一株假单胞菌产生的胞外多糖及培养方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株假单胞菌产生的胞外多糖及培养方法与应用。一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)QL212，已于2014年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO.9651。本发明所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)QL212，合成的凝胶多糖为胞外多糖，经发酵条件优化，凝胶多糖产量可达5.94g/L，产量高于现有已知的假单胞菌凝胶多糖的最高产量。
CGMCC NO.9651
2014.09.12
【专利说明】一株假单胞菌产生的胞外多糖及培养方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株假单胞菌产生的胞外多糖及培养方法与应用，特别涉及一株假单 胞菌（Pseudomonas sp.)QL212及其培养方法与在发酵生产微生物胞外多糖絮凝剂中的应 用，属于微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 微生物胞外多糖是由某些细菌、真菌在各种碳源上生长过程中合成的，并分泌到 细胞外的水溶性或水不溶性多糖物质。凝胶多糖是微生物发酵产生的直链同型β-l，3-葡 聚糖，因其独特的理化性质，使它在很多领域都具有广泛的应用开发前景。迄今为止，细菌 中只报道了土壤杆菌属和产碱杆菌属能够生产同型直链的β-l，3-葡聚糖。热凝胶多糖 (Curdlan)是继黄原胶、结冷胶之后，被美国FDA(食品药物管理局）批准使用的第三种微生 物发酵产生的食用多糖。
[0003] 根据絮凝剂的组成，大致分为三大类：无机絮凝剂、有机絮凝剂和生物絮凝剂。无 机絮凝剂能够提供大量的络合离子，因而具有较好的絮凝效果，且价格便宜，但是对人类健 康和生态环境会产生不利影响；合成高分子絮凝剂虽然成本低，用法简单，但是用量大，效 果差，会造成二次污染；生物絮凝剂能够弥补其它两种絮凝剂的缺点，是一类由微生物或其 分泌物产生的代谢产物，通过微生物发酵、产品提取、精制而得。生物絮凝剂对人体无害，可 以被生物降解，对生态环境也不存在不良影响，较之常用的聚合铝絮凝剂和聚丙烯酰胺絮 凝剂要更为安全。它主要由微生物代谢产生的各种多聚糖类、蛋白质，或是蛋白质和糖类参 与形成的高分子化合物，能产生生物絮凝剂的微生物大量存在于土壤、活性污泥和沉积物 中。
[0004] 目前国内外有文献报道Pseudomonas sp.能够合成凝胶多糖，但其凝胶多糖的最 大产量仅为 2. 35g/L(Cui JD, Qiu JQ, Production of extracellular water-insoluble polysaccharide from Pseudomonas sp. J Agric Food Chem, 2012,60(19):4865-71.),无 法满足工业生产的需求。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一株假单胞菌产生的胞外多糖及培养方法与应 用，并进一步提供该絮凝剂在高岭土、黄河水、印染污水和果汁等的絮凝和脱色方面的应 用。
[0006] 本发明采用的技术方案如下：
[0007] 一株假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212, 2014年9月12日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所，保藏编号：CGMCC N0. 9651。
[0008] 上述假单胞菌（Pseudomonas sp. ) QL212的培养方法，步骤如下：
[0009] (1)将假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212接种于固体斜面培养基上，在28?32°C 活化培养20?28h，制得活化菌体；
[0010] (2)将步骤（1)制得的活化菌体接种于种子培养基中，在28?32°C、150?300rpm 条件下培养20?28h，制得种子液；
[0011] (3)将步骤（2)制得的种子液按体积百分比8?12%的比例接种至发酵培养基 中，在在28?32°C、150?300rpm条件下发酵培养5?8天，即得发酵液；
[0012] 所述步骤（1)中的固体斜面培养基，组分如下，均为重量百分比：
[0013] 1?1. 2%蔗糖、0· 5?0· 7%酵母粉、1. 5?1. 6%琼脂、余量水；
