一种用于修复底泥污染的高地芽孢杆菌的制备方法及应用与流程

本发明属于水环境保护的应用领域，具体涉及一种高地芽孢杆菌扩大培养的方法；最为重要的是涉及一种高地芽孢杆菌在修复污染底泥中的应用。本发明可广泛应用于池塘、湖泊、河流等污染底泥的修复。

背景技术：

近年来，随着环境污染问题的日趋严重，越来越多的湖泊等淡水水体富营养化进程加快，其中污染底泥成为重要的内源污染来源，人们对湖泊、河流、池塘等水体内的污染底泥修复问题越来越关注。

外源污染的大量输入；大气降尘和地表径流等增加，导致水体底泥厚度增加，污染程度加剧，污染底泥已成为水体污染的重要来源。进入水体的营养物质沉降至底质表层，在一定的条件下，沉积物中的污染物不断向水体释放，成为水体富营养化的主导因子。即使在外源污染得到有效控制的情况下，湖泊仍会长期处于富营养化状态，可见，作为以底泥为代表的内源污染治理十分重要。在底泥治理方面，先后发展了清淤、遮盖、原位钝化、植物修复等多种手段，取得了一定的效果，其中底泥的生物修复技术已被国内外许多学者认定是未来底泥污染修复的主要方向。

微生物修复是目前研究较多的一种生物修复技术，是在有氧或无氧条件下将氮磷等污染物分解的一种方式，其在水环境修复中具有重要作用，具有较好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种高地芽孢杆菌的扩大培养方法，该培养方法步骤简单，操作方便。

本发明的再一个目的在于提供了一种高地芽孢杆菌在修复污染底泥中的应用，该高地芽孢杆菌对不同理化性质和不同温度下的污染底泥中总磷的修复都能达到一定的效果，且使用时不会产生二次污染，可实现底泥修复和经济环保的双赢，尤其是在在温度45℃情况下，对池塘底泥中的总磷降解率可达到15.77%，在温度为35℃情况下，对湖泊底泥中的总磷修复率可达到15.62%。

为实现上述目的，本发明采用如下技术措施：

一种高地芽孢杆菌（bacillusaltitudinis）的扩大培养方法，其步骤是：

1）培养基的配置：

液体培养基的配制方法：分别称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g，加去离子水至1000ml。

固体培养基的配制方法：分别称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂粉15g，加去离子水至1000ml。

2）菌种扩大培养：中国微生物菌种中心购买的高地芽孢杆菌菌种，放置于经高压灭菌锅121℃20分钟后冷却至室温的内有3ml培养液的10ml试管，然后将装有菌种的试管置于37℃恒温箱培养，24小时后，将试管中的菌液用无菌1ml移液枪再接种于液体培养基100ml的无菌三角瓶中，依次进行扩大培养。通过平板菌落计数法配制不同梯度的细菌浓度。

结果发现，该菌株具有易培养，繁殖快，易保存，对环境的适应性强，活性稳定等特点。

一种高地芽孢杆菌在污染底泥修复中的应用，其步骤是：

1）底泥样品选自具有3年养殖龄的养殖池塘，采集池塘底泥表层4－6cm厚度的底泥，将底泥带回实验室，充分混匀。

2）实验组分2个处理，分别为高地芽孢杆菌修复组和空白对照组，每组设置三个重复。

3）选取水族箱作为实验装置，水族箱高23－28cm，先将混匀后底泥铺装在水族箱底部4－6cm厚，然后投加一定浓度的高地芽孢杆菌混匀后的底泥1－3cm；用东湖水作为上覆水，水深控制在13－15cm；为防止试验时水分的蒸发，不定期用超纯水补足上覆水减少量。

