^、2〇1^、251^浓度为18/1已过滤灭菌的苯酚溶液，使最终体系总 体积均为IOOmL,摇勻。最终体系中苯酚的浓度分别为100mg/L，150mg/L，200mg/L，250mg/ L，GY2B菌接种量均为4%。每个样品做三次平行，每种浓度均设置游离GY2B菌（即活化培 养后的GY2B菌）的对照。放入恒温震荡培养箱中避光培养，仪器参数30°C，150r/min。每 两小时取样测定体系中苯酚的残留量，样品处理为：4°C环境下lOOOOr/min离心5分钟，取 上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得体系中苯酚 浓度。体系中苯酚浓度的变化反馈GY2B菌经固定后在高浓度苯酚的环境下的降解能力如 图4所示，游离GY2B菌在高浓度苯酚的环境下的降解能力如图3所示。
[0065] 从图3可看到，游离GY2B菌对高浓度的苯酚环境具有更长的适应期，当苯酚浓度 超过150mg/L时，游离GY2B菌的完成降解的时间需超过20小时，甚至浓度为250mg/L时 需要36小时以上；且最终的降解率也较低；浓度超过250mg/L时，降解率不及50%。从图 4可看到，经高岭土吸附固定后的GY2B菌，在降解时间上大大缩短，在浓度极高的苯酚环境 下体系也能在20小时左右完成降解作用，且相比游离GY2B菌的降解率，有明显的提升。
[0066] 实施例4
[0067] 本实施例GY2B菌的活化培养、菌悬液制备和高岭土灭菌处理具体步骤与实施例1 相同，不同之处在于，本实施例通过不同PH值环境说明高岭土吸附固定对GY2B菌降解能力 的增进作用，并着重涉及了在碱性条件下固定体系与游离菌体系的差异。
[0068] 按实施例1步骤（1)、（2)的方法完成GY2B菌的活化培养和菌悬液制备后，进行如 下操作：
[0069] (a)分别量取足量的MSM培养液于7个锥形瓶中，使用NaOH、HCl将pH值分别调节 为1、3、5、7、8、10、12,同时准备7只均准确称量了 2g高岭土的锥形瓶，将上述锥形瓶一同放 入灭菌锅中进行120°C高温蒸汽灭菌30min，然后将装有不同pH的灭菌后的MSM培养液的 锥形瓶取出并放于无菌操作台开紫外冷却到室温，将装有高岭土的锥形瓶放于烘箱120°C 烘干分散后再放于紫外下冷却到室温；
[0070] (b)对步骤（a)已灭菌处理的7种不同pH值的MSM培养液，分别移取86mL对应加 入灭菌处理后的高岭土中，摇匀分散形成高岭土悬浊液后，分别各加入4mL菌悬液，混匀后 放入恒温震荡培养箱震荡2小时（仪器参数为30°C、150r/min避光），使二者完成吸附固定 作用达到平衡，制得7组pH值不同的高岭土固定化GY2B菌；
[0071] (C)取稍过量的苯酚母液7组，并在pH计下用NaOH、HCl溶液将pH值分别调节为 1、3、5、7、8、10、12,在无菌操作台中过滤灭菌后，分别加 IOmL至装有相对应pH值高岭土固 定化GY2B菌的锥形瓶中，使最终体系体积为IOOmL,混合均匀。7组样品体系最终菌体接 种量均为4%，苯酚浓度均为100mg/L。放入恒温震荡培养箱中避光培养，仪器参数30°C， 150r/min。每两小时取样测定体系中苯酚的残留量，样品处理为：4°C环境下10000r/min离 心5分钟，取上清液稀释测定。测定在紫外分光光度计，270nm波长测定，由标准曲线计算得 体系中苯酚浓度作图，结果如图6所示。每个样品均设置相同试验条件下游离GY2B菌（即 活化培养后的GY2B菌）对照试验，试验结果如图5所示。
[0072] 从图5和6可看到，在pH = 7、8时，高岭土固定化GY2B菌和游离GY2B菌均具备 较好的降解效率，且在高岭土的固定作用对降解效率和速率的提升体现的十分明显。在PH 值成酸性条件时，菌体的活性，降解能力均受到极大抑制，酸性偏大时体系基本丧失了对苯 酚的降解作用，高岭土吸附固定对降解能力的保护也消失。而在体系环境呈碱性时，菌体则 保留着一定的降解能力，相应的适应期也因条件的恶劣而增加。高岭土固定化GY2B菌对降 解能力的提升和保护在碱性环境下依旧明显，PH= 12时，游离GY2B菌在一个较长的降解 周期内将复合体系中的苯酚浓度降到50 %左右，而高岭土固定化GY2B菌在6小时内可将体 系内苯酚降解70 %左右，提升效果明显。
[0073] 实施例5
[0074] 本实施例GY2B菌的活化培养、菌悬液制备和高岭土灭菌处理具体步骤与实施例1 相同，不同之处在于，本实施例通过测试高岭土回收利用若干次后的降解效果以说明使用 后的高岭土的回收再用的效果。
[0075] 按实施例1步骤（1)、（2)的方法完成GY2B菌的活化培养和菌悬液制备后，进行如 下操作：
[0076] (a)准确称取2g高岭土于250mL锥形瓶中，放入灭菌锅中120°C高温蒸汽灭菌 30min，取出后120°C烘箱烘干分散，紫外光下冷却至室温；