[0014] 所述步骤（2)中的种子培养基，每升组分如下：
[0015] 鹿糖10?12g，酵母粉5?7g，CaC03 1?1. 2g，水定容至1L，pH 7. 0 ;
[0016] 所述步骤（3)中的发酵培养基，
[0017] 鹿糖10?12g，酵母粉5?7g，CaC03 1?1. 2g，水定容至1L，pH 7. 0。
[0018] 上述假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212在发酵生产微生物胞外多糖絮凝剂中的 应用。
[0019] 上述应用，步骤如下：
[0020] 取上述发酵液，经离心，取上清，加入3?4倍体积的无水乙醇，搅拌后，静置过夜， 收集沉淀，用体积百分比为80 %的乙醇洗涤沉淀，烘干至恒重，制得微生物胞外多糖絮凝 剂。
[0021] 根据本发明优选的，所述的离心，条件为：8000rpm冷冻离心20min。
[0022] 根据本发明优选的，所述的烘干，温度为60°C。
[0023] 制得的微生物胞外多糖絮凝剂，是由菌株经好氧发酵分泌到胞外产生的一种微生 物多糖，其只由一种单体葡萄糖构成且其间不存在α键，所以此假单胞菌QL212所产的胞 外多糖是β -葡萄糖，胞外多糖经过冷冻干燥后呈白色粉末状，能溶于水，多角度激光散射 测得的分子量为618KDa。经检测，发酵液的絮凝剂产量为5. 92g/L。
[0024] 上述微生物胞外多糖絮凝剂在液体絮凝和/或脱色处理中的应用。
[0025] 根据本发明优选的，所述液体为：高岭土悬液、黄河水、印染污水或果汁。
[0026] 有益效果
[0027] 1、本发明所述的假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212,合成的凝胶多糖为胞 外多糖，经发酵条件优化，凝胶多糖产量可达5. 94g/L，产量高于现有已知的假单胞菌 (Pseudomonas sp.)凝胶多糖的最高产量；
[0028] 2、本发明制得的凝胶多糖为胞外多糖，对高岭土悬液、黄河水、印染污水及果汁等 液体絮凝效果良好；此外，本发明所述的凝胶多糖具有较好水溶性，且凝胶多糖不存在使用 的安全性问题，适宜在水处理中使用；
[0029] 3、本发明制得的凝胶多糖为胞外多糖，处理模拟废水或者实际的工业废水时，均 具有较高的悬浊悬浮颗粒絮凝活性、染料色素脱色活性；在生活、工业等废水处理方面极具 潜在用途，尤其在污水的预处理过程中可以极大简化后续处理步骤、降低后续处理成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1微生物胞外多糖絮凝剂处理高岭土悬液前后的对照照片；
[0031] 图2微生物胞外多糖絮凝剂处理黄河水前后的对照照片；
[0032] 图3微生物胞外多糖絮凝剂处理印染污水前后的对照照片；
[0033] 图4微生物胞外多糖絮凝剂处理果汁前后的对照照片；
[0034] 图5实施例5采用红外光谱检测纯化的微生物胞外多糖絮凝剂的检测结果图；
[0035] 图6实施例5采用多角度激光散射检测纯化的微生物胞外多糖絮凝剂的检测结果 图；
[0036] 其中：横坐标为时间，纵坐标为相对比例（relative scale)。
[0037] 图7实施例5采用电镜检测纯化的微生物胞外多糖絮凝剂的检测结果图；
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围并不仅 限于此。
[0039] 实施例1
[0040] 本发明提供的菌株假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212,从济南大学逸夫科技楼附 近潮湿空地采集土样，采用平板划线法和苯胺蓝特异性染色法对菌株进行分离，经鉴定具 有产生物多糖絮凝剂的性能。
[0041] 所述胞外多糖菌株为一种假单胞菌，其16S rDNA测序结果如SEQ ID NO. 1所示。 测序得到的碱基数为1209 bp。
[0042] 本发明提供的菌株在含1 %蔗糖、0.5%酵母粉、1.6%琼脂的固体培养基上30°C 培养24h后其菌落边缘光滑整齐，表面湿润，乳白色不透明。
[0043] 将上述假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212, 2014年9月12日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院 微生物研究所，保藏编号：CGMCC N0. 9651。
[0044] 实施例2
[0045] 上述假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212的培养方法，步骤如下：