4）在实验第35天时，按照五点取样法，选取水族箱底部上层1－3cm的表层底泥，放置在实验室自然风干，用200目筛子过筛，采用常规分析方法测定底泥总磷的含量。

30℃时，浓度为2.23×10¹²cfu/m³的菌液150ml的菌液作为最适浓度对底泥总磷含量降低率为15.42%，和没有添加高地芽孢杆菌的空白对照相比，高地芽孢杆菌修复组的水族箱底泥总磷的修复率达到26.19%。

我国水环境中的磷污染严重，到目前为止尚未得到有效的治理。本研究从土壤中筛选纯化的高地芽孢杆菌，通过应用于污染底泥的修复，结果表明对底泥中总磷的修复具有较好的效果。

与现有除磷微生物相比，高地芽孢杆菌属于一种新的除磷微生物。现有技术在修复底泥中对总磷的修复一般是化学技术和物理技术，物理技术较为繁琐，化学技术可能产生二次污染。本申请的技术方案既解决了物理技术的繁琐又解决了二次污染的问题，更大优势是在解决以上两个问题的基础上，还达到了对底泥的修复和水污染的治理效果。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点：

1）高地芽孢杆菌的扩大培养技术步骤简单，操作方便，相对于其他类型益生菌，具有对营养要求简单，生长繁殖快，代谢速度快、周期短，而且易于分离、培养和保藏，耐热性强等优点；

2）30℃时，对底泥中总磷的修复具有良好的性能，与空白对照相比，对总磷降解可达到26.19%，同时对上覆水无负面影响；

3）投入使用时不会产生二次污染，可实现底泥修复和经济环保的双赢。

附图说明

图1为一种高地芽孢杆菌不同菌剂量在30℃时对底泥和上覆水总磷的修复效果图；

图2为一种高地芽孢杆菌不同菌剂量在45℃时对底泥总磷和上覆水的修复对比图；

图3为一种150ml，2.23×10¹²cfu/m³高地芽孢杆菌菌剂组在35℃对池塘底泥和上覆水中总磷的修复效果图。

图4为一种150ml，2.23×10¹²cfu/m³高地芽孢杆菌菌剂组在35℃对东湖底泥和上覆水的修复效果图；

图5为一种150ml，2.23×10¹²cfu/m³高地芽孢杆菌菌剂组在38℃对池塘底泥和上覆水中总磷的修复效果图。

图1：在平均温度为30℃的情况下，不同浓度高地芽杆菌对底泥的总磷修复效果都较为明显，其中150ml，2.23×10¹²cfu/m³的效果最为明显，表明修复底泥的细菌浓度需要选择一个合适浓度，浓度过高和过低对修复底泥的效果都产生一定的影响。

图2：在平均温度为45℃时，其修复效果比图1中的底泥修复效果差。说明高地芽孢杆菌的最适温度是30℃，温度过高会影响修复效果。

图3：在平均温度为35℃时，实验周期为35天，150ml，2.23×10¹²cfu/m³高地芽孢杆菌菌剂对池塘底泥具有明显的修复效果：与0天的初始值相比，对照组ck和菌剂组对池塘底泥中的总磷降解率分别为2.73%和3.56%；与ck组相比，菌剂组对底泥的总磷的修复率为30.40%；在降解底泥总磷的过程中，对上覆水中的磷无明显影响。

图4：在平均温度为35℃时，实验周期为35天，150ml，2.23×10¹²cfu/m³高地芽孢杆菌菌剂对东湖底泥中总磷具有明显的修复效果：与0天的初始值相比，对照组ck和菌剂组对东湖底泥的总磷降解率为19.66%和22.73%；与ck组相比，菌剂组对东湖底泥总磷的修复率达到15.62%，对东湖上覆水没有明显影响。

图5：在平均温度为38℃时，实验周期为35天，150ml，2.23×10¹²cfu/m³高地芽孢杆菌菌剂对池塘底泥中总磷具有明显的修复效果：与0天相比，对照组ck和菌剂组对池塘底泥中的总磷降解率分别为1.30%和1.53%；与ck组相比，菌剂组对底泥的总磷的净修复率为17.69%。在降解底泥总磷的过程中，对上覆水中的磷无明显影响。

