一种耐重金属根瘤菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐重金属根瘤菌，所述的根瘤菌为根瘤菌HZ76，所述的根瘤菌应用于促进植物修复重金属污染土壤。其中根瘤菌HZ76菌株的有效菌数为(108～109)CFU/mL。所述的植物修复重金属污染土壤所采用的植物为刺槐。所述的重金属污染土壤中的重金属包括Cu、Zn、Pb和Cd中的一种或多种。本发明所述的HZ76菌株能产吲哚乙酸，有助于促进植物生长。具有ACC脱氨酶基因，nod、nif基因，有助于提高植物的结瘤率和含氮量。产铁载体，有助于提高植物抗逆性。利用植物促生细菌促进植物生长，提高植物重金属Zn、Pb、Cu含量，强化植物提取修复效率。
【专利说明】一种耐重金属根瘤菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业和环境污染治理领域，涉及根瘤菌，具体涉及一种耐重金属根瘤 菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 重金属在土壤中残留时间长，危害作用大，且容易经作物吸收后进入食物链进而 危害人类健康。因此，随着土壤重金属污染问题在全球范围内加剧，如何经济、高效的控制 并治理土壤污染成为国内外很多相关领域关注的焦点。植物修复由于其成本低、简便易行、 安全可靠、环境友好等诸多优点，近年来已成为修复重金属污染环境的重要手段。然而，由 于矿区废弃地存在的诸多限制因素，如土壤贫瘠、残留重金属浓度较高、极端酸性、大量营 养元素的极度缺乏等，导致绝大所数矿山废弃地缺乏自然植被生长。
[0003] 根瘤菌是一类固氮微生物，对土壤氮循环有着重要的作用，而豆科植物不仅可以 与根瘤菌共生固氮，从而克服矿区废弃地土壤贫瘠、营养元素缺乏带来的障碍，而且其还有 利于防治矿区废弃地风蚀及水蚀造成水土流失。此外，越来越多的研宄报道发现，许多抗重 金属的根瘤菌除了具有固氮作用外，还具有其它促进植物生长的能力，如分泌植物生长素 IAA、ACC脱氨酶及产生铁载体等。因此，利用豆科植物-根瘤菌共生体系提高植物的修复 效率，将是一种行之有效、环境友好的修复手段。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种耐重金属根瘤菌，用于促 进植物修复重金属污染，使得重金属污染能够尽快去除。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
[0006] 一种耐重金属根瘤菌，所述的耐重金属根瘤菌为根瘤菌HZ76,分类命名为 Mesorhizobium sp.HZ76,保藏编号为：CCTCC NO :M 2014667。
[0007] 所述的根瘤菌HZ76具有ACC脱氨酶基因。
[0008] 如上所述的耐重金属根瘤菌用于与植物共生修复重金属污染的应用。
[0009] 如上所述的耐重金属根瘤菌用于促进植物生长的应用。
[0010] 如上所述的耐重金属根瘤菌用于产ACC脱氨酶基因的应用。
[0011] 如上所述的耐重金属根瘤菌用于提高植物抗逆性的应用。
[0012] 优选的，所述的根瘤菌配制成液体制剂，其中根瘤菌HZ76菌株的有效菌数为 (108?10 9)CFU/mL〇
[0013] 优选的，所述的重金属污染中的重金属包括Cu、Zn、Pb和Cd中的一种或多种。
[0014] 更优选的，所述的Cu的浓度不高于I. 4mM，所述的Zn的浓度不高于2. 6mM，所述的 Cu的浓度不高于3. OmM，所述的Cu的浓度不高于0. 5mM。
[0015] 优选的，所述的植物修复重金属污染所采用的植物为豆科植物，所述的豆科植物 为草本豆科植物中的苜蓿、含羞草或苕子，所述的豆科植物或者为木本豆科植物中的刺槐、 多花胡枝子或狼牙刺。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0017] 本发明所述的植物内生细菌HZ76菌株能耐受多种重金属，重金属Cu、Zn、Pb、Cc^9 最小抑制浓度分别为，I. 4mM、2. 6mM、3. 0mM、0. 5mM。
[0018] 本发明所述的HZ76菌株能产吲哚乙酸，有助于促进植物生长。具有ACC脱氨酶基 因，nod、nif基因，有助于提尚植物的结瘤率和含氣量。广铁载体，有助于提尚植物抗逆性 (抗旱、抗涝、抗盐碱、抗病虫害）。
[0019] 利用植物促生细菌促进植物生长，提高植物重金属Zn、Pb、Cu含量，强化植物提取 修复效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是不同重金属处理下刺槐地上部和地下部干重（g/盆）。
[0021] 图2是不同重金属处理下接种根瘤菌HZ76后刺槐结瘤数目（g/plant)。
[0022] 以下结合附图对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
【具体实施方式】
[0023] 需要说明的是本发明涉及的根瘤菌HZ76,分类命名为Mesorhizobium sp. HZ76,该 根瘤菌的菌种于2014年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，并登记 入册，该生物菌种于2014年12月26日起保存30年。根瘤菌HZ76保藏号为：CCTCC NO :M 2014667〇
[0024] 本发明的根瘤菌的分离鉴定方法如下：
[0025] 根瘤菌ΗΖ76为植物内生菌，是从中国陕西省某铅锌冶炼厂区生长的刺槐 (Robinia pseudoacacia)根瘤中分离得到，经鉴定为Mesorhizobium sp·。主要生物学特 性为：G-，幼龄时菌体为杆状，无芽孢。在YMA培养基上生长良好，单个菌落为圆形，边缘整 齐，直径1?2mm，呈透明状。
[0026] 选取个大、饱满的根瘤，用剪刀将其剪下（带部分根），将根瘤放在亲水中浸泡 4?5min，洗去杂质，再用95%乙醇浸泡5min后用0. 1%的取012表面灭菌5min，然后用无 菌水冲洗10次。在无菌操作的情况下，将单个根瘤菌夹破后在YM平板（甘露醇10. 0g， MgSO4 · 7H20 0· 2g，K2HPO4O. 25g，KH2PO4O. 25g，NaCl 0· lg，酵母粉 3. 0g，蒸馏水 lOOOmL，琼脂 18?20g)上划线，在28°C培养箱中培养3?5d，挑取单菌落在YMA平板上划线纯化后保 存。