[0046] (1)将假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212接种于固体斜面培养基上，在30°C活化 培养24h，制得活化菌体；
[0047] (2)将步骤（1)制得的活化菌体接种于种子培养基中，在30°C、200rpm条件下培养 20?28h，制得种子液；
[0048] (3)将步骤（2)制得的种子液按体积百分比10%的比例接种至发酵培养基中，在 30°C、200rpm条件下发酵培养6天，即得发酵液；
[0049] 所述步骤（1)中的固体斜面培养基，组分如下，均为重量百分比：
[0050] 1 %蔗糖、0· 5%酵母粉、1. 6%琼脂、余量水，pH 7. 0 ;
[0051] 所述步骤（2)中的种子培养基，每升组分如下：
[0052] 鹿糖 l〇g，酵母粉 5g，CaC03 lg，水定容至 1L，pH 7. 0 ;
[0053] 所述步骤（3)中的发酵培养基，
[0054] 鹿糖 10g，酵母粉 5g，CaC03 lg，水定容至 1L，pH 7. 0。
[0055] 实施例3
[0056] 取实施例2制得的发酵液，经8000rpm冷冻离心20min，取上清，加入3倍体积的无 水乙醇，搅拌均匀后，静置过夜，收集沉淀，用体积百分比为80%的乙醇洗涤沉淀，60°C烘干 至恒重，制得微生物胞外多糖絮凝剂。
[0057] 经检测，每升发酵液可获得微生物胞外多糖絮凝剂（干重）5. 92g。
[0058] 实施例4
[0059] 胞外多糖絮凝剂的提取纯化制备工艺
[0060] 取实施例2制得的发酵液1L，8000rpm冷冻离心20min，取上清；上清液与Sevag试 剂（氯仿、正丁醇按体积比为5 : 1的混合液）以5:1的体积比混合，磁力搅拌30?60min 后，9600rpm离心30min，小心取出分界面上层清液，重复此操作8?10次，直至分界面处无 沉淀为止，向制得的上层清液中加入3L无水乙醇，搅拌30分钟，4°C恒温过夜，制得脱蛋白 的凝胶多糖；
[0061] 将脱蛋白的凝胶多糖溶于适量三蒸水中，装于透析袋内用三蒸水透析36h，每8h 更换一次三蒸水，用硫酸一苯酚法测定透析液中有无糖存在，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥得 凝胶多糖，将凝胶多糖溶于三蒸水中，冷冻离心，取上清液备用；
[0062] CM-Sephrose Fast Flow :层析柱（1 X 2〇cm)，填料为 CM-Sepharose Fast Flow，上 样前〇D49(l = 1. 655,上样量2mL，流速为0. 15mL/min，1. 5mL/管分部收集，先用蒸馏水冲洗 两个柱体积，再用〇?lmol/L的NaCl梯度洗脱两个柱体积，测定每管收集液的含糖量。收 集峰尖位置的组分，制得初纯化凝胶多糖。
[0063] Sephacryl S-500凝胶过滤层析：将离子交换层析后的初纯化凝胶多糖在三蒸 水中透析除盐24h，真空冷冻干燥使其浓缩，层析柱（(plxlOO cm)，填充料为Sephacryl S-500,上样量800 μ L，流速0. lmL/min，1. 5mL/管分部收集，测定每管收集液的含糖量。收 集洗脱液中的含糖量高的活性峰组分，制得纯化后的凝胶多糖溶液。
[0064] 将纯化后的凝胶多糖溶液在SOOOrpm冷冻离心20min，取沉淀，经真空干燥，制得 纯化的微生物胞外多糖絮凝剂。
[0065] 实施例5
[0066] 絮凝剂理化性质分析
[0067] 1、絮凝剂的薄层层析：
[0068] 样品处理：取20mg实施例4制得的纯化的微生物胞外多糖絮凝剂加4mL lmol/L 硫酸溶液，10(TC水解2h后加碳酸钙中和至无气泡，离心，取上清液，真空冷冻干燥使其浓 缩10倍备用；
[0069] 展层剂：正丁醇：乙醇：水的体积比为5:3:2
[0070] 点样：点样间隔至少1cm,点样量1 μ L,展层约30min ;
[0071] 晾干后，喷雾（2〇Wt%硫酸+0. 5wt%苔黑酚），喷雾不宜过多，喷遍即可，后用吹风 机吹干层析板。
[0072] 2、絮凝剂的红外光谱分析：将凝胶多糖样品充分干燥，取一定量的凝胶多糖与 KBr混匀压片，用傅里叶红外光谱仪对其红外吸收光谱进行测定，检测结果如图5所示。该 红外光谱显示：在36000^1?32000^ 1出现一种-0H伸缩振动的宽峰，这是糖类物质共有 的特征；在890CHT1处有β键的特质吸收峰，在840(31^ 1处没有吸收峰，说明凝胶多糖不存 在α键，因此假单胞菌QL212所产的胞外多糖是β-葡聚糖。