具体实施方式

以下实施例中所使用的高地芽孢杆菌，购买于中国科学院微生物研究所，该菌的编号为：cgmcc1.8639。

实施例1：

高地芽孢杆菌的扩大培养制备方法，其步骤是：

1）培养基的配置：

液体培养基配制方法：分别称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g，加去离子水至1000ml。

固体培养基配制方法：分别称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g，琼脂粉15g，加去离子水至1000ml

2）菌种扩大培养：中国微生物菌种中心购买的高地芽孢杆菌菌种，放置于经过压灭菌锅121℃20分钟后冷却至室温的内有3ml培养液的10ml试管，然后将装有菌种的试管置于37℃恒温培养箱，24小时后，将试管中的菌液用无菌1ml移液枪再接种于液体培养基100ml的无菌三角瓶中。依次扩大培养到500ml菌液。

3）通过微生物平板计数法测出细菌的浓度。

该扩大培养方法步骤简单、操作方便。

实施例2：

一种高地芽孢杆菌在修复污染底泥中的应用，其步骤为：

1）底泥样品选自具有3年养殖龄的养殖池塘，采集池塘底泥表层5cm厚度的底泥，将底泥取回实验室，进行充分混匀。

2）实验组分2个处理，分别为高地芽孢杆菌修复组和空白对照组（简称ck），每组设置三个重复。

3）选取水族箱作为实验装置，水族箱高25cm，先将底泥混匀铺装在水族箱底部5cm厚，然后投加一定浓度高地芽孢杆菌混匀后的底泥2cm；用东湖水作为上覆水，水深14cm；为防止试验时水分的蒸发，不定期用超纯水补足上覆水减少量。

4）在实验第35天时，按照五点取样法，选取水族箱底部上层2cm的表层底泥，放置在实验室自然风干，用200目筛子过筛，采用常规分析方法（j.j.gonzalezmedeiros.b.perezcidande.fernandezgomez,analyticalphosphorusfractionationinsewagesludgeandsedimentsamples，analbioanalchem,2005,381:873–878）测定底泥全磷的含量。

步骤3）所述的一定浓度高地芽孢杆菌是指，在平均温度为30℃的条件下，将接种高地芽孢杆菌的纯菌种配制成5个不同梯度菌剂量，分别为7.44×10¹¹cfu/m³的菌液50ml、1.48×10¹²cfu/m³的菌液100ml、2.23×10¹²cfu/m³的菌液150ml、2.97×10¹²cfu/m³的菌液200ml、3.72×10¹²cfu/m³的菌液250ml。

如图1所示，底泥中的ck、50ml、100ml、150ml、200ml和250ml6个处理组与各自初始值比较，底泥总磷含量降低率分别为12.22%、13.53%、14.51%、15.42%、14.97%、和13.92%。与ck空白对照组比较，浓度为2.23×10¹²cfu/m³的菌液150ml的菌液作为最适浓度对总磷的修复率为26.19%，修复效果最佳。表明并非菌液浓度越高对底泥的总磷的修复效果越好，也不是菌液浓度越低对总磷的修复效果越好，而是菌液剂量和浓度需要一个最适的浓度范围。

上覆水中的ck、50ml、100ml、150ml、200ml和250ml6个处理组中的只有200ml和250ml两个处理组对水体总磷含量对于水体无二次污染，因此，选择适宜浓度的细菌投入底泥可以兼顾底泥和上覆水均达到一定的修复效果。

所述的底泥总磷含量降低率=(35天的不同修复组总磷含量—0天总磷含量)/0天总磷含量，其中5个修复组和ck组有相同的初始值（投入实验之前的底泥样相同）。

所述的总磷的修复率=（5个不同修复组得到总磷含量降低率—ck组总磷含量降低率）/ck组总磷含量降低率。

水体和底泥作为一个水环境完整的体系，相同的菌剂量对于水体和底泥同时都有着一定的修复效果，对底泥修复的同时对上覆水并不存在不良的负面影响。可见利用微生物修复，底泥不会造成水环境外源的二次污染显而易见。