[0077] (b)向步骤（a)灭菌处理后的高岭土中加入86mL无菌MSM培养液，充分混勻形成 高岭土悬浊液，然后加入4mL的菌悬液，放入恒温摇床震荡2小时（仪器参数为30°C、150r/ min,避光），吸附固定平衡后加入IOmL经过滤灭菌的浓度lg/L的苯酚溶液，使最终体系体 积为IOOmL,最终菌接种量为4%，体系最终苯酚浓度为100mg/L，然后放入恒温震荡培养箱 中培养。每两小时取样测定苯酚的含量，样品处理过程为4°C离心5min，离心参数IOOOOr/ min。测定在紫外分光光度计下270nm波长；
[0078] (c)步骤（c)的体系完成降解后，取出静置6小时，移除上清液，用蒸馏水离心洗涤 下层沉积土 3次，离心参数为4000r/min，lOmin，4°C。清洗后的高岭土收集放入烘箱105°C 下烘干，研钵研细留作再用；
[0079] (d)将步骤（c)回收处理后的高岭土称取2g于250mL锥形瓶中，重复（a)、（b)的 高岭土灭菌处理、降解苯酚的体系反应过程。测定每次高岭土应用体系中苯酚浓度的变化。
[0080] 以上过程高岭土的回收再用5次，发现高岭土增强效果略有下降，但在降解速率 上的促进仍十分明显，降解效率如图7所示。
[0081] 从图7可看到，高岭土随着使用次数的增加，其吸附固定作用对菌体降解能力的 提升成减弱趋势。循环使用4、5次后，其降解作用降低到趋近于游离GY2B菌的降解效率 85%左右，但其对降解速率的提升依旧比较明显，因而在一定条件下使用的高岭土可用于 循环应用。
[0082] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种高岭土固定化GY2B菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将GY2B菌活化培养形成菌体，将菌体在含苯酚的富集培养液中扩大培养得到浓菌 液，再用无菌生理盐水离心洗涤浓菌液得到菌体，之后将洗得的菌体悬于无菌生理盐水中 得到菌悬液； (2) 将灭菌处理后的高岭土溶解于无菌MSM培养液中形成悬浊液，然后按接种量2? 8%加入步骤（1)得到的菌悬液，吸附固定1?4小时，制得所述高岭土固定化GY2B菌。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述GY2B菌活化培养的具 体操作为：将平板储存的GY2B菌落挑1?2环至含苯酚浓度50?200mg/L的无菌MSM培 养液中震荡培养，摇床条件为避光25?35°C、100?200r/min ;8?16小时后取1?2mL 菌液至新的含苯酚浓度50?200mg/L的无菌MSM培养液中接代培养，待8?16小时生长 良好时再取1?2ml菌液至新的含苯酚浓度50?200mg/L的无菌MSM培养液中再次接代 培养，按此重复接代培养2?5次即得到具有稳定降解苯酚能力的GY2B菌体，涂平板保存。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中将菌体在含苯酚浓度 50?200mg/L的富集培养液中扩大培养8?16h得到所述浓菌液。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中得到的菌悬液，于紫外分 光光度计600nm处调节浓度，使其吸光度值为A = 0. 8?1. 5。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)所述离心洗涤具体条件为： 离心温度为2?KTC，离心转速为6000?12000r/min，离心时间为10?20分钟，离心洗 漆次数为2?5次。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述高岭土的灭菌处理具 体操作为：将高岭土于100?150°C下蒸汽灭菌15?60min，然后于80?150°C烘干分散 10 ?30min〇
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述高岭土目数为100? 300目；步骤（2)所述吸附固定具体条件为：在恒温震荡培养箱中进行，仪器参数为100? 200r/min、25 ?35°C 以及避光。
8. 权利要求1至7中任一项所述制备方法获得的高岭土固定化GY2B菌。
9. 权利要求8所述高岭土固定化GY2B菌在处理含苯酚废水中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述高岭土固定化GY2B菌在处理含苯 酚废水时，高岭土在体系中的浓度为15?30g/L ;体系pH值为7?12,体系中苯酚浓度为 0 ?300mg/L〇
【文档编号】C02F3/34GK104212790SQ201410438447
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】吴平霄, 李跃武, 党志, 朱能武 申请人:华南理工大学