[0073] 3、絮凝剂的分子量测定：利用多角度激光光散射仪对样品凝胶多糖的重均分子量 Mw进行测定。用流动相将样品配制成浓度为2. 5mg/mL的溶液，并通过0. 22 μ m的微孔滤膜 对其进行过滤。样品浓度、样品在不同角度的光散射强度通过示差检测器和激光检测器分 别记录，利用处理软件对数据进行计算，从而获得样品的重均分子量Mw ;检测结果如图6所 示；由该结果可以得出，假单胞菌QL212所产的胞外多糖重均分子量为618KDa。
[0074] 4、絮凝剂的电镜分析：将纯化后的凝胶多糖样品充分干燥，取一定量进行SEM扫 描电镜观察，检测结果如图7所示。
[0075] 实施例6
[0076] 微生物胞外多糖絮凝剂在液体絮凝和/或脱色处理中的应用，步骤如下：
[0077] 将90mL污水加入100mL量筒中，用6mol/L NaOH调节污水pH至10. 0,再加入质 量体积分数（g/mL)为1%的CaCl2 5mL及实施例3制得的微生物胞外多糖絮凝剂配制的质 量浓度为0.03%水溶液，轻轻摇匀lmin，静置5min，利用 722N型可见分光光度计在 550nm 处测80mL刻度处水样吸光度0D55(I，记为B。重复以上操作，用去离子水作对照代替发酵液， 〇D 55Q记为A。即絮凝活性=(A -B)/AX100%。
[0078] 结果：微生物胞外多糖絮凝剂配制的溶液对高岭土悬液、印染污水、黄河水、果汁 的絮凝率都达到90%以上。用可见分光光度计测高岭土悬液絮凝前在550nm处的吸光 度为0. 472,絮凝后为0. 011，絮凝率为97.67% ;用同样的方法测黄河水的絮凝前的吸光 度为0.556,絮凝后为0.033,絮凝率为94. 17% ;印染水絮凝前的吸光度为1. 175,絮凝 后为0.072,絮凝率为93.87% ;果汁絮凝前的吸光度为1.08,絮凝后为0.065,絮凝率为 93. 98%，结果如表1和图1?4所示。
[0079] 表1凝胶多糖对污水的絮凝效果
[0080]
【权利要求】
1. 一株假单胞菌（Pseudomonas sp.)QL212, 2014年9月12日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，保藏编号：CGMCC NO. 9651。
2. 权利要求1所述的假单胞菌（Pseudomonas sp.)QL212的培养方法，其特征在于，步 骤如下： (1) 将假单胞菌（Pseudomonas sp. )QL212接种于固体斜面培养基上，在28?32°C活 化培养20?28h，制得活化菌体； (2) 将步骤（1)制得的活化菌体接种于种子培养基中，在28?32°C、150?300rpm条 件下培养20?28h，制得种子液； (3) 将步骤（2)制得的种子液按体积百分比8?12%的比例接种至发酵培养基中，在 在28?32°C、150?300rpm条件下发酵培养5?8天，即得发酵液； 所述步骤（1)中的固体斜面培养基，组分如下，均为重量百分比： 1?1. 2%蔗糖、0. 5?0. 7%酵母粉、1. 5?1. 6%琼脂、余量水； 所述步骤（2)中的种子培养基，每升组分如下： 蔗糖10?12g，酵母粉5?7g，CaC03l?1. 2g，水定容至1L，ρΗ7· 0 ; 所述步骤（3)中的发酵培养基， 蔗糖10?12g，酵母粉5?7g，CaC03l?1. 2g，水定容至1L，ρΗ7· 0。
3. 权利要求1所述假单胞菌（Pseudomonas sp.)QL212在发酵生产微生物胞外多糖絮 凝剂中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下： 取上述发酵液，经离心，取上清，加入3?4倍体积的无水乙醇，搅拌后，静置过夜，收集 沉淀，用体积百分比为80%的乙醇洗涤沉淀，烘干至恒重，制得微生物胞外多糖絮凝剂。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的离心，条件为：8000rpm冷冻离心 20min〇
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的烘干，温度为60°C。
7. 权利要求3所述微生物胞外多糖絮凝剂在液体絮凝和/或脱色处理中的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述液体为：高岭土悬液、黄河水、印染污水 或果汁。
【文档编号】C02F1/56GK104232548SQ201410509328
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】李强, 李玉梅, 杨敏, 曲衍洪, 宋冬雪, 郝大魁, 胡志恒, 王艺伟 申请人:济南大学