实施例3：

在平均温度为45℃的条件下，将实施例2中高地芽孢杆菌菌剂量投入到水族箱2cm底泥层。如图2所示，ck、50ml、100ml、150ml、200ml和250ml6个处理组与各自0天初始值比较，底泥总磷降低率分别为，13.57%、10.71%、13.57%、15.71%、5%和10.71%，与ck比较，在自然高温下，高地芽孢杆菌无论在高浓度或者低浓度，对底泥中的总磷修复效果不明显，只有在浓度为150ml，2.23×10¹²cfu/m³这个临界值浓度，对总磷的修复效果较为明显，修复率为15.77%。更重要的是，ck、50ml、100ml、150ml、200ml和250ml6个处理组对上覆水的总磷的修复效果，也只有浓度为150ml，2.23×10¹²cfu/m³对上覆水修复具有一定的效果，可见，高地芽孢杆菌只要在最合适的浓度下，即使是高温，对上覆水和底泥的修复尽管不明显，但是也不会给水环境带来二次污染，进一步证实了此菌具有一定程度的耐热性。

其它应用步骤与实施例2相同。

实施例4：

实施例2的步骤3）所述的一定浓度高地芽孢杆菌是指，在平均温度35℃的条件下，配制高地芽孢杆菌浓度为2.23×10¹²cfu/m³的菌液150ml，投加方式是：直接将菌剂均匀投撒到水族箱池塘底泥上层2cm。

如图3所示，试验周期为35天，与初始值相比，ck和菌剂处理组对池塘底泥中的总磷含量降低率分别为2.73%和3.56%；与ck组相比，菌剂处理组对底泥的总磷的修复率为30.40%。并且在降解底泥中总磷的过程中，对池塘底泥上覆水中的总磷含量无负面影响。

其它应用步骤与实施例2相同。

实施例5：

实施例2的步骤1）的底泥样品选自东湖，ph7.77。

实施例2的步骤3）所述的一定浓度高地芽孢杆菌是指，在平均温35℃的条件下，配制高地芽孢杆菌浓度为2.23×10¹²cfu/m³的菌液150ml，直接将菌剂均匀投撒到水族箱的东湖底泥上层2cm。

如图4所示，经过35天的实验，高地芽孢杆菌对东湖底泥中总磷具有明显的修复效果，与初始值相比，ck和该菌剂处理组对池塘底泥中的总磷含量降解率为19.66%和22.73%；与ck组相比，菌剂处理组对底泥的总磷的修复率为15.62%%。并且，在降解底泥中总磷的过程中，对东湖底泥上覆水无负面二次污染影响。

其它应用步骤与实施例2相同。

实施例4和实施例5表明：高地芽孢杆菌除了对池塘底泥的总磷具有一定的降解功能，对一般湖泊的底泥总磷和上覆水总磷的降解也具有修复效果。

实施例6

实施例2的步骤3）所述的一定浓度高地芽孢杆菌是指，分别在平均温度为38℃的条件下，配制高地芽孢杆菌浓度为2.23×10¹²cfu/m³的菌液150ml，投加方式是：直接将菌剂均匀投撒到水族箱池塘底泥上层2cm。

如图5所示，38℃时，试验周期为35天，与初始值相比，ck和菌剂处理组对池塘底泥中的总磷含量降低率分别为1.30%和1.53%；与ck组相比，菌剂处理组对底泥的总磷的修复率为17.69%。并且在降解底泥中总磷的过程中，对池塘底泥上覆水中的总磷含量均无负面影响。

其它应用步骤与实施例2相同。

实施例4和实施例6表明，高地芽孢杆菌在35℃和38℃对污染底泥均具有良好的修复效果。