[0027] 将菌株接种到5mLTY培养液（酵母粉5. 0g，胰蛋白胨3g，CaCl2O. 7g，蒸馏水 IOOOmL)中，28 °C、150rpm/min 震荡 48h，8000rpm/min 离心，每次 5min，收集菌体于 I. 5mL Eppendorf管中，按照CTAB法提取细菌总DNA，PCR扩增细菌的16S rDNA，扩增产物经测序 后与GenBank中已知16S rDNA序列进行比对分析，与Mesorhizobium Ioti的16S rDNA序 列相似性达到99. 77%，将其鉴定为这个属。
[0028] 根瘤菌HZ76的16S序列：
[0029] GCGCGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAACAACTCCGGGAAACT GGAGCTAATACCGTATACGTCCTTTTGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGG TGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGT GATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAACGGTGAAGATAATGACGGTAACCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAAC TTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGG ATACTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTCGAGTCCGGAAGA GGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGG TCCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA TGGAAGCTAGCCGTTGGCAAGTTTACTTGTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTTCCCGCCTGGGGAGTACGGTC GCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG CAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGGTCGCGGTTTCCAGAGATGGATACCTTCAGTTCGGCTGGACCGGTGACA GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTA GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTC CTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGC TAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCG GATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCG AAGGCGCTGTo
[0030] 以下给出本发明的根瘤菌HZ76的一些性能研宄结果：
[0031] 实验1 :重金属离子对根瘤菌HZ76的抑制浓度
[0032] 将根瘤菌HZ76菌株划线接种于含不同重金属浓度的YM培养基，28°C培养3? 5d，观察其能否生长及生长情况。结果见表1。HZ76菌株能耐受多种重金属（Cu、Zn、Pb、Cd 的最小抑制浓度分别为I. 4、2. 6、3. 0、0. 5mM)。
[0033] 表1菌株在含不同重金属浓度的YMA培养基上的生长情况
[0034]
【权利要求】
1. 一种耐重金属根瘤菌，其特征在于：所述的耐重金属根瘤菌为根瘤菌HZ76,分类命 名为 Mesorhizobium sp.HZ76,保藏编号为：CCTCC NO :M 2014667。
2. 如权利要求1所述的耐重金属根瘤菌，其特征在于：所述的根瘤菌HZ76具有ACC脱 氨酶基因。
3. 权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于与植物共生修复重金属污染的应用。
4. 权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于促进植物生长的应用。
5. 权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于产ACC脱氨酶基因的应用。
6. 权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于提高植物抗逆性的应用。
7. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的根瘤菌配制成液体制剂，其中根瘤菌 HZ76菌株的有效菌数为（108?109)CFU/mL。
8. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的重金属污染中的重金属包括Cu、Zn、 Pb和Cd中的一种或多种。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的Cu的浓度不高于1. 4mM，所述的Zn 的浓度不高于2. 6mM，所述的Cu的浓度不高于3. OmM，所述的Cu的浓度不高于0. 5mM。
10. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的植物修复重金属污染所采用的植物 为豆科植物，所述的豆科植物为草本豆科植物中的苜蓿、含羞草或苕子，所述的豆科植物或 者为木本豆科植物中的刺槐、多花胡枝子或狼牙刺。
【文档编号】B09C1/00GK104498410SQ201410850236
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】林雁冰, 樊妙春, 赵亮, 韦革宏 申请人:西北农林科技大学